实验一 还原糖和总糖含量的测定
更新时间:2023-11-07 16:49:01 阅读量: 教育文库 文档下载
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实验一 还原糖和总糖含量的测定
(3,5-二硝基水杨酸比色法)
一.目的
1.掌握还原糖定量测定的基本原理; 2.学习比色定糖法的基本操作; 3.熟悉分光光度计的使用方法。 二.原理
在碱性的条件下,还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热,3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质),还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系,在540nm波长下测定棕红色物质的消光值,查对标准曲线并计算,便可分别样品中还原糖和总糖的含量。
三.仪器.试剂和材料 1.仪器:
(1)25ml刻度试管 (2)玻璃漏斗 (3)三角瓶 (4)100ml容量瓶3个 (5)刻度吸管(1ml,2ml,3ml) (6)恒温水浴 (7)沸水浴 (8)电子天平 (9)分光光度计 2.试剂;
(1)1mg/ml葡萄糖标准液 (2)3,5-二硝基水杨酸试剂 (3)碘碘化钾溶液 (4)酚酞指示剂 (5)6ml/L HCI (6)6ml/L NaOH 3.材料:食用面粉 四.操作步骤
1.制作葡萄糖标准曲线:取7支25ml刻度试管,编号,按如下操作。 操作项目 葡萄糖标准液(ml) 蒸馏水(ml) 管 号 0 1 2 3 4 5 6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 3,5-二硝基水杨酸(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 吸光度(A540) 0.000 0.081 0.217 0.331 0.467 0.575 0.648 将各管摇匀,在沸水中加热5min,取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温,再以蒸馏水定容至25min,用试管塞塞住试管口,颠倒混匀。在540nm波长下,用0号试管调零,分别读取1~6号管的吸光度。以吸光度为纵坐标,葡萄样毫克数为横坐标,绘制标准曲线。
葡萄糖标准曲线0.80.70.60.50.40.30.20.100吸光度趋势线y = 0.5571x吸光度(A540)0.6480.5750.4670.3310.2170.08100.511.5
葡萄糖毫克数(mg)2.样品中还原糖和总糖含量的测定
(1)样品中还原糖的提取:准确称取3g使用面粉,放在100ml三角瓶中,先以少量蒸馏水调成糊状,然后加50ml蒸馏水,搅匀,置于50℃恒温水中保温20min,使还原糖浸出。过滤,用20ml蒸馏水定容至刻度,混匀,作为还原糖待测液。
(2)样品中总糖的水解和提取:准确称取1g使用面粉。放在100ml的三角瓶中,加入10ml 6mol/L HCI及15ml蒸馏水,置于水浴中加热水解30min。待三角瓶中水解液冷却后,加入1滴酚酞指示剂。以6mol/LNaOH中和至微红色,过滤,再用少量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸,将滤纸全部收集砸100ml的容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,混匀。精确吸取10ml定容过的水解液,移入另一100ml的容量瓶中,以水稀释定容,混匀,作为总糖待测液。 (3)显色和比色,取4支25ml刻度试管,编号,按下表的量操作。 操作项目 还原糖测定管号 1 ○1 0 0 1.5 0.303 0.301 2 ○1 0 0 1.5 0.298 总糖测定管号 Ⅰ 0 1 1 1.5 0.410 0.421 Ⅱ 0 1 1 1.5 0.414 还原糖待测液(ml) 总糖待测液(ml) 蒸馏水(ml) 3,5-二硝基水杨酸(ml) 吸光度(A540) 吸光度(A540)平均值 五、注意事项:标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行,一起显色和比色。 六、结果处理
1、○2吸光度平均值在葡萄糖标准曲线查出相应的还原糖毫克数为:0.167mg (1)由管○
由管Ⅰ、Ⅱ吸光度平均值在葡萄糖标准曲线查出相应的还原糖毫克数为:0.235mg (2)计算样品中还原糖和总糖的百分含量如下: 还原糖℅=0.557℅ 总糖℅=0.235℅ 七、问题讨论
1.面粉中主要含有何种糖? 答:淀粉
2.糖含量定量测定的方法还有哪些?
答:①高效液相色谱法(HPLC) ②苯酚-硫酸法 ③蒽酮法 ④双折射现象
葡萄糖标准曲线0.70.6吸光度(A540)吸光度趋势线公式:y = 0.5298x0.6540.50.40.30.20.10000.20.40.60.8葡萄糖毫克数(mg)11.21.40.0740.1770.3130.4290.527幻想 著
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