胎球蛋白A检测试剂盒（ELISA酶联免疫法）简介说明书

人胎球蛋白A检测试剂盒（酶联免疫法）

（德国DRG EIA4522）

预期用途

此试剂盒可用于血清，血浆，细胞上清，组织提取物和尿液中人胎球蛋白A也称之为α-2-HS糖蛋白的定量的检测；血清或血浆中胎球蛋白A的检测可作为某些癌症及基因遗传缺陷的血清蛋白诊断的辅助工具；此试剂盒仅供实验室专业人士使用 简介

胎球蛋白A也称之为α-2-HS糖蛋白，是由两个氨基末端抑制域和一个较小的羧基末端域组成的59 kDa 分子量的糖蛋白；由肝脏合成，分泌至血流，成年哺乳动物体内的浓度范围在0.5-1.0g/L；婴儿期的血清胎球蛋白A含量高，参与蛋白酶抑制活性，与钙代谢和骨生成调节相关；累积于骨和牙齿内，作为生物学上非胶原骨蛋白的主要部分，研究表明，胎球蛋白A是循环中主要的钙化抑制剂；干涉钙盐沉淀；近期研究显示低水平胎球蛋白A的慢性肾脏衰竭患者与心血管病的高死亡率显著相关；另一方面，糖尿病老年人血清胎球蛋白A含量比正常人高，这是独立于胰岛素抑制剂的其他标记物；另外，高胎球蛋白A水平还可作为心血管疾病的的危险标记物

实验原理

此试剂盒可用于血清样本中人胎球蛋白A的定量检测；采用双位点夹心法，羊抗人胎球蛋白A多抗结合人胎球蛋白A的不同位点

将含人胎球蛋白A的试验标准品，质控品和预稀释样本加至包被了高度亲和羊抗人胎球蛋白A多抗的微孔内，第一次孵育，包被抗体捕获样本中的人胎球蛋白A，未结合的蛋白洗板除去，然后加入HRP标记的抗人胎球蛋白A酶联物加入至每孔，“夹心-人胎球蛋白A-HRP-标记的酶联物”形成夹心，未结合的示踪抗体通过洗板除去，结合于包被板上的HRP酶免物与底物液定时反应，然后在酶标仪上检测；结合于包被胎球蛋白A上示踪抗体酶活性与样本中胎球蛋白A的含量直接相关，在点对点或三次回归模式下以标准品的浓度比上OD值绘制标准曲线，样本中的胎球蛋白A可直接从标准曲线上得到

试剂：准备与贮存

此试剂盒收到后立即贮存于2-8℃下，效期见试剂盒标签；所有成分在2-8℃下可保存至有效期

使用前，所有试剂平衡至室温，不同批次的试剂不能交换使用

1. 包被板，96孔，包被了抗人胎球蛋白A抗体；微孔板固定于板架上，密封于含有干燥剂的铝箔密封袋内；贮存于2-8℃至有效期

2. 胎球蛋白A示踪抗体，1瓶，0.6 ml，浓缩，HRP标记的抗人胎球蛋白A示踪抗体溶于稳定的蛋白基质中；此试剂使用前需用示踪剂抗体稀释液进行稀释；贮存于2-8℃至有效期 3. 示踪抗体稀释液，1瓶，11ml，即用，Trizma盐酸溶于缓冲液；根据实验步骤用于示踪抗体稀释；贮存于2-8℃至有效期

4. 试验缓冲液，浓缩，1瓶，11ml，含牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐；建议使用前以1:10比例用双蒸水稀释（如11 ml浓缩+99 ml的双蒸水）；贮存于2-8℃至有效期

5. 洗涤液，浓缩，1瓶，20ml，30倍浓缩；试验前需用580ml的双蒸水稀释，混匀；一旦稀释，不含叠氮化物防腐剂的磷酸缓冲盐洗涤液会含表面活性剂；稀释的洗涤液在室温下可保存至效期

6. HRP底物液；1瓶，12ml，含过氧化氢的TMB底物液；贮存于2-8℃至有效期

7. 终止液，1瓶，12ml，0.5M硫酸，贮存于2-8℃至有效期

8. 胎球蛋白A标准品，5瓶，含胎球蛋白A，不含叠氮化物防腐剂的液态牛血清基质；各标准品浓度见瓶子标签；3次冻存周期使用后，所有标准品保存至-20℃或更低

9. 胎球蛋白A质控，2瓶，含人胎球蛋白A，不含叠氮化物防腐剂的液态牛血清基质，各质控的精确浓度范围见瓶子标签，3次冻存周期使用后质控保存至-20℃或更低

安全注意事项

1. 此试剂用于临床参考实验室，仅供医生或实验室专业人士体外诊断用 2. 若试剂是有潜在感染风险的，试验操作和处理时应戴手套

3. 避免接触含TMB，过氧化氢，硫酸的试剂，TM,B会刺激皮肤和粘膜，导致皮肤过敏反应；TMB还可能是致癌物质；皮肤接触到硫酸会导致严重灼伤，不要接触到眼睛，皮肤，衣服，不要吸入烟雾，一旦接触，应立即用大量水冲洗至少15min 4. 良好实验室操作规范

实验所需材料但试剂盒未提供

1. 精确的单通道移液器，10-25-100-1000ul 2. 适于100 ul的可重复用分液器 3. 适于所有体积的一次性枪头

4. 一次性玻璃管或塑料管12x75mm或13x100mm 5. 带盖的一次性塑料瓶；100-1000ml 6. 铝箔纸

7. 双蒸水或去离子水 8. 塑料盖板或聚乙烯薄膜

9. 多通道洗涤瓶或全自动（半自动）洗板系统 10. 酶标仪，450nm

样本采集

人胎球蛋白A的检测所需血清或血浆样本量仅10 ul

个人在采样前无需特殊准备，全血采集，室温下立即凝集30min，然后离心分离出血清（850-1500 xg 10min）。全血采集3小时内需将血清从凝集中分离出来，转移至另一干净试管；血清样本可保存在-20℃或更低，避免超过三次的冻融

建议采用24小时尿液来检测尿液中的胎球蛋白A；采集第二天早晨的尿液，排除采样前刚进行剧烈运动的，因肾功能不全导致多尿的；由利尿药引起的人体内尿蛋白含量波动降低，可能与尿肌酸酐浓度相关； 细胞上清，组织提取物则需进行试验样本的倍比稀释；多个平行样检测得到更精确的试验结果

实验步骤

患者样本的准备

患者血清或血浆样本在检测前需用试验缓冲液进行1:10000 的稀释 1. 以1A和1B 标记两个试管（12x75 mm） 2. 加1ml的试验缓冲液至各试管（1A和1B） 3. 加10 ul的患者血清至1A试管，混合（1:100）

4. 从1A管内吸取10ul已稀释的样本至1B试管，混合（1:10000）

注意：建议采用精确/经校准的移液器，稀释过程小心操作，得到更精确的结果；建议采用多通道（Combitip）12.5ml的Eppendorf 可重复移液器加1ml的试验缓冲液，而不用50ml的枪头

患者尿液样本的实验前用试验缓冲液1:100的稀释 1. 以1标记一试管（12x75 mm） 2. 各管加1ml试验缓冲液

3. 加10ul患者尿液样本至1管，混合（1:100）

注意：若所得结果中样本浓度高于5个标准品中的最高标准品浓度，则尿液样本需进一步稀释（如1:500），然后重新检测

试剂准备

1. 试验前将所有试剂平衡至室温，不同批次的试剂不能混合使用

2. 使用前，试验缓冲液（浓缩）及洗涤液（浓缩）需进行稀释，配制成工作液；详情请见“试剂”部分

试验操作

1. 将实验所需板条固定于板架上，标准品，质控品及未知样本做双孔检测 2. 试验布局 ROW A B C D E F G H STRIP 1 STD 1 STD 1 STD 2 STD 2 STD 3 STD 3 STD 4 STD 4 STRIP 2 STD 5 STD 5 C 1 C 1 C 2 C 2 SAMPLE 1 SAMPLE 1 STRIP 3 SAMPLE 2 SAMPLE 2 SAMPLE 3 SAMPLE 3 3. 加25 ul的标准品，质控品及预稀释的1:10000样本至相应孔内；注意：尿液样本是1:100的稀释

4. 每孔加100 ul的试验缓冲液 5. 混匀，盖板，避免暴露于阳光下 6. 室温下孵育2小时

7. 示踪抗体工作液的准备，示踪抗体1:21的用示踪抗体稀释液稀释；每条板需1ml的示踪抗体稀释液+50 ul的胎球蛋白A示踪抗体

8. 移去盖板，弃去孔内反应液，每孔加350ul的洗涤工作液洗板5次，然后彻底吸出孔内液体，或可采用全自动洗板机

9. 以上稀释的示踪抗体工作液加100 ul至各孔 10. 盖板，避免暴露于阳光下 11. 室温下孵育30min

12. 移去盖板，弃去孔内反应液，每孔加350ul的洗涤工作液洗板5次，然后彻底吸出孔内液体，或可采用全自动洗板机

13. 每孔加100 ul的ELISA HRP 底物液 14. 盖板，避免暴露于阳光下 15. 室温下孵育20min

16. 移去盖板，每孔加100 ul的终止液，混匀 17. 10min 内在450nm酶标仪上检测吸收值

注意：为降低背景色，可以双波长检测，设置参考波长：595nm 或620 nm 或630nm

操作注意事项

1. 建议所有标准品，质控品和未知样本做双孔检测；各双孔检测的吸收均值用于数据处理，结果计算

2. 将光敏试剂保持装于原琥珀色瓶内

3. 将剩余的包被板条放存在含干燥剂的密封袋内，避免受潮 4. 操作严格，移液器经校准可确保试验的可重复性 5. 孵育时间或温度也可能会影响试验结果

6. 避免微孔内产生气泡，可能会导致结合率低，双孔读数变异系数高 7. 使用前所有试剂都应彻底混匀，避免产生气泡

结果说明

1. 计算各双孔吸收值均值

2. 所有的吸收均值都减去标准品1（即 0ng/ml）的吸收均值

3. 在点对点或对数-对数坐标纸上以标准品的浓度为X轴，吸收均值为Y轴绘制标准曲线；或是采用数据处理软件进行结果计算

质控品和样本浓度（1:10000）可直接从标准曲线上读取，若采用的是对数-对数或数据处理软件计算则需用到对数转换；样本校正吸收值在浓度1ng/ml 和下一个最高标准品间的需通过公式计算：

未知样本浓度 = 未知样本吸收值 2 标准品吸光值

nd

x 2nd 标准品浓度值

典型标准曲线

以下为典型示例的吸收值及标准曲线；此标准曲线不能用于其他实验的计算

期望值

70例正常成人血清检测人胎球蛋白A ，95%百分比的正常值范围在0.35-0.95 g/L，均值为0.57 g/L ;标准偏差为0.13 g/L

10000倍的稀释因子应考虑到样本浓度的最终计算

如：从标准曲线上直接得到的10000倍稀释样本值是24.3 ng/mL,那原样本浓度为

24.3 ng/mL x 10,000 = 243000 ng/mL = 0.243 g/L

操作局限性

1. 人胎球蛋白A直接检测的最低浓度为5.0 ng/ml（试验分析灵敏度），10000倍稀释的样本血清回算后，原血清样本浓度的最低检测限是50 ug/ml

2. 因人胎球蛋白A检测无金标准，所以试验标准通过稀释含蛋白基质的高度纯化重组人胎球蛋白A建立

3. 可直接读取的未知样本浓度高于350 ng/ml，建议对样本进一步稀释

4. 若实验室酶标仪在450nm处的OD值不能超过2.0，建议将标准品6 舍去，不做检测 5. 细菌或真菌污染的样本或试剂，或试剂间的交叉污染都可能会导致错误结果 6. 聚酯树脂处理的去离子水不能激活过氧化氢酶

质量控制

适当的已知胎球蛋白A水平的质控可确保试验结果的有效性；建议所有实验室除了试剂盒本身的质控外，还应额外建立自己实验室的胎球蛋白A质控

性能指标 1. 灵敏度

人胎球蛋白A分析灵敏度，零标准品20次重复试验，95%置信区间，最后得5.0 ng/ml

2. 线性

两个人的血清样本进行稀释检测，结果如下，ng/ml

# 1 2 稀释比例 1:10,000 1:20,000 1:40,000 1:80,000 1:160,000 1:10,000 1:20,000 检测值 21.9 11.9 5.3 2.9 1.6 192 99.9 期望值 11.0 5.5 2.7 1.4 96 回收率% 108 96 107 114 104 1:40,000 1:80,000 1:160,000 45.2 22.2 13.4 48 24 12 94 93 112 3. 精密度

两个样本在一个试验中做20次重复检测，分析板内差异

胎球蛋白A均值(ng/mL) 33.6 121.1 CV (%) 5.5 4.8

两个样本双孔检测，做了12次检测，分析板间差异 胎球蛋白A均值 (ng/mL) 32.4 123.7 CV (%) 6.8 5.7

4. 回收率

两位患者血清加不同量的人胎球蛋白A ，检测，结果如下，ng/ml # 1 2 原始值 33.6 121.1 加入的量 21 63 200 21 63 200 检测值 25.1 44.4 120.1 68.9 88.6 157.1 期望值 27.3 48.3 116.8 71.1 92.1 160.6 回收率% 92 92 103 97 96 98

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