生物催化提制废次烟草中烟碱的最佳工艺研究

重庆工商大学2010届毕业论文 生物催化提制废次烟草中烟碱的工艺研究

生物催化提制废次烟草中烟碱的最佳工艺研究

中文摘要：烟碱无论是在农业、医药、烟草行业还是在化工行业都有其重要作用。本文综述了废次烟叶成分和烟碱的主要用途，介绍了国内外烟碱提取的现有方法，通过不同菌种的筛选,优选出黄毛菌种作为发酵菌种;并通过对比不同发酵方法，确定采用生物酶化法发酵处理烟草废渣提取烟叶中高附加值成分烟碱。本实验主要探讨了发酵时间、发酵温度、菌种、微波及超声时间、接种量、固液比、以及pH值等因素对烟碱提取的影响，采用分光光度法测定烟碱含量，优化得出最佳工艺条件，并通过萃取、减压蒸馏获得烟碱粗品。实验结果表明：选用黄毛诱导菌为发酵菌种，在发酵时间为24h，发酵温度为30℃，接种量为10%，固液比为1：20，辅料比为4%，pH值为6.00，超声时间15min的条件下具有提制药草中烟碱的最佳效果,为废弃烟草资源化利用提供实验理论基础。 关键词：烟草 烟碱 发酵 工艺

Abstract: Nicotine, whether in agriculture, medicine, chemical industry or the tobacco industry has its own important role. In this paper, discard the major tobacco ingredients and nicotine use, introduced the current domestic and international nicotine extraction method, the screening of different strains, optimized Huangmaodoufuchai bacteria as fermentation bacteria; and by comparing the different fermentation determined by enzyme method fermented tobacco waste extract high value-added component of nicotine in tobacco leaves. This experiment focuses on the fermentation time, fermentation temperature, strain, microwave and ultrasonic time, inoculum size, solid-liquid ratio, and pH value on the extraction of nicotine, the nicotine content measured by spectrophotometry, is optimized optimal conditions, and by extraction, vacuum distillation of crude was nicotine. The results show that: use Herba induced bacteria strains for the fermentation, the fermentation time of 24h, the fermentation temperature is 30 ℃, inoculum 10%, the ratio of 1:20, accessories ratio 4%, pH value of 6.00 , under the conditions of ultrasonic time of 15min have put grass in the pharmaceutical nicotine best results.

Keywords: tobacco nicotine ferment technology

目录

1前言 .................................................................... 3

1.1本课题提出的背景 .................................................. 3

1.1.1烟草研究 ..................................................... 3 1.1.2烟草产业现状 ................................................. 4 1.1.3烟草主要成分 ................................................. 4

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1.2本课题研究的目的与意义 ............................................ 4

1.2.1废次烟草对生态环境的危害 ..................................... 4 1.2.2废次烟草的资源化利用 ......................................... 5 1.2.3低碳环保经济 ................................................. 7 1.2.4经济效益 ..................................................... 8 1.3烟碱的国内外研究现状 .............................................. 8

1.3.1烟碱的提取方法 ............................................... 8 1.3.2烟碱含量分析方法及优缺点 .................................... 11 1.4本课题的提出 ..................................................... 12 2 实验部分 .............................................................. 13

2.1烟碱的性质 ....................................................... 13 2.2实验原理 ......................................................... 14

2.2.2 生化酶促法发酵废次烟叶原理 ................................. 14 2.2.3紫外分光光度计法的原理 ...................................... 14 2.3 仪器与药品 ....................................................... 15

2.3.1 药品与试剂 ................................................. 15 2.3.2 主要实验仪器 ............................................... 15 2.4实验装置图 ....................................................... 16

2.4.1发酵装置图 .................................................. 16 2.4.2减压蒸馏装置图 .............................................. 17 2.5实验的工艺流程 ................................................... 17 2.6实验方法 ......................................................... 17

2.6.1烟碱标准曲线的绘制 .......................................... 17 2.6.2 废次烟草的发酵 ............................................. 18 2.6.3 烟碱的测定 ................................................. 18 2.6.4 计算公式 ................................................... 19 2.7 实验步骤 ......................................................... 19

2.7.1 溶液的配制 ................................................ 19 2.7.2 培养基的制作 ............................................... 20 2.7.3 菌种的培育 ................................................. 20 2.7.4菌种的诱导 .................................................. 20 2.7.5烟叶预处理 .................................................. 21 2.7.6烟叶的发酵 .................................................. 21 2.7.7烟碱含量分析 ................................................ 21 2.7.8烟碱的提取 .................................................. 21

3 实验结果与讨论 ........................................................ 21

3.1不同菌种对烟碱含量浸出的影响 ..................................... 21 3.2菌种诱导对烟碱含量的影响 ......................................... 23 3.3不同底物条件的影响 ............................................... 25

3.3.1探讨辅料比对烟碱含量的影响 .................................. 25 3.3.2探讨固液比对烟碱含量的影响 .................................. 26 3.4发酵工艺条件的影响 ............................................... 27

3.4.1探讨接种量对烟碱含量的影响 .................................. 27 3.4.2探讨PH值对烟碱含量的影响 ................................... 28

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3.5超声波对烟碱含量的影响 ........................................... 29 3.6重现最佳工艺条件实验 ............................................. 30

3.6.1烟碱的浸出 .................................................. 30 3.6.2最佳工艺条件实验下提取烟碱粗品 .............................. 31

4结论与展望 ............................................................. 32

4.1 结论 ............................................................. 32

4.1.1不同方法对比的实验结果 ...................................... 32 4.1.2单因素探讨的实验结果 ........................................ 32 4.1.3最佳工艺条件 ................................................ 32 4.2实验存在的不足 ................................................... 33

4.2.1取样的不均匀性 .............................................. 33 4.2.2萃取剂的挥发性 .............................................. 33 4.2.3仪器的不稳定性 .............................................. 33 4.3展望 ............................................................. 33

4.3.1实验展望 .................................................... 33 4.3.2应用前景展望 ................................................ 33 参考文献 ......................................................... 33 致谢 ............................................................. 36

1前言

1.1本课题提出的背景

1.1.1烟草研究

烟草是重要的经济作物，在世界经济及许多国家的国民经济中占有重要的地位。我国是世界上烟草生产和消费最大的国家，烟叶和卷烟产量均为世界第一，占世界总产量的l/3左右。但由于地域差异、气候条件、种植技术等因素，每年均有一定数量(约15％左右)的低等级烟叶无法被收购。随着卷烟市场对名特优烟叶产品的开发，卷烟生产中不可避免的产生一些下脚料，用之不能，弃之可惜，这无疑加大了烟农和企业的负担。其实废次烟叶是一个宝贵的物质资源。经研究，烟叶中已鉴定出含有三千种天然化学物质，包括生物碱、蛋白质、氨基酸、糖类、有机酸(L苹果酸、柠檬酸、油酸、肉桂酸等40多种)等物质。废次烟叶来源集中，便于工业集中处理利用，早在60年代国外一些国家相继开展了这方面的研究工作，而我国90年代才刚刚起步，多为国外早期生产工艺的翻版，提取物质均为单一产品，未进行综合提取利用。

烟碱是烟叶中的有效成分，烟碱主要应用于医药、绿色农药和烟草工业上，市场上对天然烟碱的需求正与日俱增。

现有的关于提取烟碱的大都是提取其中的单一成分，提取烟碱后的烟渣中含有大量的其他有效成分，随意排放不但浪费资源还污染环境；而烟碱在烟叶中含量相对较高，

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如果能够从废次烟叶中提取烟碱的同时进一步提取其中的其他有效物质，这样既可以降低烟碱的生产成本，提高经济效益，还实现了废次烟叶的综合利用。

1.1.2烟草产业现状

就其行业在国民经济中的地位而言，烟草已连续十余年是全国第一税利大户，其税利占国家财政收入的10％以上。我国不少县、市乃至省25％～70％的财政收入依靠“两烟”(烟叶和卷烟)税收?。烟草行业为国家经济发展做出了极大贡献，但近年来，却陷入了进难两难的窘迫。随着烟草植物学、烟气化学及环境工程的发展，吸烟与反烟的论战此起彼伏，来自媒体、环保人士、健康专家等的攻击持久不断，烟草业受到重创。烟草的生产、消费和研究都发生了较大的转变。从哥伦布首次发现烟草至今的500余年来，烟产品的使用，尤其是吸烟，一直是争议的焦点。当今烟草行业正面临历史的抉择，欧美等一些发达国家的烟草业迫于禁烟运动的压力，已走到了“十字路口”，向左走，向右走?随着1997年吸烟与健康大会在北京召开，中国烟草业也面临前所未有的压力和威胁，烟草行业似乎已是“四面楚歌”。烟草业的未来是什么?这一问题引起了较多的忧虑与思考。国际烟草科学界知名人士、曾长期担任美国农业部烟草研究室负责人的左天觉博士在他的一篇文章里曾这样写到：“如果我们能通过回顾过去而预知未来的话，我会说，烟草是永恒的。”m。这样的预测决不是无视吸烟对健康的影响，或是过分重视烟草产品能带来高额税收，而是基于烟草的利用前景将会更大更广这一原因。

1.1.3烟草主要成分

烟草中的成分很复杂，经研究烟叶中已鉴定出含有3000多种天然化学物质，包括生物碱、蛋白质、氨基酸、糖类、有机酸(L-苹果酸、柠檬酸、油酸、肉桂酸等40多种)等物质。按它们的元素组成状况主要分为六大类：碳水化合物，有机酸，含氮化合物，多酚物和苷，树脂、脂肪和挥发油，灰分元素嗍．烟草在不同的生长期，植株的不同部位，以及加工过程中的不同阶段，烟草里各种成分的含量也不完全相同。一般干的烟草中含碳水化合物约50％，有机酸类约12％，含氮化合物约11％，树脂、多酚和脂肪等约15％，灰分元素约13％。

1.2本课题研究的目的与意义

1.2.1废次烟草对生态环境的危害

（1）烟草种植和加工过程对生态环境的影响。

种植烟草对生态环境的破坏，使得日益恶化的生态环境雪上加霜。2005年我国烟草

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种植面积为111.6万公顷，加工这些烟草需要消耗334.8万公顷的木材。随着烟草的种植和加工，将有更多的土壤板结，会砍伐更多的树木，这将造成严重的水土流失。

（2）卷烟制造过程对环境的污染。

我国每年卷烟纸消耗约为10万吨左右，而每生产1吨纸制品要用20棵大树，这样算来我国每年生产卷烟纸需要消耗200万棵大树。同时造纸业又是高污染、高耗能的产业，每年生产10万吨卷烟纸会产生642.4万吨的污水，排放COD（主要污染物化学需氧量）0.3万吨，耗水量1000万吨，综合耗能达15万吨标煤（吨纸耗水量为100吨；综合耗能为1.5吨标煤）。

（3）吸烟产生的不可降解垃圾

吸烟后产生的烟蒂是不可降解的，将会对环境产生严重的影响。每个烟蒂的体积约为0.49立方厘米，据2005年我国卷烟消费量为19328亿支计算，将会产生94.7万立方米的不可降解烟蒂垃圾。

1.2.2废次烟草的资源化利用

通过工艺提取烟叶中的烟碱成分，烟叶中还含有茄尼醇、氨基酸、蛋白质、糖类、有机酸等多种物质，如果能通过对这些成分的理化性质的分析，研究出一套完整可行的工艺，将这些成分别提取出来，并将其应用到各个领域，将会大幅度提高废次烟叶的经济价值，减轻烟农的负担，为我们建设集约型社会添砖增瓦。最后烟渣无任何有机溶剂残留，经处理后可作为农作物有机肥料，不会造成环境的污染，真正实现了废次烟叶的综合利用。

(1)烟碱的应用 ①农业

在农业上，烟碱系列农药属植物杀虫剂，因其具有蒸薰、胃毒、触杀功能及迅速降解无残留等特点，广泛用于粮食、油料、蔬菜、水果、牧草等农作物的杀虫剂，是生产绿色食品的理想的高效杀虫剂和生物性农药。含硫酸烟碱的溶液可防治大田作物生产中蚜虫等作物害虫。烟碱用作杀虫剂、除草剂、植物生长调节剂的复配成分,扩大了原有农药的使用范围，是一种高效、低毒、广谱的“绿色”农药，符合绿色食品生产的要求。另外,烟碱与肥料的复合可增加肥效,降低铵氮的流失。在动物的防病治病方面，烟雾剂形式的烟碱可用于禽舍的消毒。

②医药

在医药工业上，是研制治疗心血管、变态性神经病(最常见的是海默病和帕金森病)、溃疡性结肠炎、口腔溃疡、蛇毒及图雷特综合征等疾患药物的特种原料，少量烟碱能刺

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激人体中枢神经系统,有使人精神安定和抗忧郁作用,对人的紧张情绪具有缓解作用。烟碱合成的烟酸常应用于医药,能有效治疗阿尔茨海默氏病和帕金森综合症。高纯度的烟碱还可用作保健香烟、戒烟膏、治疗关节疼痛和肌肉痉挛外用药的原料。烟碱还用于高级食用或饲用烟草蛋白质、医药保健功能蛋白等的生产。

③烟草行业

在卷烟工业中，用天然烟碱配制的香精有显著地增加香气和劲头的作用，烟厂在香精香科中加入天然烟碱之后，在叶组配方中就减少了对上等烟叶的用量，降低了卷烟成本，烟碱是烟叶的主要品质成分之一。香烟香味主要来源于氧化烟碱。提取并制备高纯度烟碱,制成氧化烟碱,添加到复合型卷烟中既可驱除杂味,增加烟劲,提高卷烟的品质,又可减轻对人体的危害[5]。卷烟代用品如烟口香糖、烟茶只有添加烟碱,才能达到烟叶的特性和使用效果。

④化工行业

在化工行业中，烟碱还是重要的化工原料。经氧化醇化等工艺，可制备烟酸及其系列衍生物—烟酰胺、烟肌酸、烟酸己可碱、烟酸生育酚等。

（2）茄尼醇的应用

茄尼醇是目前某些临床疗效的重要药物的有效成份，在临床上它显示了较强的抗癌生物活性，能够抗菌消炎，对于治疗充血性心脏病所致浮肿、肺充血、心绞痛，急慢性肝炎、亚急性肝坏死，坏血病、十二指肠溃疡、胃溃疡、坏死性牙周炎，凝血、止血等都有良好作用。目前茄尼醇的应用一般是将它作为重要的医药中间体用于合成维生素K。和辅酶Q10据专家介绍，辅酶Q10是预防和治疗中老年性疾病、延缓衰老的较好药物之一，它被许多科学家认为“是它点燃了生命能量的火花”是最有效的抗氧化物之一。还可作为抗溃疡药物，抗癌，抗艾滋病药物合成的原料。

(3)氨基酸的应用

氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，是在生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切的关系。它在抗体内具有特殊的生理功能，是生物体内不可缺少的营养成分之一。氨基酸在医药上主要用来制备复方氨基酸输液，也用作治疗药物和用于合成多肽药物。目前用作药物的氨基酸有一百几十种，其中包括构成蛋白质的氨基酸有20种和构成非蛋白质的氨基酸有100多种。

（4）蛋白质的应用

蛋白质是人体中最重要的物质，也是最多的物质之一，成人身体中有20％都是由蛋白质所组成的。修补细胞与建造组织：构成体内所有的细胞和组织，维持细胞的正常功

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能与新陈代谢，形成酵素系统，维持正常的消化机能，制造血液的运送物质，维持身体的渗透压，胶原蛋白的主要成份。

（5）糖类的应用

糖类是多羟基醛，酮或水解时产生这类化合物的物质，是自然界分布广泛、数量最多的有机化合物。多数糖类可写成通式(CH2O)n，如葡萄糖为C6H12O6，故也叫做碳水化合物。人类、大多数动物以及许多微生物摄人总能量的主要部分是糖类。糖类也是利用太阳能由二氧化碳和水合成糖的绿色植物和其他光合生物的代谢中心。通过光合作用所产生的大量淀粉和其他糖，是动植物和微生物非光合细胞的最终能源和碳源。糖类的其他的重要生物功能还有：淀粉和糖原是葡萄糖的贮藏形式；不溶的多糖是植物和微生物细胞壁以及动物结缔组织和外壳的支撑物，其他糖类还有滑润骨关节、防止细胞间的粘着，以及赋于动物细胞表面以生物专一性等作用。

（6）有机酸的应用

有机酸可以降低胃酸道pH值，提高消化酶的活性，改变有害微生物的适宜生存环境，同时某些有机酸本身就是三大代谢途径中的中间产物，可直接与代谢，提供能量。因此可以改进动物生长性能，增强动物的免疫能力，是新一代的营养兼保健型添加剂。

（7）烟渣的可行性处理

提取了烟碱和茄尼醇以及其他有价值的成分后所剩的烟渣，经实践研究，其中总氮含量高达10％，钾、磷、钙及有机质的含量均在1％左右。若把它作为有机复混肥能促进土壤团粒结构的形成，改良土质，对酸性土壤及盐碱地起缓冲作用，提高土壤保水贮肥能力，还具有一定的防治农作物病虫害和抑制杂草生长的作用。因此，以烟渣作为基础肥料，开发生产价廉质优的有机复混肥，具有很好的发展前景。这里还要指出，作为有机肥的烟渣，必须是提取烟碱以后的烟渣，因烟碱含量过高会杀害土壤中的有益菌株，造成农作物减产。

另外，烟渣经处理还可制得活性炭，充分实现了资源的最大利用价值。 1.2.3低碳环保经济

低碳的直接释义就是降低二氧化碳的排放。“低碳经济”的理想形态是充分发展“阳光经济”“风能经济”“氢能经济”“生物质能经济”。从中国能源结构看，低碳意味节能减排，低碳经济就是以低能耗低污染为基础的经济。“戒除嗜好！面向低碳经济”环境日主题提示人们，“低碳经济”不仅意味着制造业要加快淘汰高能耗、高污染的落后生产能力，推进节能减排的科技创新，而且意味着引导公众反思哪些习以为常的消费模式和生活方式是浪费能源、增排污染的不良嗜好，从而充分发掘服务业和消费生

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活领域节能减排的巨大潜力。 转向低碳经济、低碳生活方式的重要途径之一，是戒除以高耗能源为代价的“便利消费”嗜好。“便利”是现代商业营销和消费生活中流行的价值观。不少便利消费方式在人们不经意中浪费着巨大的能源。

据文献报道，由于国家只收上等级的烟叶，废次烟叶长期以来都是烧掉或烂掉，据不完全统计，每年贵州省烧掉或以其它方式处理的烟叶价值近2亿元。而烟草燃烧时释放的烟雾中含有3800多种已知的化学物质，绝大部分对人体有害，其中包括一氧化碳、尼古丁等生物碱、胺类、腈类、醉类、酚类、烷烃、醛类、氮氧化物，多环芳烃、杂环族化合物、羟基化合物、重金属元素、有机农药等，范围很广，它们有多种生物学作用，对人体造成各种危害。 因此充分利用废次烟草，通过生物发酵或者其他方式提取出里面富含价值的成分，提高烟叶的利用价值，变废为宝，提高烟草行业附加值。实现资源的最大利用化，并且实现节能减排，降低浪费，降低环境污染，提升烟草的附加值，最大化利用资源实现低碳经济。

1.2.4经济效益 （1）环境效益

可以通过生物技术等多种方法从废次烟草中提炼出更多有价值的成分如生物碱、茄尼醇、蛋白质、氨基酸、糖类、有机酸(L-苹果酸、柠檬酸、油酸、肉桂酸等40多种)等物质。并且废烟渣有可以用作基础肥料，还可以用来制的活性炭，充分实现了资源的合理利用，减少了资源浪费和污染物的排放，从宏观上分析对环境有一定改善，是具有环境效益的。

（2）社会效益

据网上报价，天然烟碱每吨8．7万美元，茄尼醇每吨4800万人民币。所以整个研究不仅对废次烟叶的综合利用具有重要意义，而且有巨大的社会经济效益。

几年来,对100对猪饲料的配合物中添加15%~25%烟草饲料,进行跟踪调查的结果表明:用烟草饲料喂猪能有效控制猪的腹泻、下痢,改善猪皮肤代谢,从而使猪皮肤红润光亮,促进猪的生长,平均提高增重率16. 3%,每头猪可以平均节约猪饲料10%左右.

1.3烟碱的国内外研究现状

1.3.1烟碱的提取方法

烟碱已工业化的传统提取方法可分为三类：水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法和离子交换法．新兴的超临界萃取法也正逐步应用于烟碱的提取。烟碱提取方法的基本生产工艺流程如图1-1所示，它们的主要区别在于获得游离烟碱的方法不同。

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(1)物理法 ○1超声波提取法

超声波产生的空化和强烈振动作用加强了被提取物质的释放、扩散及溶解,所以采用超声波提取法可大大缩短提取时间，提高提出率。同时，超声波破碎过程是一个物理过程,被提取的天然成分的化学结构和性质也不会发生改变[8]。

○2微波提取法

微波提取技术是利用频率为300-300000MHz的电磁波辐射提取物，在交频磁场、电场作用下，提取物内的极性分子取向随电场方向改变而变化，从而导致分子旋转、振动或摆动，加剧反应物分子运动及相线间的碰撞频繁率，使分子在极短时间内达到活化状态，比传统加热式均匀、高效[9]。

（2）化学法 ○1水蒸气蒸馏法

水蒸气蒸馏法是提取天然烟碱的较为原始的工艺，利用烟碱在碱性条件下能与水蒸气共同挥发而不分解的特性，烟叶经强碱液浸泡并通入过热水蒸气蒸馏，馏份中即含有游离烟碱。再用稀酸回收馏分，回收液经浓缩后可得烟碱粗品。该法流程简单，操作方便，但是耗费大量的能源，效率低，并且烟碱盐转化为相应的钠盐后不易分解，若氢氧化钠过量还将使焦油皂化生成脂肪酸钠盐，这些有机酸钠盐均有表面活性，导致烟碱不易挥发出去。所得产品烟碱的纯度低，不能满足市场需求，工业上已很少使用。工业化的烟碱提取工艺把水蒸气蒸馏与溶剂萃取相结合，在上述流程的基础上，使用有机溶剂萃取蒸气中的尼古丁，然后用硫酸溶液将烟碱分离出来，生产适和农用或医药原料的烟碱。此法工艺简单操作成本低。但是尼古丁的提取率低，得到的烟碱纯度也在90%以下。

○2溶剂萃取法

溶剂萃取法是用碱液碱化经清水或酸液浸泡过的浸取液或直接用碱液浸泡即可得到游离烟碱水溶液。用有机溶剂将烟碱萃取出来后用酸类溶液反萃得到烟碱盐溶液。最后碱化得到烟碱产品。由于烟碱本身理化性质的影响，该工艺中烟碱盐经碱化后得到的烟碱产品如何实现与盐和水的分离是该工艺的症结。对此刘本法等提出了二次萃取蒸馏法提取烟碱的工艺。

③离子交换法

离子交换法是将烟叶经稀酸或水浸取后得到的滤液通过离子交换树脂(强酸性)，烟碱即被吸附在交换柱上，然后用碱交换即得到游离烟碱的水溶液，该法未使用有机溶剂，但周期长，产品损失严重，树脂易中毒，操作不容易且得到的烟碱的纯度低。国外有人

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“81将离子交换和溶剂萃取结合起来，提出离子交换一溶剂萃取法，得到高纯度烟碱产品。

④离子交换-溶剂萃取法

将原料用稀酸浸提，加热回流抽滤，将滤液经离子交换树脂(强酸性)，烟碱即被吸附在交换柱上，然后用碱交换得到游离烟碱的水溶液。该法未使用有机溶剂，但是所得烟碱的纯度低，有人将离子交换与溶剂萃取结合起来，提出离子－交换溶剂萃取法，所得产品的产率高、质量好。该法的工艺流程为：原料→稀硫酸浸提→陈化→压滤→离子交换→萃取→反萃→陈化→产品。离子交换树脂选择HN268型，萃取剂选择煤油，反萃剂为硫酸，洗脱液为2mol/L,的Na0H溶液。该法的烟碱最高提取率可达98%以上，并且得到高纯度烟碱产品。

⑤超临介萃取技术的应用

超临界萃取烟草中的烟碱已有很多研究，有的已实现工业化生产，烟碱的萃取率可达95％。超临界萃取技术应用于烟草工业有它特殊优点，但是高设备投资、维修费用大，设计和制造要求高，萃取釜不能连续操作，生产能力低等这一系列问题仍有待进一步解决。

黄注传等将直接蒸馏法与溶剂萃取法相结合提取烟碱，有效的提高了烟碱的纯度。工业化的烟碱提取是把水蒸气蒸馏与溶剂萃取相结合在上述流程的基础上使用有机溶剂萃取蒸气中的烟碱，然后用硫酸溶液将烟碱分离出来，此法工艺简单，操作成本低，但是烟碱的提取率低，得到的烟碱纯度也很低。

（3）生物技术法

烟叶细胞壁富含纤维素、半纤维素和木质素，其组成的结晶结构阻碍了烟碱的有效溶出。因此采用生物酶法，在适宜的条件下，利用生物菌种对烟叶进行发酵，使烟叶中的大部分烟碱呈游离态游离出来，然后通过有机溶剂萃取，就可以提取出烟碱。所以只要筛选出优势菌种产生木质素酶、纤维素酶和半纤维素酶，对烟叶细胞壁成分进行生物降解，优势菌种利用菌丝体对细胞壁进行吸附，利用分泌出的过氧化物酶对其表面成分进行催化氧化反应，从而降解细胞壁成分，使得烟叶中的其他成分更容易游离出来。

生物技术法的优点是不使用化学试剂，而使用经济环保的生物酶对烟叶进行发酵，使烟草最大化的浸出里面有价值的成分如烟碱和茄尼醇及其他重要成分。缺点是由于生物酶的种类繁多，所以对优势菌种的筛选是一项浩大的实验探讨工程，而且生物酶的活性与其生长环境有较大关系，因此要利用此工艺必须要探讨出生物酶对烟草发酵的最佳工艺。其中包括发酵时间、发酵温度、菌种、接种量、固液比、以及pH值等因素对烟碱

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提取的影响。

1.3.2烟碱含量分析方法及优缺点 ○1重量分析法

重量分析法包括硅钨酸重量法和苦味酸重量法。其中硅钨酸重量法使用最广泛的经典测量烟碱的方法。

重量分析法的优点是不使用基准试剂和容量皿，分析结果准确、重现性好、不受外界条件干扰；缺点是操作繁锁、耗时、不能区分烟碱和其它植碱，当溶液中有铵等无机盐存在时沉淀不易生成，不适用低含量烟碱的测定[14]。

○2分光光度法

在烟碱的分子中虽有双键,然而烟碱在可见光区没有吸收峰。但烟碱可与铬蓝黑、甲基橙、溴4 ～8甲酚绿等显色剂生成难溶于水的显色络合物，姚宇澄等[15] 用有机溶剂萃取该显色络合物建立了萃取分光光度法。

分光光度法的优点是对于测定低含量的烟碱准确度高，选择性好，检测速度快;其缺点是可测量的浓度范围小，对于高含量烟碱的测定，因受方法本身灵敏度、谱带宽度、波长选择性及共存植物碱的影响，易造成测量结果的偏差；且往往需要蒸馏或萃取等复杂的前处理，较为费时，还易受外界条件影响。

○3滴定分析法

滴定分析法的基本原理是酸碱反应。由于烟碱的碱性较弱，不能在水溶液中直接准确滴定，因而王瑞新、金秋云[16]分别在乙醇、氯仿中用硫酸滴定了烟碱。

滴定分析法仪器投资小，操作简便，测试时间短，缺点是相对标准偏差较大，由于共存生物碱的干扰，往往结果比标准测量值高，不适合对准确度要求较高样品的测量。

○4旋光法

因为烟碱有较大的旋光度，因此根据其旋光度可测定其浓度。但这种方法仪器昂贵，操作烦琐。孙心齐等[17]用WZZ21 型自动指示旋光仪方便地测量了烟草中的烟碱，简化了操作程序，提高了测量速度。

旋光法适合测量高浓度烟碱，相对标准偏差小，可靠性高，分析周期短，但受外界影响，特别是温度影响大；旋光仪长时间工作、室内温度上升和恒温水浴的温度波动等都易造成结果波动。

○5原子吸收分光光度法

原子吸收分光光度法一般采用金属离子与烟碱形成络合物，从而测定金属离子含量即可知烟碱含量。

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该类方法的优点是无需纯物质作参比，准确度高，可测浓度范围宽。其缺点是：仪器投资高，易受烟草制品中矿物质含量影响，需在前处理中予以注意。

⑥红外光谱定量分析

应用化学计量学的原理，根据不同烟叶对近红外光吸收作用不同而产生的近红外反射光谱的差异，建立近红外光谱与相关化学成分含量之间的关系模型，进而根据近红外光谱测定烟叶中的烟碱及其它化学成分含量。

该方法的优点是测试过程简便，无需复杂的前处理及化学反应过程，测试速度快、效率高，测试过程无污染，费用低，且同时可进行其它成分的测量；缺点是目前虽有现成的仪器但很少有完全适用的检测模型，必须根据需要，先用其它测量方法测出大量的数据，建立起自己的优化模型，而且对操作技术要求高。

⑦色谱分析法

由于色谱法的高分离性能把烟碱和其它共存生物碱等组分分开，同时又能准确快速定性定量分析，因而是近年来比较流行，研究最多的方法。

该方法的优点是分离效率高，测定速度快，分离与测量同步进行，重现性好，回收率高，过程无污染；缺点是需用大型仪器和标准物，不宜普及，测量范围较窄。

⑧极谱分析法

极谱分析法的原理是让烟碱与某金属离子形成络合物，经过分离，用极谱检测金属离子的量从而间接求出烟碱的含量。

该方法测定灵敏度高，分辨能力强，具有良好的抗干扰能力，所用仪器简单但需要对烟碱进行蒸馏、络合、沉淀、分离等复杂的预处理，容易给测量引入误差。

以上是近年来用来测定烟碱含量常用的方法，除此之外，叶毓琼等在演算介质中使烟碱与雷氏盐生成难溶化合物，用原子发射光谱法间接测定了烟碱：Li等用毛细管测定了烟碱制品中痕量的烟碱；Alain等以手性络合剂作为标记物，用核磁共振法测定了烟草生物碱和类烟碱化合物。这些方法多具有简便、快速、样品需要量小的优点，分别是用于对映体分析、药物性能检测及痕量组分分析，但它们都需要大型分析仪器，对测试人员素质要求较高。

1.4本课题的提出

论文研究了生物发酵法从废次烟叶中综合提取烟碱的工艺。利用烟碱极易溶于水的性质，采用生物酶促反应，利用蒸馏水浸泡烟叶的方式将两者分离，采用萃取法对烟碱进行溶剂提取，通过单因素探讨实验结果分析确定了工艺的优化条件，并与其它工艺的提取效果作比较，探讨了发酵时间、发酵温度、菌种、微波及超声时间、接种量、固液

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比、以及pH值等因素对烟碱提取的影响，并采用分光光度法测定烟碱含量，优化得出最佳工艺条件，并通过萃取、减压蒸馏获得烟碱粗品，对废次烟叶的开发利用，变废为宝，提高烟草行业附加值是一项十分有意义的工作，具有一定的参考价值和经济价值。

2 实验部分

2.1烟碱的性质

(1)烟碱的物理性质

烟碱即尼古丁，是烟叶中生物碱的主要成分。纯烟碱在室温下为无色或淡黄色油状液体，有强烈的辣味，沸点为247℃，在低于60℃时可与水任意混溶，极易溶于醇、醚、氯仿、石油醚等有机溶剂。

(2)烟碱的化学特性

烟碱的化学名称。一(B一吡啶基)N-甲基四氢吡咯，分子式：C10H14O2 属于毗啶类衍生物，结构式是：

由两个杂环(吡啶环和吡咯环)组成，这两个杂环胺的官能团都属于叔胺型。分子结构中的吡咯环的Pl缸铭，吡啶环的PKa约为3，这也就意味着该环即使在pH=7时，也约有900,6的烟碱被质子化而生成盐，利用此特性可生产二苦味酸烟碱盐和硫酸烟碱盐及柠檬酸烟碱盐，当该烟碱盐与强碱的稀溶液作用时可生成游离烟碱。利用这一特性可将一烟碱盐转化成为游离烟碱。

（3）烟碱与甲基橙的络合显色原理

甲基橙主要作为指示剂,其变色范围根据缓冲溶液pH 值不同而有所不同。变色原理

??RSOH?RSO?H33是: ,生物碱的碱性基团与染料RSO3H的分子形成盐键结合生成有色物质。该有色物质由染料-生物碱大共轭体系构成 ,并且有色物质能够被三氯甲烷溶解。甲基橙在不同pH值下存在形式不一样,当pH为5时 ,甲基橙在柠檬酸－磷酸二氢钠缓冲溶液中,反应液于420nm 波长处的吸光度最大。选择缓冲溶液的pH值为5。

在酸性介质中 ,烟叶中的生物碱与氢离子成盐 ,甲基橙在此条件下可与上述盐离子定量结合成有色离子对并可被三氯甲烷定量提取。烟碱水溶液在pH=5的柠檬酸－磷酸二氢钠缓冲介质中与甲基橙反应，反应混合液用三氯甲烷进行萃取，将生物碱转入有机

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相中,用光度法于420 nm波长处测定其吸光度。

2.2实验原理

2.2.2 生化酶促法发酵废次烟叶原理

烟叶细胞壁富含纤维素、半纤维素和木质素，其组成的结晶结构阻碍了烟碱的有效溶出。本文采用生物酶法，利用生物菌种对烟叶进行发酵，使烟叶中的大部分烟碱呈游离态游离出来，然后通过有机溶剂萃取，就可以提取出烟碱。黄毛菌可以产生木质素酶、纤维素酶和半纤维素酶，它对木质素的降解分两步进行：一是黄毛菌利用菌丝体对木质素进行吸附；二是黄毛菌利用分泌出的过氧化物酶对木质素进行催化氧化反应，从而降解木质素分子。

图2-2 细胞壁结构

2.2.3紫外分光光度计法的原理

紫外及可见光光度计的可测波长范围为190-1000nm，选择满足条件的光源使其发出白光，经过滤光片后，可得到一窄段波长的近似单色光，通过有色溶液，透过光投射到光电仪上，产生电流(电流的大小与投射光强度成正比)，用检流计测量其电流的大小，从而可读出相应的透光率和吸光度。 出朗伯-比尔定律：A=Kbc

式中：A-吸光度；b-比色皿硬度；c-溶液浓度。

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K-常数，与吸光物质的性质，入射光的波长及温度等因素；

通过测定吸光度A后，就可以得出溶液浓度。烟碱分子中虽然存在双键，然而在可见光区没有吸收峰，但烟碱可与铭蓝黑、甲基橙、溴甲酚绿等显色剂生成难溶于水的显色络合物，用有机溶剂萃取该显色络合物，即可建立起在可见光区的检测体系。 烟碱与甲基橙的有色络合物在氯仿中的吸光度与其浓度呈正比，基于这一原理，本论文采用分光光度计法快速测定烟碱的含量。

2.3 仪器与药品

2.3.1 药品与试剂

实验分析所需主要药剂见下表2-1所列：

表2-1 主要化学试剂表

实验药品与试剂

柠檬酸

规格 分析纯

生产厂家

重庆川东化工（集团）有限公司

化学试剂厂

磷酸氢二钠 甲基橙 三氯甲烷 无水已醇 烟叶 葡萄糖 浓硫酸 无水硫酸钠 氢氧化钠 琼脂 浓盐酸

2.3.2 主要实验仪器

实验分析所需主要仪器见下表2-2所列：

表2-2主要实验仪器表

分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯

成都市科龙化工主要试剂厂

沈阳市试剂厂 成都市科龙化工主要试剂厂

重庆南岸区四公里市场 重庆搏艺化学试剂有限公司 国营重庆无机化学试剂厂 重庆北碚化学试剂厂 齐齐哈尔化工总厂

重庆北碚化学试剂厂

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实验仪器 数显恒温水浴锅 紫外分光光度计 超声波清洗机

离心机 振荡培养箱 电子天平 电热鼓风干燥箱 架盘天平 微波炉 分流漏斗 移液管 烧杯 三角瓶 锥形瓶 容量瓶

型号 HH-2 UV1102 SB-5200D TDL-40B SPX-250-2 FA2004 XMTA-7000P

JP 60ml 1，2，5ml 200，250ml 500ml 100，250ml 100,500ml，25ml

生产厂家 国华电器有限公司 上海天美科学仪器有限公司 宁波新芝生物科技服务有限公司 上海安亭科学仪器有限公司 上海跃进医疗器械厂 上海恒平科学仪器有限公司 重庆银河实验仪器有限公司 上海力能电子仪器公司 顺德格兰仕电器厂有限公司 重庆工商大学实验室 重庆工商大学实验室 重庆工商大学实验室 重庆工商大学实验室 重庆工商大学实验室 重庆工商大学实验室

2.4实验装置图

2.4.1发酵装置图

恒温水浴锅 发酵罐 摇床架 第 16 页 共 36 页

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2.4.2减压蒸馏装置图

2.5实验的工艺流程

烟草粉碎 烟叶预处理 固形物 接种培养 菌种 菌种筛选 扩大化培养 种子液培养 发酵 影响因素分析 最佳工艺 蒸馏成品

2.6实验方法

2.6.1烟碱标准曲线的绘制

准确称取烟碱标准品0.1746g，溶于0.1mol/L的盐酸溶液中，定容至250ml，得到浓度为0.6984g/l的标准储备液。取10ml标准储备液稀释至50ml，得到浓度为0.13968g/l的标准使用液。再从标准使用液中分别取1ml、3ml、5ml、7ml和9ml稀释至10ml，在空白样调零的前提下测定其吸光度值。测定值如表2-3所示、作图2-3：

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表2-3 烟碱浓度和吸光度

浓度g/l 0.013968 0.041904 0.06984 0.097776 0.125712 A值

0.085

0.270

0.434

0.618

0.787

浓度-吸光度(A)1.0000.800y = 6.2715x + 0.00082R = 0.9997吸光度A0.6000.4000.2000.00000.020.040.060.08浓度(g/L)0.10.120.14

图2-3烟碱浓度与吸光度的关系

2.6.2 废次烟草的发酵

准确称取粉碎后10-50目的10g烟叶装入250ml干净的三角瓶中，加入100ml蒸馏水,塞上棉塞后放入高压蒸汽灭菌锅中，在121℃（0.1MP）处高压灭菌处理20min，待灭菌过的原料冷却后，在无菌环境中按20%的接种量加入含有菌种的一定体积的种子液，在一定温度条件下发酵。在30℃水浴恒温振荡培养箱中进行培养。在发酵过程中，由于菌种生长产生的酶对烟叶中纤维素进行降解，使烟碱游离出来。

2.6.3 烟碱的测定

将间隔12h取一次的发酵样液取3ml，用离心机在1500r/min离心5min，取1ml上清液稀释至250ml，测定其吸光度。烟碱的测定包含烟碱的萃取与吸光度的测定两部分。烟碱的萃取过程如下：取稀释后的样品1mL，pH5.00柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液2mL，饱和甲基橙溶液2mL加入60mL分液漏斗中，摇匀，加入氯仿5ml，振荡萃取2min，静置分层，取出氯仿层（下层），待测。烟碱的测定如下：打开UV1102紫外分光光度计，待其连接好稳定后，设定测定波长420nm，用空白样（把1ml样品换成1ml蒸馏水，其余条件与制取样品一样）调零后测量萃取液吸光度。然后通过烟碱标准曲线的回归方程即可换算出发酵液中烟碱浓度。

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2.6.4 计算公式 公式定义说明：

稀释体积数B： 是指在侧吸光度是将1ml原发酵液所稀释的体积数。 吸光度A： 即严格按照分光光度计操作步骤所得出的吸光度值。

烟碱浓度（g/L）： C=(A-0.0008)/6.2715??????????????（1） 式中：A-稀释一定倍数后所测的吸光度值

烟碱含量（g）： M=C*B*V????????????????????（2） 式中：C-烟碱浓度 ；B-稀释体积数；V-发酵液总体积 烟碱溶出率X： X=M/M1*100%??????????????????（3） 式中：M-烟碱含量；M1-烟叶质量

烟碱浸出速率v： v=C1-C2/T???????????????????（4） 式中：C1-初始烟碱浓度；C2-发酵后烟碱浓度；T-发酵时间

2.7 实验步骤

2.7.1 溶液的配制 （1）饱和甲基橙溶液配制：

将固体甲基橙加入到蒸馏水中进行溶解直至有固体不溶物出现为止，溶液即达到饱和。抽滤除去固体物质，滤液即为饱和甲基橙溶液。

柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液(pH5.00)配制：

将0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：准确称取35.8gNa2HPO4·12H2O于干净烧杯中，加水搅拌溶解后，倒入500ml溶量瓶中，用水冲洗三次烧杯和玻棒后，定容至500ml即可。

0.1mol/L柠檬酸：

准确称取10.5g柠檬酸于干净烧杯中，加水搅拌溶解后，加入500ml溶量瓶中，冲洗烧杯和玻棒三次后，定容至500ml即可。

量取412ml的磷酸氢二钠溶液和388ml的柠檬酸溶液于干净瓶内，即得到pH=5的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液。 （2）0.1mol/L稀盐酸配制

0.1mol/L稀盐酸：

（3）2mol/L的氢氧化钠溶液配制

2mol/L的氢氧化钠溶液：准确称取40.0g氢氧化钠于干净的烧杯中，加蒸馏水用玻棒搅拌溶解后，加入500ml容量瓶中，再用水润洗烧杯和玻棒3次，定容至500ml即可。

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2.7.2 培养基的制作 材料：

马铃薯400g、葡萄糖40g、琼脂30g、蒸馏水 步骤：

（1）制马铃薯汁：马铃薯去皮，切成小粒，加2000mL水煮沸30min，用纱布滤去马铃薯残渣。

（2）加琼脂：将琼脂加入滤液，加热溶化。

（3）加葡萄糖：加入葡萄糖，待其溶化后加水定溶至2000mL。 （4）分装：分装在试管和三角瓶中。

（5）加塞：用大小合适的棉塞塞住试管口和三角瓶口。

（6）包扎：用报纸把几个试管或一个三角瓶包紧，并用绳子捆好。 （7）灭菌：将上述培养基在0.1Mpa，121oC，灭菌30min。

（8）放斜面：待试管培养基冷却至50oC左右时，让试管口稍高，斜面大概为试管一般长，冷却固定即可。

2.7.3 菌种的培育

（1）在无菌操作台内从原始菌种斜面上挑取一环菌种，之字形法接种于PDA斜面上，置于30oC培养箱中，培养3-4天，待菌丝长满斜面后用干净牛皮纸包裹后冻入冰箱。

（2）从固体培养基上挑取一环菌种，接入装有100ml左右液体培养基的三角瓶中，将菌液瓶放入30℃的培养箱中，以90r/min的转速培养1-2天，呆菌种在液体培养基中长成颗粒状为止。

2.7.4菌种的诱导

（1）将培养基分为100ml每瓶，加棉塞，高压（121℃）灭菌15分钟，

（2）取5ml浓度为0.13968g/L烟碱标准品溶液加入培养基中，放在紫外灯下照射15min。

（3）待灭菌过的培养基冷却后放于紫外灯下照射灭菌，15分钟以后，将灭菌过的烟碱盐酸溶液加入培养基，向培养基中用接种环接入菌种。

（4）将菌液瓶放入30℃的培养箱中，以90r/min的转速培养1-2天，呆菌种在液体培养基中长成颗粒状为止。

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2.7.5烟叶预处理

将烟叶在90oC的烘箱中烘干，达到干脆为止，用粉碎机粉碎后进行筛分，筛好后用塑料袋装好，备用。

2.7.6烟叶的发酵

按照实验进行单因素探讨的条件加入所需菌种接种量，接入恒温水浴锅中进行发酵。如实验装置图，三角瓶用胶塞密封，插入温度计，接入温度计的目的在于测量三角瓶中发酵温度。

2.7.7烟碱含量分析

将间隔12h取一次的发酵样液取3ml，用离心机在1500r/min离心5min，取1ml上清液稀释至250ml，测定其吸光度。烟碱的测定包含烟碱的萃取与吸光度的测定两部分。烟碱的萃取过程如下：取稀释后的样品1mL，pH5.00柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液2mL，饱和甲基橙溶液2mL加入60mL分液漏斗中，摇匀，加入氯仿5ml，振荡萃取2min，静置分层，取出氯仿层（下层），待测。烟碱的测定如下：打开UV1102紫外分光光度计，待其连接好稳定后，设定测定波长420nm，用空白样（把1ml样品换成1ml蒸馏水，其余条件与制取样品一样）调零后测量萃取液吸光度。然后通过烟碱标准曲线的回归方程即可换算出发酵液中烟碱浓度。

2.7.8烟碱的提取

在所有单因素探讨完之后即得到最佳工艺，利用最佳工艺做烟碱的提取。准确称取5.0g烟草于干净的锥形瓶中，加入100ml蒸馏水，高压灭菌（121摄氏度）20min，加入辅料碳酸铵0.2g，再加入0.5ml的黄毛诱导菌，在30oC的恒温水浴锅内发酵24h后取出，量取体积后，加入到250ml的分液漏斗中，然后以样液：氯仿＝1：2的比例萃取两次，对氯仿层进行蒸馏，设定温度为75oC，直到将氯仿蒸完即可，剩余的产品即为烟碱粗品。

3 实验结果与讨论

3.1不同菌种对烟碱含量浸出的影响

准确称取10-50目的烟叶10.0g，不加辅料，设定固液比为1：10（即加入100ml蒸馏水），菌种接种量为20%（接种2ml菌种），发酵温度30℃，发酵时间72h，每12h取一次样，稀释体积25ml。选用黄毛菌、黑曲霉、酵母菌、白地、木霉五种不同的菌种发酵，编号①②③④⑤，每次取样3ml，在1500r/min条件下离心10min后去上清液1ml稀释定容

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至25ml，用分光光度法测定其吸光度，所得实验数据如下表3-1、并作图：

表3-1 不同菌种、不同发酵时间的对比

菌种

① 号 黄 毛 菌 ② 号 黑 曲 霉

时间(h) 吸光度A 浓度(g/L) 烟碱含量g 烟碱溶出率% 0 0.327 0.05201 0.13003 1.30033 12 0.405 0.06445 0.16113 1.61126 24 0.402 0.06397 0.15993 1.59930 36 0.52 0.08279 0.20697 2.06968 48 0.527 0.08390 0.20976 2.09758 60 0.517 0.08231 0.20577 2.05772 72 0.329 0.05233 0.13083 1.30830 0 0.42 0.06684 0.16711 1.67105 12 0.434 0.06907 0.17269 1.72686 24 0.28 0.04452 0.11130 1.11297 36 0.453 0.07210 0.18026 1.80260 48 0.427 0.06796 0.16990 1.69896 60 0.514 0.08183 0.20458 2.04576 72 0 12 24 36 48 60 72 0 12 24 36 48 60 72 0 12 24 36 48 60 72

0.415 0.421 0.456 0.295 0.41 0.402 0.422 0.441 0.462 0.232 0.305 0.452 0.458 0.513 0.431 0.423 0.334 0.407 0.503 0.431 0.386 0.486

0.06604 0.06700 0.07258 0.04691 0.06525 0.06397 0.06716 0.07019 0.07354 0.03687 0.04851 0.07194 0.07290 0.08167 0.06860 0.06732 0.05313 0.06477 0.08008 0.06860 0.06142 0.07737

0.16511 0.16750 0.18146 0.11728 0.16312 0.15993 0.16790 0.17548 0.18385 0.09216 0.12126 0.17986 0.18225 0.20418 0.17149 0.16830 0.13282 0.16192 0.20019 0.17149 0.15355 0.19341

1.65112 1.67504 1.81456 1.17277 1.63119 1.59930 1.67902 1.75476 1.83848 0.92163 1.21263 1.79861 1.82253 2.04178 1.71490 1.68301 1.32823 1.61923 2.00191 1.71490 1.53552 1.93415

③ 号 酵 母 菌

④ 号 白 地

⑤ 号 木 霉

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不同菌种-时间0.60.50.4黄毛菌黑曲霉酵母菌白地木霉吸光度A0.30.20.1002040时间（H）6080

图3-1不同菌种对烟碱浸出浓度的关系

由图3-1可知, 黄毛和白地都是优势菌种，但黄毛的最大浓度比白地霉高，且黄毛在48小时有最大浓度，而白地霉在72小时有最大浓度,。这是由于：刚开始发酵时，菌种不立即繁殖，需要一段时间来适应新的环境，所以对烟叶中纤维素的降解速度比较慢，就导致发酵体系中游离出来的烟碱量较少，但随着发酵时间的增大，菌种大量繁殖，使得纤维素被大量水解，导致了烟碱浓度增加。但当发酵进行到一定程度后，由于纤维素的大量消耗，培养基浓度降低，使得菌种生长所需要的营养源供应不足，导致菌种生长速率逐渐下降甚至到零，此时，发酵液中烟碱的浓度就趋于定值。根据文献报道，黄毛是一种降解纤维素的菌种，具有耐酸耐碱性质，能与发酵液生存，并表现出良好的活性。故结合发酵时间和最大浸出率的比较，故选择黄毛菌种作为发酵菌种。

3.2菌种诱导对烟碱含量的影响

准确称取10-50目的烟叶10.0g，不加辅料，设定固液比为1：10（即加入100ml蒸馏水），选用空白、黄毛、诱导菌种发酵，菌种接种量为20%（接种2ml菌种），发酵温度为30℃，发酵时间为72h，每12h取一次样，每次取样3ml，在1500r/min条件下离心10min后取上清液1ml稀释定容至25ml，用分光光度法测定其吸光度，所得实验数据如下表3-2、并作图：

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表3-2 不同菌种、不同发酵时间的对比

时间（h） 空白A C1(g/L) 黄毛A C2(g/L) 黄毛诱导A C3(g/L)

0 0.679

15 0.578

27 0.538

36 0.528

51 0.519

65 0.498

72 0.424

0.10814 0.09204 0.08566 0.08406 0.08263 0.07928 0.06748 0.455

0.508

0.496

0.593

0.526

0.373

0.481

0.07242 0.08087 0.07896 0.09443 0.08374 0.05935 0.07657 0.49

0.555

0.608

0.546

0.547

0.483

0.483

0.07800 0.08837 0.09682 0.08693 0.08709 0.07689 0.07689

烟碱含量g 0.19501 0.22092 0.24205 0.21733 0.21773 0.19222 0.19222 烟碱溶出率%

1.95009 2.20920 2.42047 2.17332 2.17731 1.92219 1.92219

空白—黄毛—诱导菌0.80.70.6吸光度A0.50.40.30.20.1002040时间（H）6080空白黄毛黄毛诱导菌

图3-2不同菌种与烟碱浓度的关系

由图3-2可知, 加黄毛菌种的烟草浸出烟碱的效果比不加黄毛菌种的绝对要好。这是由于加了黄毛菌种的烟叶能利用微生物发酵破环烟叶的壁结构，更有利于烟碱的迅速溶出；由黄毛和黄毛诱导菌两曲线的走势可以得出：经过诱导的黄毛菌种最佳时间提前到了24小时。这是由于：加标诱导过的菌种能快速的适应生长环境并迅速的发酵烟叶提取烟碱达到最佳发酵效果。故结合发酵时间和烟碱溶出率选择黄毛诱导菌种作为发酵菌

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种。 验证了前面的黄毛诱导菌能提前达到最佳发酵效果，黄毛菌种和黄毛诱导菌种在浸出烟碱的效果上差不多，这是由于：经过诱导的黄毛菌种能够更快的适应生长环境提前达到最佳发酵效果。故结合发酵时间和烟碱溶出率选择黄毛诱导菌种作为发酵菌种，发酵时间为24h。

3.3不同底物条件的影响

3.3.1探讨辅料比对烟碱含量的影响

准确称取烟叶5.0g，加辅料碳酸铵0、1%、2%、4%、8%，加入液体100ml、，菌种接种量0.5ml，发酵温度30℃，选用黄毛诱导菌种发酵，发酵时间24h，超声处理15min，每组取样3ml，在1500r/min条件下离心10min后取上清液1ml稀释定容至25ml，用分光光度法测定其吸光度，所得实验数据如下表3-3-1、并作图：

表3-3-1 不同辅料比对烟碱浸出的比较

辅料比 A0 C0（g/L) A1 C1（g/L) C1-C0

1% 0.367 0.05839 0.394 0.06270

2% 0.355

4% 0.324

8% 0.351

空白 0.334

0.05648 0.05153 0.05584 0.05313 0.397

0.56

0.548

0.442

0.06317 0.08917 0.08725 0.07035

0.00430519 0.006697 0.037631 0.031412 0.017221

浸出率（g/L/h）% 0.017938292 0.027904 0.156794 0.130883 0.071753

烟碱含量g 烟碱溶出率%

0.15674 3.13482

0.15794 0.22291 0.21813 0.17587 3.15873 4.45826 4.36259 3.51750

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辅料比-烟碱溶出率%5.000004.500004.000003.50000烟碱溶出率%3.000002.500002.000001.500001.000000.500000.00000124辅料比%8空白烟碱溶出率%

图3-3-1不同辅料与烟碱溶出率的关系

由图3-3-1可知,当加入碳酸铵与烟叶比为4%时有最大烟碱溶出率。这是由于：菌种在发酵的过程中需要消耗大量的碳源氮源，和其他营养物质，故加入碳酸铵能提供一定的C、N能源，有利于菌种的生长，加入辅料是非常必要的。故结合最大烟碱溶出率的比较，故选择辅料比为4%。

3.3.2探讨固液比对烟碱含量的影响

准确称取烟叶5.0g，不加辅料，选用黄毛诱导菌种发酵，分别加入蒸馏水25ml、50ml、75ml、100ml、150ml，高压灭菌处理20min，菌种接种量为0.5ml，发酵温度为30℃，发酵时间为24h，每次取样3ml，在1500r/min条件下离心10min后取上清液1ml稀释定容至25ml，用分光光度法测定其吸光度，所得实验数据如下表3-3-2、并作图：

表3-3-2 相同菌种、不同固液比的对比

V(ml) 固液比 A0 C0（g/L) A2 C1（g/L) C1-C0

25 5 0.6

50 10 0.561

75 15 0.427

100 20 0.35

150 30 0.308

0.09554 0.08932 0.06796 0.05568 0.04898 0.716

0.72

0.598

0.533

0.309

0.11404 0.11468 0.09522 0.08486 0.04914 0.01850 0.02535 0.02727 0.02918 0.00016

浸出率（g/L/h）% 0.07707 0.10564 0.11361 0.12158 0.00066

烟碱含量g

0.071275 0.143347 0.178546 0.21215 0.184286

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烟碱溶出率% 1.425496 2.866938 3.570916 4.243004 3.685721

固液比-烟碱溶出率%4.543.5烟碱溶出率2.521.510.5051015固液比1:X2030烟碱溶出率%

图3-3-2固液比与烟碱溶出率的关系

由图3-3-2可知,烟叶与浸泡液蒸馏水的比例为1：20时有最大烟碱溶率。这是由于：黄毛诱导菌种在此固液比的条件下有适合菌种生长的最佳底物浓度和生长环境，因此能快速的发酵烟叶达到最佳发酵效果。故结合最大烟碱溶出率比较，选择固液比为1：20。

3.4发酵工艺条件的影响

3.4.1探讨接种量对烟碱含量的影响

准确称取烟叶10.0g，不加辅料，设定固液比为1：10（即加入100ml蒸馏水），高压灭菌20min，选用黄毛诱导菌种发酵，菌种接种量1ml、2ml、4ml、6ml、8ml、10ml，发酵温度为30℃，发酵时间为24h，每次取样3ml，在1500r/min条件下离心10min后取上清液1ml稀释定容至25ml，用分光光度法测定其吸光度，所得实验数据如下表3-4、并作图：

表3-4-1 相同菌种、相同发酵时间、不同接种量的对比

接种量% 吸光度A

10 0.66

20 0.511

40 0.442

60 0.541

80 0.473

100 0.576

浓度（g/L) 0.10511 0.08135 0.07035 0.08614 0.07529 0.09172

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烟碱含量g 0.26278 0.20338 0.17587 0.21534 0.18823 0.22929 烟碱溶出率%

2.62776 2.03380 1.75875 2.15339 1.88232 2.29291

接种量-烟碱溶出率2.521.510.5010204060接种量?100

图 3-4-1接种量与烟碱溶出率的关系

烟碱溶出率%烟碱溶出率%由图3-4-1可知,根据实验数据以及分析图表可以初步得出接种量在1：10的情况下发酵效果最好。这是由于过多的菌种会因为争夺营养物质二相互竞争形成不良生长环境，所以控制菌种的量是非常必要的，故结合烟碱溶出率的比较得出菌种的接种比例在1:10的环境下能很好的生长并达到最佳发酵烟叶的效果。

3.4.2探讨PH值对烟碱含量的影响

准确称取烟叶5.0g，不加辅料，加入蒸馏水100ml、高压灭菌20min，用0.1mol/L的盐酸和0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节PH值为3、5、7、9、11，菌选用黄毛诱导菌种发酵，菌种接种量为0.5ml，发酵温度为30℃，发酵时间为24h，每组取样3ml，在1500r/min条件下离心10min后取上清液1ml稀释定容至25ml，用分光光度法测定其吸光度，所得实验数据如下表3-4-2、并作图：

表3-4-2 相同菌种、不同PH值的对比

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PH A0 CO（g/L) A1 C1（g/L) C1-C0（g/L)

3 0.253

5 0.312

7 0.36

9 0.315

11 0.275

空白=6 0.334

0.040214 0.049621 0.057275 0.0501 0.043722 0.053129 0.324

0.376

0.435

0.5

0.398

0.52

0.051535 0.059826 0.069234 0.079598 0.063334 0.082787 0.011321 0.010205 0.011959 0.029499 0.019613 0.029658

浸出率（g/L/h) 0.047171 0.04252 0.049829 0.122911 0.081719 0.123575 烟碱含量g 烟碱溶出率% 0.128837 0.149565 0.173085 0.198995 0.158335 0.206968 2.576736 2.99131 3.461692 3.979909 3.166707 4.139361 PH-烟碱溶出率%4.543.532.521.510.50PH357PH911空白=6烟碱溶出率%烟碱溶出率%

图3-4-2 不同PH值与烟碱溶出率的关系

由图3-4-2可知,当PH=6即不加任何酸碱中和试剂的情况下，有烟碱最大溶出率；当PH=6即不加任何酸碱中和试剂的情况下有最大烟碱浸出率。这是由于：在pH为5-8时，烟碱主要以单质子状态存在。故结合烟碱最大溶出率和烟碱最大浸出率的比较，选用pH为6.00为最佳。

3.5超声波对烟碱含量的影响

准确称取烟叶5.0g，不加辅料，加入蒸馏水100ml、高压灭菌20min，选用黄毛诱导菌种发酵，菌种接种量为0.5ml，发酵温度为30℃，发酵时间为24h，后将发酵液用超声波处理一定时间后取样，每次取样3ml，在1500r/min条件下离心10min后取上清液1ml稀释定容至25ml，用分光光度法测定其吸光度，所得实验数据如下表3-5、并作图：

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3-5 相同菌种、相同发酵时间、不同超声时间的对比

时间（h) 吸光度A

0 0.408

5 10 15 0.516

20 0.487

25 0.505

30 0.464

0.483 0.465

浓度（g/L) 0.06493 0.07689 0.07402 0.08215 0.07753 0.08040 0.07386 烟碱含量g 0.16232 0.19222 0.18504 0.20537 0.19381 0.20099 0.18464 烟碱溶出率% 3.24643 3.84438 3.70087 4.10747 3.87627 4.01977 3.69290

超声时间-烟碱溶出率%4.543.5烟碱溶出率2.5系列121.510.50051015时间（min）202530

图3-5不同超声时间与烟碱溶出率的关系

由图3-5可知,当超声作用时间在15min时有最大烟碱溶出率4.10747 %，这是由于：超声波产生的空化和强烈振动作用加强了被提取物质的释放、扩散及溶解,所以采用超声波提取法可大大缩短提取时间，提高提出率。故结合烟碱最大溶出率的比较，选用超声波作为物理方法辅助，时间为15min。

3.6重现最佳工艺条件实验

3.6.1烟碱的浸出

准确称取烟叶5.0g，加碳酸铵辅料0.2g，加入蒸馏水100ml、高压灭菌20min，菌种接种量0.5ml，发酵温度30℃，选用黄毛诱导菌种发酵，发酵时间24h，稀释体积数25ml，发酵液超声15min后，每组取样3ml，在1500r/min条件下离心10min后取上清液1ml稀释

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定容至25ml，工艺条件如表3-6-1；用分光光度法测定其吸光度，所得实验数据如下表：

表3-6-1 最佳工艺条件重现

发酵时

菌种 黄毛诱导菌

24h 间

接种量

固液比

超声时间

PH值 温度

辅料比

10% 1:20 15min 6 30℃ 4%

优化结果

编号 A0 C0（g/L) A1 C1（g/L) C1-C0 浸出率（g/L/h）%

烟碱含量g 烟碱溶出率%

优化① 0.401 0.06381 0.639 0.10176 0.03795 0.15812 0.25440 5.08810

优化② 0.412 0.06557 0.648 0.10320 0.03763 0.15679 0.25799 5.15985

由表3-6-2可知,烟碱最大溶出率为5.15985%比前几个实验中的最大溶出率要大的多，故优于任一单因素溶出的烟碱含量。这是由于：根据单因素探讨结果，得出最佳工艺条件为选用黄毛诱导菌为发酵菌种，发酵时间为24h，发酵温度为30oC，接种量为10%，固液比为1：20，辅料比为4%，pH值为6.0，超声时间15min，条件得到最优化，菌种有较好的生长环境，在加上物理辅助方法，增加了烟碱的溶出率，使其达到最佳烟碱溶出率。

3.6.2最佳工艺条件实验下提取烟碱粗品

将①②锥形瓶中的发酵液用抽滤机过滤3次，得到样液250ml，并测其吸光度A1；在样液中加入85g大孔树脂吸附8h后用抽滤机过滤1次后用250ml的0.6g/L的氢氧化钠溶液洗脱树脂2h后用抽滤机过滤，取洗脱后的样液测其吸光度A3；以样液：氯仿=1：2的比例进行萃取，取下层进行减压蒸馏，同时回收氯仿。当蒸馏瓶中出现油状物时停止蒸馏，将产品转入试管中，称量试管空重m1，并根据少量多次的原理清洗蒸馏瓶，在将试管置于背光的地方让其自动挥发完残留的氯仿，采用恒重法判定是否挥发完全。将得到的产

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品称量其重量m2；得到烟碱粗品的质量为m2-m1g。所的实验数据如表3-6-2：

表3-6-2最佳工艺实验结果

烟碱含量烟碱溶出

吸光度 浓度(g/L) g 率% 0.542 0.08629514 0.5393447 0.05393447 0.462 0.07353903 0.4596189 0.04596189

m1 3.7256

m2 4.2781

m2-m1 0.5525

初始液 洗脱后

质量（g）

由表3-6-2可以得出通过最佳工艺条件以及超声波辅助后得到烟碱最大溶出率，并且得到粗品0.5525g。氯仿回收率可达到81.14%。

4结论与展望

4.1 结论

4.1.1不同方法对比的实验结果

实验中比较了超声处理与未超声处理、加辅料与未加辅料对烟碱溶出的影响，超声15min后5.0g烟草可产生0.20537g烟碱，而未超声的烟草仅产生0.16232g烟碱；加辅料后5.0g烟叶可产生0.22291g烟碱，而为加辅料的烟草仅产生0.17587g烟碱；因此，本实验采用添加碳酸铵辅料和发酵后超声处理辅助生物酶法的方法提取烟草中的烟碱。

4.1.2单因素探讨的实验结果

实验中对黄毛菌及其诱导菌、酵母菌、管囊菌、白地、木霉等菌种对烟碱溶出的影响做了比较，筛选出烟碱溶出率最高的菌种。由图3-2可以看出，黄毛诱导菌在发酵24h，烟碱溶出率最大为2.38%，因此，实验中选用黄毛诱导菌为最佳菌种，发酵时间为24h。同时由图3-4可以看出，黄毛诱导菌在接种量为10%时有最大烟碱溶出率2.6%；由图3-5可以看出固液比在1：20的时候有最大烟碱溶出率4.243%；有图3-6可以看出PH值在6的时候即不需要加入任何酸碱中和剂的情况下有最大烟碱溶出率4.139%。

4.1.3最佳工艺条件

根据单因素探讨结果，得出最佳工艺条件为：选用黄毛诱导菌为发酵菌种，发酵时间为24h，发酵温度为30oC，接种量为10%，固液比为1：20，辅料比为4%，pH值为6.00，超声时间15min。

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4.2实验存在的不足

4.2.1取样的不均匀性

实验中，我们将烟叶装好后，放置在恒温水浴锅中静置培养，每12h取一次样，这种做法有其不合理之处，因为取出的样液不是均匀的，而且取的过程中还会将一小部分的烟草带出来，会对后面样品的浓度有影响，而且菌种的分布情况也是不均匀的，取出的菌种也就不均匀，这方面在以后的实验中还有待提高。

4.2.2萃取剂的挥发性

实验选用氯仿为萃取剂，这些有机溶剂的挥发性都很强，因此在测量吸光度时存在较大的误差，因此，在萃取时，一定要在萃取后立即测其吸光度，否则在做后面的样品时，前面的浓度已经变了，会影响测量结果。

4.2.3仪器的不稳定性

仪器产生的系统误差会对测量结果产生或多或少的影响。

4.3展望

4.3.1实验展望

本次实验的溶解溶剂采用的是蒸馏水，望后续研究实验可以试着探讨用其他溶剂来溶解烟草，比如甲醇或其他有机溶剂； 本次实验菌种筛选有其局限性，望后续研究实验可以更多的尝试探讨其他优势菌种或者是复合菌种的利用；本次实验中萃取烟碱次数只用了一次，望后续研究实验可以探讨萃取次数对烟碱含量的影响。

4.3.2应用前景展望

在目前，烟草的利用率较低，废弃的烟草还很多，大多在处理废弃作物时，采用焚烧、填埋等方式，不仅污染了环境，也浪费了资源。烟草的带给人类的作用是相当大的，在医药，农业，化工等等方面，因此合理利用废弃烟草，变废为宝，是当前研究的重点，现在提出用生物酶法来提取烟草中的烟碱，可以得到比化学方法更好的提取率，而且对环境的污染更少，因此，生物技术的将是未来研究的一个重点，会带给人类一个更美好的明天。

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生物酶法提取葡萄籽油的工艺研究.食品科学.2006

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重庆工商大学2010届毕业论文 生物催化提制废次烟草中烟碱的工艺研究

致谢

首先，衷心感谢我的导师王老师。从论文开始、确定研究方案、建立实验方法到结果分析、论文撰写都得到了导师的指导。王老师严格治学培养了我独立思考和解决问题的能力，这将使我终身受益。另外也感谢王老师在生活上对我的关心。同时也感谢环生学院各位老师在实验中的指点和帮助，各位老师学识渊博、思路宽广、勇于创新，对科学洞察深刻以及对学生孜孜不倦的教诲与激励，都将使我终生铭记。

其次，在实验过程中，也要感谢殷老师及药物中心其他老师为我提供的帮助以及实验上一些宝贵的意见，及对我的上些错误操作方法的纠正。

最后，要感谢我的父母大学四年来为我付出的辛劳，以及学校对我栽培。

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重庆工商大学2010届毕业论文 生物催化提制废次烟草中烟碱的工艺研究

致谢

首先，衷心感谢我的导师王老师。从论文开始、确定研究方案、建立实验方法到结果分析、论文撰写都得到了导师的指导。王老师严格治学培养了我独立思考和解决问题的能力，这将使我终身受益。另外也感谢王老师在生活上对我的关心。同时也感谢环生学院各位老师在实验中的指点和帮助，各位老师学识渊博、思路宽广、勇于创新，对科学洞察深刻以及对学生孜孜不倦的教诲与激励，都将使我终生铭记。

其次，在实验过程中，也要感谢殷老师及药物中心其他老师为我提供的帮助以及实验上一些宝贵的意见，及对我的上些错误操作方法的纠正。

最后，要感谢我的父母大学四年来为我付出的辛劳，以及学校对我栽培。

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