鸡柔嫩艾美耳球虫的分离与鉴定研究 - 图文

鸡柔嫩艾美耳球虫的分离与鉴定研究

作者 曹元元，郭维维，龚加路，刘林帅，杨乐乐，张乐乐 指导教师 葛凯

摘要：取具有球虫病典型症状的病鸡，刮取其盲肠内容物，用离心沉浮法收集鸡球虫卵囊，加入适量的2.5%重铬酸钾溶液，置于29℃±1℃的恒温培养箱中培养，定时观察卵囊的发育情况，并测量卵囊的大小，结合病鸡的临床症状和病理变化，计算卵形大小等形态指标，经差异显著性检验(F检验)，结果差异不显著，而且观察病鸡病理变化，初步鉴定分离到的鸡球虫为柔嫩艾美耳球虫。

关键词：鸡，柔嫩艾美耳球虫，分离，鉴定

The Isolation and Identification of Eimeria tenella in

Chicken

Abstract: Take a typical symptom of coccidiosis in chickens, scraping the cecal contents, were collected by centrifugation ups and downs of chicken coccidia oocysts, adding an appropriate amount of 2.5% potassium dichromate solution, placed in 29 ℃ ± 1 ℃ in the Constant temperature incubator, regular observation of the development of oocysts, and to measure the size of oocysts, with chickens in the clinical symptoms and pathological changes in laboratory measurements obtained from chickens infected with oocysts body size, egg size calculation form Indicators, the significant difference test (F test), the result was not significant, and the observed pathological changes in chickens, isolated from the chicken identified as Eimeria tenella.

Key words: chicken, Eimeria tenella, isolation, identification

鸡球虫分布范围广，危害大，严重威胁养禽业的发展，每年给全世界养禽业造成超过20亿英镑的直接经济损失，我国在这方面虽无准确的统计，但由于鸡只饲养规模大、数量多，加之管理粗放，鸡球虫病造成的经济损失相当惊人[2]，因此，许多学者致力于球虫病的研究。集约化养鸡场是球虫病暴发的最适宜场所，其发病率可高达80%以上[3]。鸡球虫病的病原为原虫中的艾美耳科艾美耳属的球虫。鸡球虫病(Coccidiosis)是由多种艾美耳球虫寄生于鸡的肠上皮细胞引起的一种原虫病。本病分布广泛,感染普遍,是鸡群中最常见的,也是危害最严重的寄

[1]

生虫传染病。据报道，世界各国已经记载的鸡球虫种类共有13种之多，我国已发现7种鸡球虫，不同种的球虫，在鸡肠道内寄生部位不一样，其致病力也不相同。其中致病力最强的为柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)，寄生于盲肠，其次为毒害艾美耳球虫(E.necatrix)。在自然发病情况下，多系混合感染，而以某一种占优势。为了研究的方便及研究结果的准确性，往往应用纯种[5]。应用单卵囊分离技术[7]，可进行鉴别球虫的种类和建立球虫的纯种体系。尽管目前分子生物学技术等一些高科技手段已用于鸡球虫种类鉴定方面的研究，但传统的形态学鉴定方法仍然是不可缺少，并且是可靠的。皖西地区的养鸡业趋于集约化和规模化，鸡球虫病的仍普遍发生。为此我们对皖西地区鸡球虫的种类进行初步鉴定，对进一步研究球虫的致病性，药物效应和机体对球虫的免疫性等均有重要的意义。 1 材料与方法 1.1 实验材料

六安市附近某养鸡场提供一只典型球虫病鸡。 1.2 试剂和仪器

2.5%重铬酸钾溶液、饱和食盐水溶液、生理盐水、吸管、40目铜丝筛、260目尼龙筛、研钵、平皿、双目生物显微镜（型号:XS-200,江南光电集团）、低速离心机（型号：800，江苏天由有限公司）、电热恒温培养箱等。 1.3 卵囊的分离与培养

取病鸡盲肠，刮取其内容物和黏膜，研碎后加生理盐水搅匀，经40目铜丝筛和260目尼龙筛过滤，滤液2000r/min，离心10min，收集沉淀。沉淀置2.5%重铬酸钾溶液中，在29℃恒温培养箱内培养成熟，然后将成熟的卵囊液置4℃冰箱中保存备用。

1.4 球虫卵囊的接种 1.4.1 显微镜镜检球虫卵囊数

取冰箱中在4℃保存的孢子化卵囊悬液，2000r/min，10min，弃上清，同上速度和时间离心3~4次，洗去重铬酸钾;加饱和食盐水漂浮，吸取上层漂浮液于另一离心管中，加人大量生理盐水离心沉淀，弃上清，再加生理盐水离心(速度和时间同上)，然后将最终沉淀(卵囊悬液)做倍比稀释。

用牙签沾取稀释后的卵囊液，点在载玻片上，显微镜下观察，利用血球记数

板记数，观察卵囊中子孢子的成熟程度，卵囊中有4个子孢子形成，说明此球虫已经具有感染性。 1.5 虫种鉴定

观察1.4.1中获得卵囊形状、颜色、大小等特征，记录最短孢子化时间，并分别随机测量50个孢子化卵囊，孢子囊大小，并将测量数据进行差异显著性检验(F检验)。参阅有关文献进行虫种鉴定[3-8]。 2 结果与分析

2.1 分离和经培养后的球虫卵囊

如图1和图2所示。

图1：未孢子化的球虫卵囊

图2：孢子化的球虫卵囊

2.6 球虫种类的鉴定

显微镜下观察未孢子化卵囊，多呈宽卵圆形，少数卵圆形，壁光滑，呈淡绿色，原生质呈淡褐色，卵囊最短孢子化时间为18h；孢子化卵囊，未见卵膜孔和卵囊残体。随机测量50个两代孢子化卵囊和孢子囊大小，数据见表1。

表l 卵囊的测量结果

卵囊大小(μm) 19.50~26.00×

资料一

16.50~22.80 16.00~27.00×

资料二

15.00~24.00 17.50~30.00×

资料三

12.50~25.00 15.00~25.00×

资料四

12.50~18.75 15.18~22.77×

第一代

17.71~22.77

18.98×20.24

4.40~7.25

[8][6][4][3]

平均(μm) 孢子囊大小(μm) 平均(μm)

22.00×19.00 _____ _____

0.00~13.00×

21.00×16.50

4.50~7.50 10.00~13.00×

21.80×17.29

5.00~7.50 10.00~12.50×

20.16×15.59

4.38~6.88

10.12~12.90×

12.20×6.00

11.49×6.35

11.64×5.86

11.51×5.99

通过和文献[3]、[4]、[6]、[8]比较，本次实验测得的卵囊大小在文献记载范围之内。

综上所述，我们从卵囊的形态、大小、颜色等一系列特征出发，结合本次病理变化等结果，可以认为本次从养鸡场鸡体内分离的球虫是柔嫩艾美耳球虫。 3 讨论

3.1 形态学方法在柔嫩艾美耳球虫的分离与鉴定中的应用

传统的形态学方法在球虫的分离与鉴定中准确性高，对虫种的鉴定具有可靠性。据资料报道[4]，我国公认存在的9种鸡球虫，其卵囊只有大小的差别，其它方面区别不明显，如形态、构造、颜色等不易区别，而且它们均无卵膜孔和极

帽等，因此仅仅根据粪便中卵囊的上述特征来鉴定虫种是比较困难的。但是不同种球虫主要寄生部位是不同的，收集新鲜的卵囊，待培养形成孢子化卵囊后，观察卵囊的大小、形状、颜色，解剖发病鸡，并结合感染鸡的病变和球虫寄生部位进行鉴定，这种鉴定方法是球虫种类鉴定中行之有效的方法[3-8]。

3.2 柔嫩艾美耳球虫显著的特征是寄生于盲肠和临床上出现明显的血便，我们分离获得的这株球虫具有此特征，其卵囊结构、测得的卵囊和孢子囊大小、形状和孢子发育最早时间均在文献记录的范围。因此，可鉴定这株纯种球虫为柔嫩艾美耳球虫。

3.3 柔嫩艾美耳球虫的致病性在不同地方株之间有明显差异

本次分离获得的纯种柔嫩艾美耳球虫，是鸡场最常见的球虫种类之一，致病力强，严重感染时造成鸡的死亡率较高，本试验感染的鸡仔有明显的病理变化。因此，本次分离获得的柔嫩艾美耳球虫可作为实验室强毒标准株，为免疫研究中提供攻毒虫体和球虫致弱的原代虫体具有重要意义。与其他地方球虫株进行比较

[7]

，本次所分离出来的球虫为典型的柔嫩艾美耳球虫，寄生于鸡肠道部分的盲肠

部位，对盲肠有很大的侵害作用。

3.4 柔嫩艾美耳球虫的分离与鉴定的一些相关的先进技术

Chapman等[9]对球虫单卵囊技术进行过研究和报道。国内学者田广孚 [10] 等曾用8cm高的DEAE—52纤维素柱，以pH为8.0的甘氨酸缓冲液作为洗涤液对柔嫩艾美耳球虫进行了提纯。但因需要特殊仪器，操作技术繁杂，一般设备条件下根本无法办到。在生物化学方法上，用胃蛋白酶消化盲肠道组织，铜筛过滤除去大颗粒杂质后，以1.1mol/mL蔗糖离心漂浮卵囊，然后用小于0．5mol/mL蔗糖溶液反复漂洗，最后以5%次氯酸钠消毒处理，获得了大量纯化柔嫩艾美耳球虫卵囊[14]。

目前球虫研究已进入分子水平，如抗原基因的克隆和表达、基因工程疫苗的研制、球虫侵入相关基因以及球虫持家基因的研究等。包括柔嫩艾美耳球虫卵囊cDNA文库的构建[14]，构建cDNA表达文库理论上含有该生物体的所有表达基因,可表达与天然蛋白相似的重组蛋白。建立cDNA表达文库在一次永久保存基因资源的同时,可以利用功能筛选、免疫学筛选、药物探针筛选和大规模序列测定等现代分子生物学技术寻找特异性活性蛋白基因,进而克隆和表达这些基因研究其功能。目前这一技术已成为发现新的功能蛋白的重要手段，已利用杂交技术及RAPD

方法鉴定并获得了一株柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）不同地区分离株的杂交虫株[15],在此基础上本研究构建了柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）杂交虫株F2 cDNA表达文库,为进一步利用其进行基因筛选工作奠定了基础。 3.5 皖西地区鸡柔嫩艾美耳球虫的鉴定

我们用球虫卵囊人工感染雏鸡,分离和鉴定球虫[11]，主要是根据球虫卵囊的形态、大小、颜色等特征，结合人工试验的过程及其病理变化等结果，并对试验中卵囊进行测量和比较进行的，本次试验获得的指标与有关资料基本一致，少量数据出现偏大或偏小，可能因为皖西地区长期使用药物防治鸡球虫病，而出现耐药虫株变异所致，具体原因有待进一步探讨。 4 结论

4.1 应用传统的形态学方法分离并鉴定鸡球虫，方法简便可行，结果可靠性强。 4.2 本次实验从皖西地区养鸡场分离出一株鸡球虫卵囊，寄生部位在鸡盲肠段，

初步鉴定为柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）。

4.3 通过实验观察研究，分离出的柔嫩艾美耳球虫具有很强的致病力。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/60qr.html