PACE 毛细管电泳操作手册-Operational Manual for MDQ with 32 K

32 Karat Software ver 5.0 P/ACE MDQ操作手册

贝克曼库尔特有限公司

2002年12月15 日

TM

目 录

第一章 毛细管电泳系统导论

第二章 P/ACE MDQ 毛细管电泳系统组成的概述 第三章 启动32 Karat 软件 第四章 直接控制 第五章 方法编辑 第六章 系统运行 第七章 积分 第八章 校准 第九章 定性分析 第十章 使用迁移率 第十一章 建立报告

特别声明和致谢:

1、本操作手册为试用本, 有不清楚的地方一律参照英文版原文，并以英文版原文为准。如发现有误之处，请通知贝克曼库尔特公司市场部，以便及时更正，公司市场部将不胜感激！

2、贝克曼库尔特公司市场部特别感谢浙江省疾病控制中心任一平教授级高级工程师、福州大学中心实验室有关老师等协助我们完成了大量的工作。特此予以致谢！

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第一章 毛细管电泳仪的导论

概述

本资料说明毛细管电泳仪的一般原理和以P/ACETM MDQ为主机，带有紫外、二级管阵列和激光诱导荧光检测器的基本操作指导。

一般说明

P/ACETM MDQ是根据各种电泳的分离机理；在熔融石英玻璃毛细管中进行十七化合物分离的仪器。

在P/ACETM MDQ中，在压力、真空或电压的作用下样品进入毛细管后，在高电压的作用下，样品中的各种化合物以不同的淌度通过毛细管。

检测这些化合物有两种方法。其一利用化合物对紫外光具有吸收的原理，化合物在毛细管中通过毛细管的窗口，应用紫外或二极管阵列检测器检测起吸收值，将吸收光信号变成电信号传给计算机或积分仪。由计算机制作成电泳图而被分析。

第二个方法是利用化合物对特定发射光具有吸收并产生激发光的原理。这里由激光诱导荧光（LIF）来完成。在毛细管中的物质吸收激光诱导荧光检测器所产生的特定波长的发射光，激光诱导荧光检测器在测定、并记录其产生的激发光。再由计算机完成电泳图。

P/ACETM MDQ可以分离各种不同的样品，包括：肽类、蛋白、核酸、离子、手性化合物和药物。毛细管电泳比其他分析仪器需要更为少量的样品（5-30微升，进样的量仅仅5-50纳升）。它提供比其他分离技术更为理想的分析手段。 电泳基本模式

Capillary Zone Electrophoresis (CZE)毛细管区带电泳

毛细管区带电泳也称为自有溶液毛细管电泳，是毛细管电泳中最简单的一种形式。其分离机理是各被分离物质的净电荷与质量之间比值的差异，不同离子按照各自表面电荷密度的差异以不同的速度在电解质中移动，而导致分离。毛细管区带电冰要求缓冲液具有均一性，毛细管内各处具有恒定的电场强度。

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Micellar ElectroPhoresis Capillary Chromatography（MEKC） 胶束电动力学毛细管色谱

在MECC中，当把离子型表面活性剂加入缓冲液中，并且其浓度足够大时这种表面活性剂的单体就结合在一起，形成一个球体我们称其为胶束。目前，以十二烷基硫酸钠（SDS）使用最为普遍。

在MECC的系统中存在两个相：流动的水相和起到固定相作用的胶束相，被分离物在这两个相之间分配，由于它们在胶束中具有保留能力而产生不同的保留时间。和区带电泳一样，缓冲液在管别壁处形成正电，使其显示强烈的向负极移动的电渗流，而SDS胶束由于其外壳带负电性具有向正极迁移的倾向。一般情况下，电渗流的速度大于胶束的迁移速度。因此，迫使胶束最终以较低的速度向负极移动。我们把这个移动的胶束固定相也称之“准固定相”。

在胶束电动力学色谱中，中性粒子之间的分离是根据其本身的疏水性的不同而达到的，不同疏水性的粒子和胶束的相互作用不同，疏水性强的作用力就大，保留时间就长；反之，保留时间就短。

Capillary Gel Electrophoresis（CGE）毛细管凝胶电泳

凝胶电泳是用凝胶物质作为支撑物进行分离的区带电泳。凝胶是一种固态分散体系，它具有多孔性，具有类似于分子筛的作用。被分离物在通过装入毛细管的凝胶时，按照各自分子的体积大小逐一分离，分子体积大的首先被分离出来，其后是较小的分子。

Capillary Isoelectric Focusing ( cIEF)毛细管等点聚焦

两性电解质在分离介质中的迁移形成pH梯度，各种具有不同等电点的蛋白质按照这一梯度迁移到它们的等电点的那个位置，并在该点停下，由此产生一条非常窄的聚焦区带，并使不同的蛋白质聚焦在不同的位置上。 毛细管等电聚焦的运行过程，可分为三个步骤： A进样。把样品与两性电解质混合并进样。

B聚焦。加高电压3－4分钟，使整个毛细管长度范围内建立一个pH梯度，以便让样品在毛细管中向各自的等电点聚焦点移动，形成一条由不同组分排列的

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带子。

C迁移。阴极的缓冲液换成盐类后，再加上电压，使末端引起梯度降低，让已聚焦组分一个一个通过检测器。

Capillary Electrochromatography（CEC）毛细管电色谱

在毛细管中装填了液色谱的各种填料；相当于固定相，应用电泳中的EOF电渗流作为动力，电解质相当于流动相。各种小分子、极性或中性化合物在两相之迁移而形成分离。毛细管电色谱尤其适应于小分子（药物）的分离。

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第二章 P/ACE MDQ 毛细管电泳系统组成的概述

P/ACE MDQ毛细管电泳系统的主要组成部分有: 放置样品瓶、缓冲液和其它溶液的盛盘、系统连接装置、电极和高压电源、检测器和连接光纤、温度控制装置以及自动进样装置等。各个部件的详细配置情况见图1。

图1 P/ACE MDQ 仪器的主要部件图解

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2 样品盘示意图

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图

图 3 图示毛细管卡盒

备注： 1、 内可容纳毛细管的制冷剂管道 2、 毛细管

3、 UV 和PDA检测窗口 4、 LIF 检测窗口

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图4 指示灯的位置

备注： 1、高压指示灯 2、UV 灯亮指示灯 3、仪器电源指示灯

图 5 图示样品盘和卡盒盖板

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备注： 1、样品盘盖板 2、卡盒盖板

图 6 UV检测器光纤的连接方式示意图

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图 7 PDA检测器光纤的连接方式示意图

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图 8 带LIF 检测器的P/ACE MDQ 仪器示意图

图 9 LIF 检测器的光学系统图解

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10 488 nm 激光光源大背面观

图

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第三章

启动32 Karat 软件

从Windows 工具条上开始菜单按钮选择Programs / 32 Karat / 32 Karat Software 启动32 Karat软件.

图11 32 Karat软件在开始菜单的位置

32 Karat软件启动后打开列出已设置的仪器的主窗口.

图12 32 Karat软件的主窗口

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工具条

工具条在顶部出现并且,在一些情况下位于当前的窗口底部。在工具条上的活跃按钮允许以鼠标单击的方式达打开许多普通的命令。以上这些按钮可在打开的窗口中看到。 菜单条

菜单条包含32 Karat软件可得到的所有命令。菜单条能通过鼠标单击或按住Alt 键和带下划线的字母打开。

新建并且设置一台仪器

在这练习中你将：

新建一台真实连接的仪器

新建一个能被用于离线数据处理的虚拟仪器 注意

这章假设所有的硬件和接口板都已安装，如果没有安装，请先参考安装和维护手册进行安装。

新建一台仪器

从一台单个的计算机用32 Karat 软件最多能控制4台P/ACE MDQ能创建无数的虚拟仪器用于离线编辑方法或数据分析。使用下列练习设置一台新机器。选

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择和你的硬件配置相对应的检测器类型。

1、在右边的空白处单击鼠标右键，从下落菜单选择 New / Instrument。

2、一台新仪器将建成，它的图标位于右边的空白处。在加亮的名称域输入仪器的名称（在这个例子我们将它命名为Instrument 1），这个名字将在整个32 Karat软件中使用，在仪器窗口，数据报告，和仪器记录。

图13 32 Karat软件打开窗口

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设置新仪器

设置仪器是软件准备控制硬件和采集数据的过程，包括： 1、识别P/ACE MDQ 为唯一的仪器。

2、识别当前的硬件部件。每台物理的仪器至少由2个图标代表其中之一将被用于控制和数据采集；在第一个正在用于采集数据时另一个被用于数据的离线处理。下面将以UV检测器为例。

1、在Instrument 1图标上单击鼠标右键，从下落菜单选择Configure。

2、在Instrument type下拉选框中选择Beckman P/ACE MDQ；输入名称Instrument1 标识仪器。

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3、单击Configure按钮，在Beckman P/ACE MDQ设置窗口可用的模块出现在窗口的左面。

自动设置

32 Karat软件可自动设置所有的P/ACE MDQ模块。注意要将仪器电源打开并连接到电脑上。

1、单击窗口底部的Auto Configuration按钮，可听到MDQ的托盘移动的声音，这表明软件正和仪器通讯。在这一过程中会出现以下窗口。

2、检测器将在已设置的模块窗口中出现。

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3、在新图标上单击鼠标右键并选择Open。核对仪器被正确的检测和设置。 图14 P/ACE MDQ UV检测器配置窗口

4、和计算机相联的每一台P／ACE MDQ必须有唯一的设备ID、设定的缺省植是l。如果安装有多台的MDQ，为每一台MDQ选择唯一的 ID（l， 2， 3或 4）

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在选择好ID后点击SET BUS ADDRESS将该信息传送给仪器。

5、缓冲液托盘和样品托盘的类型在开始时被检测。托盘盖子被打开并且关上后每次都会检测托盘的类型。仪器能自动检测3种类型的托盘：36位缓冲液托盘，大容量缓冲液托盘和 48位置样品托盘。 96孔样品极不能被自动检测，必须从该窗口手动设置。托盘类型可以手工地在任何时间被改变。

6、当选择96孔样品板时，允许定义样品板的复选框可用，如果这个复选框被选择，用户可以定义样品板的高度和深度，因此可以使用其他的非标准样品板。如果这个复选框没被选择，仅能使用标准的Beckman Coulter96孔样品板。 7、如果安装了LIF检测器，LIF校准向导可用。这个功能在安装和维护手册中有详细的描述。

8、滤光片对话框用来定义UV检测器安装的特定滤光片。数据必须手工输入并且和仪器实际安装的滤光片—一对应。如果安装了PDA检测器，位置 8不能安装滤光片，显示值为“0”。

9、压力单位可定义为psi（磅每平方英寸）或mbar（毫巴）。选择的单位将仅仅在这台仪器被使用。

10、温度控制显示样品冷却装置的安装。如果安装，可从下拉框选择“可用”。 11、单击

OK回到仪器配置窗口。

图 15 Beckman P/ACE MDQ仪器配置窗口

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配置选项

图16 P/ACE MDQ 配置选项对话框（分析选项）

分析选项定义重新处理数据时采用的软件功能。 PDA允许分析PDA检测器的多通道数据。

System Suitability可自动查看结果。未选择的结果可实时更新。 Qualitative Analysis允许以迁移时间，相对迁移时间或迁移率。

Caesar Integration用于检测峰的开始和结束。当基线突然跃迁或信噪比较低时非常有用。如果未选择，峰的开始和结束基于斜率阀值。

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仪器选项

图 17 P/ACE MDQ 仪器设置选项对话框（仪器选项）

Standard CE峰达到检测器窗口的时间称为迁移时间。

CEC/LC峰到达检测器窗口的时间称为保留时间。这一选择会在谱图和报告中反应。

12、单击OK退出并且保存模块设置。 13、单击OK回到开始菜单。 手动设置 手动设置UV检测器

手动设置用于仪器关机或正在使用时。

注意

在该手册中的许多练习需要设置一台虚拟的 UV检测器仪器。按照以下过

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程建立一台虚拟的UV检测器仪器，不考虑实际的仪器配置。 1、在主菜单新建一台设备，并命名为“UV for manual”。

2、在这一练习中设置UV检测器。选择左边的UV检测器图标，

单击图标， 新加一台UV检测器仪器。

3、在新图标上单击鼠标右键并且选择Open，出现P/ACE MDQ 设备设置对话框。

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4、选择仪器使用的托盘。 5、点击OK退出并保存模块配置。

配置选项

关于配置选项请参看以上内容。

手动设置PDA和LIF 检测器

参照UV检测器的设置，注意每台设备只能有一个检测器。

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第四章 直接控制 简介

直接控制屏幕相当于仪器的面板操作。可以对仪器的操作参数进行既时修改，直接控制对操作准备、维修保养和故障排除非常有用。

在直接控制界面通过用鼠标点击相应的区域来控制仪器。并且可以看到仪器的现时状态。

Direct Control Window直接控制窗口

点击 Control下拉菜单选择 Direct Control View，打开直接控制窗口。

图18直接控制窗口中的特殊区域

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1、毛细管温度 2、托盘上/下 3、标签对话框 4、托盘上/下 5、灯开关 6、检测器对话框 7、调零

8、托盘回到原始位置 9、托盘到装载位置 10、进样对话框 11、停止当前步骤 12、样品存储温度 13、电压对话框 14、电流对话框 15、功率对话框 16、压力对话框 17、瓶位置对话框。

以上是UV检测器的直接控制。PDA和LIF检测器大致与此相同。

表1 直接控制的功能 直接控制中的功能 温度 毛细管温度 样品温度 托盘 上/下 瓶位置 热点击 热点击 热点击 热点击 打开对话框设定制冷液温度 打开对话框设定样品存储温度 将托盘上下移动 打开对话框将选择的瓶子移到毛细管末端 装载 回到原始位置 光学系统 检测器控制 按钮 按钮 热点击 将托盘移到装载位置 将托盘移到原始位置 打开检测器的对话框 26

灯/激光状态 热点击 打开对话框可将灯/激光打开或关闭 调零 动力控制 电压 电流 功率 压力 其它控制 进样 停止 毛细管信息 按钮 按钮 按钮 按钮 按钮 按钮 按钮 热点击 将检测器输出调零 打开对话框设定电压分离参数 打开对话框设定电流分离参数 打开对话框设定功率分离参数 打开对话框设定压力分离参数 打开对话框设定进样参数 停止仪器操作 打开对话框输入毛细管和卡盘的信息

表2 状态显示 在直接控制中显示的状态 状态 剩余时间 托盘位置 卡盘状态 盖子状态 卡盘温度 样品存储温度 样品存储状态 灯/激光状态 电压 电流 功率 压力 压力 文字 文字/示意图 文字/示意图 示意图 示意图 文字/示意图热点击 文字 示意图 示意图/热点击 文字/示意图/按钮 文字/示意图/按钮 文字/示意图/按钮 文字/示意图/按钮 类型/示意图 显示当前仪器的功能和状态 显示当前仪器操作的剩余时间 显示毛细管末端的位置 显示是否安装卡盘 显示盖子关闭或打开 显示当前制冷液的温度 显示当前样品存储的温度 显示是否安装样品温度控制装置 显示灯/激光灯打开或关闭 显示当前、设置和最大电压 显示当前、设置和最大电流 显示当前、设置和最大功率 显示当前、设置和最大压力 显示压力或真空、和毛细管抹端的 27

位置 极性 检测器信号 毛细管信息

练习：处理新的石英毛细管。

注意 该过程不能用于涂布毛细管。 所需物品：

l、已安装好的卡盘，（ 75um I．D．60cm总长，到检测器长度为 50cm的石英毛 细管。）

2、甲醇（ HPLC级） 3、0.1mol／L盐酸水溶液

4、毛细管再生液A（lmol／L氢氧化钠水溶液） 5、运行缓冲液A（P／N 338426） 6、重蒸水

7、2mL缓冲液小瓶 8、36位缓冲液托盘

按下表所示按倾序放置各种溶液，注意照安装维护手册进行。

表3 瓶子放置的位置 溶液 甲醇 0.1 mol/L 盐酸 再生液A (P/N 338424) 重蒸水 运行缓冲液A 空瓶

左边缓冲液托盘（Inlet） 右边缓冲液托盘（Outlet） B1 C1 D1 E1 A1 A1 B1 示意图 文字/热点击 文字/热点击 显示电极的+和- 极性 检测器的实时信号 显示毛细管信息 28

检查卡盘和样品托盘正确安装。关好托盘盖，注意直接控制图象屏幕上是否显示卡盘和托盘该已安装好。此时应能听到制冷剂开始循环的声音。

在直接控制屏幕上点击压力区域，出现图19的对话框。

图19 压力对话框

该对话框用于设置冲洗和压力分离的参数。

Pressure：输入所需压力，正向压力范围为： 0.1-100 psi； 真空范围：0.1-5 psi。

Duration：持续时间，单位分钟。

Direction：方向，正向（从毛细管进口到出口）或反向（从出口到进口） Pressure Type：压力类型，使用压力或真空 (但一般使用压力).

Tray Positions：指明毛细管冲洗瓶位置。点击Trays按钮，打开瓶选择对话框，见图20。可以直接点去相应的位置，例如分别选择左边的B1和右边的B1即选择甲醇和空瓶，点击OK后回到压力设置对话框。瓶位置示意图应显示Inlet：BI：B1和Outlet：BO：B1。

在 Pressure框中输入 20，在 Duration框中输入 1.0，Direction为正向，Pressure Type为压力。对话框上如同像图19。 点击OK。瓶子移到指定的位置，开始冲洗。

按照表4的步骤进行其它步骤的冲洗。

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图20 选择瓶位置对话框

表4 冲洗步骤 溶液 甲醇 重蒸水 Inlet B1 E1 Outlet B1 B1 B1 B1 B1 B1 B1 Pressure 25 25 20 20 20 20 20 Time 1 0.5 2 0.5 2 0.5 2 0.1 mol/L盐酸 C1 重蒸水 再生液A 重蒸水 E1 D1 E1 运行缓冲液A A1

当冲洗完成后，新毛细管已处理好。毛细管中充满运行缓冲液，下一步将进行电压设置。电击电压区域打开下面的对话框。

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图21 电压设置对话框

该对话框用于设置电压分离参数。

参数如下：

Voltage：分高电压0.1-30千伏

Duration：运行电压的时间0.1-999.9分钟

Ramp Time：达到目的电压所需的时间 0.1-999.9 分钟。

Voltage Max：系统允许达到的最高限定电压，应高于或等于分离电压。 Current Max：系统允许达到的最大限定电流。

Tray Positions：运行时瓶子的位置，与压力冲洗时瓶子位置的设置万法相问。 With Pressure：允许在使用电压运行的同时使用压力；如果选中，还需设定压力值和方向。压力最大值为100psi，压力可加在进口（正向），出口（反向）或两端同时加压。

With vacuum：允许在使用电压运行的同时使用真空，如果选中；还需设定真空值和方向。真空最大值为spsi，压力可加在进。端（正向），或者出口端（反向）但不能两端同时加真空。

External Adapter：如果使用外部设备必须选中该项。详情请参看安装维护手册。

Polarity：选择电极极性，注意看示意图。

在这一练习中选择运行电压的瓶子为运行缓冲液A系统，即Inlet：BI：Al和Outlet：BO：A1。其它参数如下：

Voltage：30kV Duration：2 minutes Ramp time：0.5 minutes

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点击OK，瓶子移到指定的位置开始加电压。请注意电压、电流和功率的变化。电压为30KV时电流一般在27－33微安。2分钟后电压回到零，仪器回到空闲状态。

至此已完成直接控制练习，在进行下一练习前请先熟悉直接控制中的各个功能。

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第五章 方法编辑

新建一个方法 简介

在直接控制练习中，再生毛细管的每一个步骤都需要单独输入参数，方法可将每一个步骤合并成合理的连续过程，仪器能按此程序完成一系列的步骤。本章将描述建立采集数据方法的最基本步骤。还有其它的功能如数据分析、报告打印也是和方法整合在一起的，这将在以后的章节中作详细描述。

建立或编辑方法必须进入仪器窗口，先进入32 Karat主窗口，用鼠标右键单击所建立的仪器，选择Open Offline。几秒钟后会打开仪器离机窗口，同时打开仪器向导。可以从向导中选择Create or Modify a Method打开方法编辑对话框。现在点击OK关闭向导。

下面将新建一个方法运行测试标样。从文件菜单选择File Method New仪器菜单标题栏上的方法名变为“untitled.met．”在方法菜单选择 Method Instrument Setup进入方法的仪器控制和数据采集模块。随着不同检测器将会出现有3－4个选项卡的窗口。选择其中一个为“Initial Condition”（初始条件）的选项卡，进入初始条件对话框。在这个对话框中可输入用于仪器开始方法运行时的参数。

Initial Condition Tab初始条件表

在先前的一节，直接控制，需要练习者分步输入每一步动作。在本节中把每一步结合成一个系统逻辑操作过程，此称为一个方法的。在这个方法中的各步骤是通过仪器自动进行的。本节描述的仅是建立一个为了仪器能采集数据的基本方法。有关更多的功能，诸如：数据分析、形成报告等均可编入一个方法，其中部分将在以后章节中说明。对于更多的说明可参考附录3。

在本练习中需要编写一个用于运行标准试验样品的新方法。从菜单选择File Method New。

要想进入方法的仪器控制核数据采集部分，从某单选择Method Instrument Setup。出现一个随着不同检测器将会出现有3－ 4个选项卡的窗口。选择“Initial Conditions”出现如同图22的对话框。

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在这一框中设定方法开始运行时的仪器初始参数。 图22 仪器设定对话框—初始条件表

Auxiliary data channels 辅助数据通道

在32 Karat软件中可以选择采集多个仪器参数：电压、电流、功率和压力。在你想选择的参数前打勾。

Max kV和max uA框中输入最大允许的电压和电流值。只要其中一个参数达到限制值；系统将自动进行保护。 Mobility channels 迁移率通道 这一选项将在后面详细说明。 Temperature温度

设置卡盘温度初始和样品温度（如果安装样品冷却装置后），该参数可以在时间程序中加以改变。

Peak detect narametcrs峰检测参数

这一参数用于触发其他事件，例如馏分收集。并不用于峰的积分和数据分析。 Trigger settings触发设置

P／ACE MDQ可等待仪器参数与设定参数一致时才开始运行。如果选择“wait for external trigger”则MDQ须等待外部设备的信号，其余两个Wait for temperature”指系统要达到设定的温度。这些选项只会延迟时间程序的运行，不会影响初始条件。

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Inlet and Outlet trays

方法使用的托盘类型，如果和仪器配置中的设置不一致，方法不会运行。

Detector Initial Conditions 检测器初始条件

在这次练习中比较图22所示选择检测器初始参数。

注意

下一个表用于设置在你仪器中所连接检测器的初始参数。

UV Detector Initial Conditions紫外检测器的初始条件

点去 UV Detector Initial Conditions参数表。

图23 选择检测器初始参数表

ElectroPherogram channel电泳通道

选中Acquisition enabled 才能采集并保存数据。Wavelength 框可选择仪器设置时设定时设定的滤光片，Data rate可选 0.5－32HZ（点每秒），窄峰所需的采集速率越高。

Filter 滤波

滤波指用不同的算法对采集的数据进行处理，和滤光片不同，主要用于过滤

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干扰数据分析的外来噪音。High sensitivity应用于高灵敏度但会损失分辨率；而High Resolution 应用于高分辨率但会损失灵敏度；Normal 用于一般的分析,可兼顾灵敏度和分辨率。滤波选择时需要知道每个峰组成的点数, 最佳的点数为 16 - 25，同时也存在“less than 16”和‖more than 25”的选项。可以调节采集速率使典型的峰有I6 - 25点，使滤波效果达到最佳。

Relay l和Relay 2

P/ACE MDQ的两个继电器接口可以控制和触发外部设备，这个对话框用于设定方法开始时的状态，这些状态也可在时间程序中设定。其他详细的情况请参看安装维护手册。

Absorbance Signal吸收信号

这个参数有两个选择，Direct和Indirect。当分析物比背景电解质有更高的吸收时选 Direct（直接）；当分析物比背景电解质的吸收低时选 Indirect（间接），这样能同样得到向上的峰。

在这一练习中按图23所示设置UV检测器的初始参数。

PDA Detector Initial Conditions 二极管阵列检测器初始参数

图24 仪器设置—PDA检测器初始参数

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Electropherogram Scan Data扫描数据

这一部分控制三维数据 （3D）的采集。如果需要采集3D数据则必须选中Acquisition enabled， Data rate可选择0.5到32Hz，窄峰所需的采集速率要高，采集速率高则数据量也大。Scan range的范围从190 - 600。

Filter滤波

参照UV检测器的设定。 Relay l and Relay 2

参照UV检测器的设定。 Reference Channel

参照附录的说明 Absorbance Signal

参照UV检测器的设定。 Electropherogram Channel Data

在采集3D数据的同时最多能再采集三个独立通道的数据。必须输入以下参数。

Acquisition enabled：可采集数据 Reference channel：参比通道 Wavelength：波长

Bandwidth：谱带宽，数值大则信噪比增加，数字小则选择性增加。 Peak detect：峰检测

在这一练习中按图24设定PDA检测器初始参数 Multi－Egram：

图25 仪器设定—多通道图谱表

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允许采集和3D数据独立的多通道数据。详细说明请参考英文使用手册附录。

LIF Detector Initial Conditions 激光诱导荧光检测器初始参数设定

图26 仪器设定-LIF 检测器初始参数

Electropherogram Channel 1 and 2

LIF检测器可同时使用一个或两个采集通道。当有非贝克曼的激光源时可使用其中的

一个通道。在我们的练习中只使用一个通道。

Acquisition enabled允许采集数据。

Dynamic range设定信号的范围。高的设定值使响应高的信号不会出现平头峰，但会损失灵敏度，小的设定值正好相反。默认值是100。

Signal信号。在非荧光背景电解质中分离荧光物质时选择Direct（直接）；在荧光

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背景电解质中分离非荧光物质时选择Indirect（间接）。 Data Rate采集数据的频率，两个通道必须一致。 Relay 1 and 2 继电器 1和 2。

在这一练习中LIF检测器的参数和图26一致。

Time Program时间程序

图27 仪器设定—时间程序表

时间程序窗象电子表格，每一行是一个事件，每个事件按预序执行。每一行有以下几列组成。 Time：事件发生的时间 Event：进行的动作 Value：值的设定和动作相关 Duration：动作延续的时间

Inlet and Outlet Vial：事件过程中毛细管两端的位置。 Summary：系统对事件的描述 Comments：使用者对事件的描述

时间不是必需的参数。无时间限制的事件按从上往下的顺序执行，上一事件执行完毕后再执行下一事件。有时间限制的事件按时间质序执行，但无时间限制的事件必须在有时刻的事件前进行，数据采集在0.00时刻开始，直到STOP DATA事件执行。

点击EVENT框的图标打开事件选择列表。

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图28 事件选择列表

以下将描述练习中所选择的事件，其他信息请看附录。 Separate

分离对话框设定分离参数，每个方法必须有一个分离事件。一般在0.00时刻发生。

图29 分离对话框

需要设定以下参数

Separation Type：电泳分离可控制电压、电流或功率恒定。电压和电流不能超过初始条件中设定的限制。分离可用气压或真空，也可在使用电压、电流或功率时加气压或真空。

Polarity：决定电流方向。可按所示选择电流的正反向。

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Values：参数值，选择的分离类型不同；要求输入的参数也不同。Ramp time只用于电场分离，指电压、电流或功率从当前值到设定值的变化时间。

Tray positions：瓶子位置可点击 Trays（托盘）按纽进入位置对活框选择，也可直接输入。

图30 选择瓶子位置对话框。

Pressure Direction：是否使用压力或真空。压力可在两端同时加，真空只能加在其中任意一端。

At Time： 决定是否为有时间限制的事件，分离事件一般为有时间限制的事件。 External Adapter： 改变仪器控制高压电源的方式，只有在使用外部接口时才使用此项，详细情况请参看安装维护手册。 Rinse

冲洗事件用于清洗毛细管、加载缓冲液和分离介质。

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图31 冲洗对话框

包含以下参数：

Pressure Type：选择冲洗方式

Tray Positions：和分离事件中的功能相同 Values：冲洗强度参数（压力和时间） Pressure Direction：压力或真空的方向 At Time：参看分离事件中的描述。

Inject：进样事件用于加载样品，一般为在分离事件之前的无时间限制的事件。

图32 进样对话框

包含以下参数：

Injection Type：可以采用压力、真空或电动进样 Polarity：电进样时电极的电流方向 Pressure Direction：压力和真空的加载方向 Values：进样的强度（压力和时间）

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Tray Positions：参看分离事件中的描述

Sequence Table：如果用序列表，选中该项可以在序列表中修改进样参数。

可以使用多次进样。 Autozero

图33 自动调零对话框

将检测器的输出调零，限制时间可有可无。 Stop Data

图34 停止数据对话框

数据采集从0.00分钟开始，一直到Stop Data 事件发生。这是一个有限制时间的事件。 End

图35 结束对话框

结束事件是有限制时间的事件。

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按照以下步骤建立时间程序。该程序包括： ．多溶液再生毛细管 ．装载缓冲液

．进样 ．分离 ．运行后冲洗

所需的试剂和摆放位置见下表 表5 溶液 标样 再生液 重蒸水 运行缓冲液A 空瓶

点击时间程序表，点击事件框和向下箭

，从下拉菜单选择Rinse，点击Trays

左边缓冲液托盘 C1 D1 E1 A1， A2 右边缓冲液托盘 A1 B1 按钮，选择进口（左）为 D1，出口（右）为 B1，点击 OK回到冲洗对话框，使用默认的参数并点击OK回到时间程序表。主要的参数已自动输入到表格中，这是无限制时间的事件，所以时刻窗口中没有值。

在下一行建立新的冲洗事件，选择从 BI：E1到 BO：B1；持续时间为 0.5分钟。

再建立一行冲洗事件加载缓冲液，选择从BI：A1到BO：B1，压力为25psi，持续1分钟。

点击事件栏，选择进样事件。进样从 BI：C1到 BO：A1，压力为 0.4psi，时间为3秒。

下面可进入分离事件。点击事件栏选择Separate事件。位置为BI：A2和BO：A1；选择电压分离；电压为30KV，ramp time为0.2分钟，持续时间为6分钟。选中 At time按钮，设定时刻为 0.00分钟。点击 OK回到时间程序表。在时间程序中有后冲洗步骤，固此需要 Stop Data事件。点击事件栏选择 Stop Data，

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在时刻中输入 6.00；使采集数据在 6分钟的时候停止。

最后一个事件是冲洗。 从 BI：E1到 BO：B1，压力为 20psi，持续 1分钟，在 6分钟时开始。

可以在分离事件开始以后进行调零事件，在新的事件栏选择Autozero，时间为1.00。在输入完成后它会自动移到正确的时间位置。 到此，时间程序设置如图36。

图36 仪器设置—时间程序

仪器设置的参数可进行修改，只要鼠标点击响应的区域就可实现。

重要的是：参数设置完成后要保存你所编辑的方法。选择FILE / METHOD /SAVE AS， 并按给方法予命名。

默认的目录路径是d：\\32 Karat \\ Projects \\Default \\ Methods。

方法现在已可以运行了。

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第六章 系统运行

Single Run单个运行

在上一节中我们建立了一个仪器方法，在这个练习中我们将以单独运行的模式运行方法。在这个模式下；方法必须手工地被用户在每次运行前启动。单个运行的模式在方法建立中是有用的。可根据运行的结果对方法或另外的过程进行修正。在这节的第二部分我们将创建序列做多个样品的运行。必须在联机的状态下进行样品运行和数据采集。如果不是联机的，会在仪器窗口的标题栏出现“（Offline）”。在继续前关闭任何离机的窗户。从32 Karat软件的主屏幕，双击仪器图标进入联机状态。

注意

检测器的光源或激光光源必须在开始一个方法运行以前打开。灯或激光光源的状态可从直接控制屏幕看到。UV灯可以在那里打开。如果激光光源部件的电源开关已经打开，并且所有的安全联锁已经关闭，激光光源可以从直接控制屏幕打开。

所需材料：

在直接的控制练习中准备的毛细管卡盘，毛细管规格为直径75 urn，总长度为60cm（到检测器的长度为50cm）。（请参看安装和维护手册关于新装卡盘和毛细管的介绍。）

．毛细管再生液A （1M氢氧化钠 P／N 33842 4） ．运行缓冲液A （P/N 338426） ．重蒸水（HPLC级） ．2 mL小瓶和红瓶塞 ．36位缓冲液托盘

．UV或PDA检测器：混合标样B（P/N 501333）

．LIF 488 nrn氩离子激光： LIF检测器混合标样（P／N 477615） ．LIF 635 nrn 半导体激光：LIF检测器混合标样（P/N 726022）

按下表放置试剂：

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表6 溶液 标样 再生液 重蒸水 运行缓冲液A 空瓶

从菜单选择 Control / Single Run或点击图标图37 单个运行采集对话框

打开单个运行对话框：

左边缓冲液托盘 C1 D1 E1 A1， A2 右边缓冲液托盘 A1 B1

你必须提供：Sample ID, Method和Data file。数据文件将保存在数据路径指定的目录下。Sample ID用于内部标识样品。这个标识将在以后的报告中出现。可以点击打开图标

选择正确的方法。在本统习中选择方法编辑中建立的

方法。数据路径和方法的选择一样；不过选择的是文件夹而不是文件。数据文件

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可在方框中直接输入。但不能与数据路径中的文件重名，如果这样，方法将不会运行。其它的项目在方法运行中无需输入。

至此点去Start；系统会先检查方法是否和仪器设置相符，然后将方法传输到P／ACE MDQ主机，经仪器自检，然后再执行方法。

如果方法不能被执行，或是所得谱图和范例中不一致时，请检查以下几点：

．·缓冲液瓶中的液体是否正确。 ．·缓冲液小瓶的位置是否和方法一致。

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．·选择的方法是否正确。 ．·方法和仪器设置是否一致 ．·方法是否正确 ．·托盘的设置是否一致

这一方法将用于以后的其它练习，请在得到正确的结果后再进行后面的练习。

Programming a Sequence 设计一个序列

应用序列表可以自动运行成批的样品,能用于采集数据和数据处理。在这一练习中将建立序列采集多次的数据。必须在“online”状态下进行。

建立新的序列，从仪器窗口选择File / Sequence / New，打开序列向导，共有5个屏幕，不同的序列会用到不同的屏幕，这一练习不需要用到所有的细节。

图38 序列向导—方法对话框

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第一屏幕需要选择方法，点击图标 找到在上一练习中建立的方法。

由Data file type 中选择For acquisition， 点击Next。

图 39 序列向导—未知样品对话框

这一屏幕需要输入Sample ID 和Data File ID。 在Sample ID 栏中直接输入文本信息，点击右边的蓝色箭头会打开下面的菜单。

图40 样品ID选项菜单

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