生化题目整理版

生物化学1996年

1. 请根据功能对蛋白质分类，并举例说明。（10分）

1.酶enzyme：核糖核酸酶、胰蛋白酶、过氧化氢酶、苹果酸梅。

2.调节蛋白regulatory protein：胰岛素、促生长素、促甲状腺素、乳糖阻

抑物。

3.转运蛋白transport protein：血红蛋白、葡萄糖转运蛋白、血清清蛋白。 4.贮存蛋白storage protein：卵清蛋白、酪蛋白、铁蛋白。

5.收缩和游动蛋白contractile and motile protein：肌动蛋白、肌球蛋白、动力蛋白和驱动蛋白。

6.结构蛋白structural protein：胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白。 7.支架蛋白scaffold protein：胰岛素受体底物-1（IRS-1）、A激酶锚定蛋白（AKAP）、信号传递转录激活剂（STAT）。

8.保护和开发蛋白protective and exploitive protein：免疫球蛋白、凝血酶、血纤蛋白原、抗冻蛋白、蛇和毒蜂蛋白。

9.异常蛋白exotic protein：应乐果甜蛋白、节肢弹性蛋白。 2. DNA的变性与蛋白质变性有何不同，理由是什么？（10分）

DNA变性是破坏碱基堆积力和氢键的相互作用,实质是DNA双螺旋区的氢键的断裂,不涉及共价键的断裂,由双链变为单链.DNA变性需要达到一定温度,而降温到退火温度后会复性.

蛋白质变性是在某些物理和化学因素作用下,其一级结构不变,高级结构改变,从而改变或者失去生物活性的现象.能使蛋白质变性的化学方法有加强酸、强碱、重金属盐、尿素、乙醇、丙酮等；能使蛋白质变性的物理方法有加热、紫外线及X射线照射、超声波、剧烈振荡或搅拌等.

1.引起DNA变性的原因是高温,引起蛋白质变性的有上述物理因素和化学因素等等。2.DNA变性破坏的是氢键.蛋白质变性破坏的是高级结构,涉及到氢键,疏水键,二硫键,盐键等.3.DNA变性后缓慢降温一般仍可复性.蛋白质变性后,例如重金属,紫外线,强酸强碱等诱导的无法复性.

3. 列出你所知道的具有DNA外切酶活性的酶及它们在分子生物学研究中的应用。

（10分）

DNA聚合酶I 具有5’→3’和3’→5’外切酶活性 ，在切除因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起着重要作用。也可以除去冈崎片段5’端RNA引物，使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶将片段连接起来。

DNA聚合酶ＩＩ 具有3’→5’外切酶活性 起校正作用，修复DNA DNA聚合酶γ（线粒体），具有3’→5’外切酶活性，线粒体DNA的复制 DNA聚合酶δ（核内），具有3’→5’外切酶活性，参与前导链和后随链的合成

DNA聚合酶ε（核内） 具有3’→5’外切酶活性 除去RNA引物

4. 举例说明蛋白质天然构象的信息存在于氨基酸顺序中。（12分）

蛋白质的高级结构的形成是依靠氨基酸分子的侧链集团之间的非共价键

维持而成.如氢键,范德华力等,此外半胱氨酸中的硫可形成共价键维持空间结构,此外二级结构的A螺与B折叠都是临近氨基酸侧链之间亲合或者静电维持的,所以说,一级结构决定了蛋白的高级结构. 5. 以图示说明：（22分）

a. 真核生物基因表达的调节，指出哪些在细胞核中进行，哪些在胞质中进

行。

真核生物基因表达调控与原核生物有很大的差异。原核生物同一群体的每个细胞都和外界环境直接接触，它们主要通过转录调控，以开启或关闭某些基因的表达来适应环境条件（主要是营养水平的变化），故环境因子往往是调控的诱导物。而大多数真核生物，基因表达调控最明显的特征时能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现“预定”的，有序的，不可逆的分化和发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常的生理功能。真核生物基因表达调控据其性质可分为两大类：第一类是瞬时调控或叫可逆调控，相当于原核生物对环境条件变化所做出的反应。瞬时调控包括某种代谢底物浓度或激素水平升降时及细胞周期在不同阶段中酶活性和浓度调节。第二类是发育调节或称不可逆调控，这是真核生物基因表达调控的精髓，因为它决定了真核生物细胞分化，生长，和发育的全过程。据基因调控在同一时间中发生的先后次序，又可将其分为转录水平调控，转录后的水平调控，翻译水平调控及蛋白质加工水平的调控，研究基因调控应回答下面三个主要问题：①什么是诱发基因转录的信号？②基因调控主要是在那个环节（模板DNA转录，mRNA的成熟或蛋白质合成）实现的？③不同水平基因调控的分子机制是什么？

回答上述这三个问题是相当困难的，这是因为真核细胞基因组DNA含量比原核细胞多，而且在染色体上除DNA外还含有蛋白质,RNA等，在真核细胞中，转录和翻译两个过程分别是在两个彼此分开的区域：细胞核和细胞质中进行。一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链；真核细胞DNA与组蛋白及大量非组蛋白相结合，只有小部分DNA是裸露的；而且高等真核细胞内DNA中很大部分是不转录的；真核生物能够有序的根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，并能根据需要增加细胞内某些基因的拷贝数等。尽管难度很大，科学家们还是建立

起多个调控模型。

转录水平的调控

Britten和Davidson于1969年提出的真核生物单拷贝基因转录调控的模型——Britten—Davidson模型。该模型认为在整合基因的5’端连接着一段具有高度专一性的DNA序列，称之为传感基因。在传感基因上有该基因编码的传感蛋白。外来信号分子和传感蛋白结合相互作用形成复合物。该复合物作用于和它相邻的综合基因组，亦称受体基因，而转录产生mRNA，后者翻译成激活蛋白。这些激活蛋白能识别位于结构基因（SG）前面的受体序列并作用于受体序列，从而使结构基因转录翻译。

若许多结构基因的临近位置上同时具有相同的受体基因，那么这些基因就会受某种激活因子的控制而表达，这些基因即属于一个组（set），如果有几个不同的受体基因与一个结构基因相邻接，他们能被不同的因子所激活，那么该结构基因就会在不同的情况下表达，若一个传感基因可以控制几个整合基因，那么一种信号分子即可通过一个相应的传感基因激活几组的基因。故可把一个传感基因所控制的全部基因归属为一套。如果一种整合基因重复出现在不同的套中，那么同一组基因也可以属于不同套。

染色质结构对转录调控的影响

真核细胞中染色质分为两部分，一部分为固缩状态，如间期细胞着丝粒区、端粒、次溢痕，染色体臂的某些节段部分的重复序列和巴氏小体均不能表达，通常把该部分称为异染色质。与异染色质相反的是活化的常染色质。真核基因的活跃转录是在常染色质进行的。转录发生之前，常染色质往往在特定区域被解旋或松弛，形成自由DNA，这种变化可能包括核小体结构的消除或改变，DNA本身局部结构的变化，如双螺旋的局部去超螺旋或松弛、DNA从右旋变为左旋，这些变化可导致结构基因暴露，RNA聚合酶能够发生作用，促进了这些转录因子与启动区DNA的结合，导致基因转录，实验证明，这些活跃的DNA首先释放出两种非组蛋白，（这两种非组蛋白与染色质结合较松弛），非组蛋白是造成活跃表达基因对核算酶高度敏感的因素之一。

更多的科学家已经认识到，转录水平调控是大多数功能蛋白编码基因表达调控的主要步骤。关于这一调控机制，现有两种假说。一种假说认为，真核基因与原核基因相同，均拥有直接作用在RNA聚合酶上或聚合酶竞争DNA结合区的转录因子，第二种假说认为，转录调控是通过各种转录因子及反式作用蛋白对特定DNA位点的结合与脱离引起染色质构象的变化来实现的。真核生物DNA严密的染色质结构及其在核小体上的超螺旋结构，决定了真核基因表达与DNA高级结构变化之间的必然联系。DNA链的松弛和解旋是真核基因起始mRNA合成的先决条件。

转录后水平的调控

真核生物基因转录在细胞核内进行，而翻译则在细胞质中进行。在转录过程中真核基因有插入序列，结构基因被分割成不同的片段，因此转录后的基因调控是真核生物基因表达调控的一个重要方面，首要的是RNA的加工、成熟。各种基因转录产物RNA，无论rRNA、tRNA还是mRNA，必须经过转录后的加工才能成为有活性的分子。

翻译水平上的调控

蛋白质合成翻译阶段的基因调控有三个方面：①蛋白质合成起始速率的调控；② MRNA的识别；③激素等外界因素的影响。蛋白质合成起始反应中要涉及到核糖体、mRNA蛋白质合成起始因子可溶性蛋白及tRNA，这些结构和谐统一才能完

成蛋白质的生物合成。mRNA则起着重要的调控功能。

真核生物mRNA的“扫描模式”与蛋白质合成的起始。真核生物蛋白合成起始时，40S核糖体亚基及有关合成起始因子首先与mRNA模板近5’端处结合，然后向3’方向移行，发现AUG起始密码时，与60S亚基形成80S起始复合物，即真核生物蛋白质合成的“扫描模式”。

mRNA5’末端的帽子与蛋白质合成的关系。真核生物5’末端可以有3种不同帽子：0型、I 型和 II 型。不同生物的mRAN可有不同的帽子，其差异在于帽子的碱基甲基化程度不同。帽子的结构与mRNA的蛋白质合成速率之间关系密切：①帽子结构是mRNA前体在细胞核内的稳定因素，也是mRNA在细胞质内的稳定因素，没有帽子的转录产物会很快被核酸酶降解；②帽子可以促进蛋白质生物合成过程中起始复合物的形成，因此提高了翻译强度；③没有甲基化(m7G)的帽子(如GPPPN-)以及用化学或酶学方法脱去帽子的mRNA，其翻译活性明显下降。 mRNA的先导序列可能是翻译起始调控中的识别机制。可溶性蛋白因子的修饰对翻译也起着重要的调控作用。

b.哺乳动物的ATP循环，请解释为什么说ATP是“自然界的货币”。 6. 如何运用DNA序列分析方法确定DNA序列中与蛋白质结合的区域？（12分）

7. 生物膜的不对称的拓扑结构是由什么维持的？它对生物膜的哪些功能是必需的？（12分）

1.膜脂在磷脂双分子层中呈不均均分布 其中糖脂呈完全不对称分布 全部分布在外层 作为细胞识别的抗原 是细胞识别和信号转导等生理功能的物质基础 其他种类的膜脂也呈现不对称分布 但生理功能暂不明确 .

2.膜蛋白的不对称分布是生物膜完成复杂的在时间与空间上有序的各种生理功能的重要结构基础.膜蛋白的不对称分布是生物膜完成复杂的在时间与空间上有序的各种生理功能的重要结构基础.如细胞表面的受体和载体蛋白,都是按照一定的方向传递信号和转运物质,与细胞膜相关的酶促反应也都发生在膜的某一侧面,特别是质膜上的糖蛋白,其糖残基全部分布在外表面.

8. C3植物和C4植物有何差别？有人提出用基因工程手段将C3植物改造成C4植物，你觉得是否可行？为什么？（12分）

1．形态结构的区别 两类植物在叶绿体的结构及分布上不同（见表1），因C3植物的维管束不含叶绿体，叶脉颜色较浅；C4植物的维管束含叶绿体，叶脉绿色较深有呈“花环型”的两圈细胞。2．光合作用途径的区别 C3植物与C4植物在光反应阶段完全相同，都通过光反应产生O2、[H]（实质是NADPH）和ATP，为暗反应阶段提供同化力[H]和ATP。但其暗反应途径不一样3．光合作用产物积累部位的区别 C3植物整个光合作用过程都是在叶肉细胞里进行的，光合作用的产物只积累在叶肉细胞中。C4植物中C4途径固定的CO2转移到C3途径是在维管束鞘细胞中进行的，光合作用的暗反应过程也是在维管束鞘细胞中进行的，光合作用的产物也主要积累在维管束鞘细胞中。 4．适应能力的区别 一是因C4植物叶肉细胞的叶绿体固定CO2的酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（简称PEP羧化酶）与CO2的亲和力强于C3植物叶绿体内固定CO2的酶。 二是C4植物与C3植物相比，光照较强时，其光呼吸明显弱于C3植物，因而在光照较强的环境中，前者的产量较高。 基于以上原因，在高温、光照强烈和

干旱的条件下，绿色植物的气孔关闭。此时，C4植物能够利用叶片内细胞间隙中含量很低的CO2进行光合作 用、光呼吸较弱，而C3植物不仅不能利用细胞间隙中的CO2进行光合作用、光呼吸也较强，因而，C4植物比C3植物更能适应高温、光照强烈和干旱的环境。

1997年

一、名词解释：（40分）

1、蛋白质的去折叠与再折叠：去折叠和重折叠亦即蛋白质的变性和复性。蛋白质的折叠状态只有在最适条件下才可存在。环境的改变，诸如温度、pH、变性剂、压力等作用都可使蛋白质的结构被破坏。

2、差向异构体：在立体化学中，含有多个手性碳原子的立体异构体中，只有一个手性碳原子的构型不同，其余的构型都相同的非对映体

3、冈崎片段：DNA复制过程中，两条新生链都只能从5'端向3'端延伸，前导链连续合

成。后随链分段合成。这些分段合成的新生DNA片断称冈崎片断。细菌冈崎片断长度1000~2000核苷酸，真核生物冈崎片断常速100~200核苷酸。

4、信号肽：是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短（长度5-30个氨基酸）肽链。常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N端）。 5、RNA－酶：催化RNA水解的一种核酸内切酶 6、抗体酶：具催化能力的免疫球蛋白。

7、Z－DNA：Z型DNA，是DNA双螺旋结构的一种形式，具有左旋型态的双股螺旋（与常见的B-DNA相反），并呈现锯齿形状。 8、酮体：在肝脏中由乙酰CoA合成的燃料分子（β羟基丁酸，乙酰乙酸和丙酮）。在饥饿期间酮体是包括脑在内的许多组织的燃料，酮体过多会导致中毒。

二、何谓同工酶？试述同工酶分析的原理及应用。（12）

酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂。在生物体内，有一些酶催化相同的反应，但其结构不同。它们对底物的浓度、pH、温度等的最适要求不同，酶活力的调控反应及其所在的细胞分布也不一样。把催化相同反应而结构和理化性质不同的酶的分子类型称为同工酶（isozyme）。 同工酶概念的提出，揭示了不同生物、同一生物不同器官和不同组织起源的酶可作用于同一底物，催化相同的反应，但在其他性质方面可以不尽相同。大量研究表明，同工酶在生物界是广泛存在的。在动植物和微生物体中、同一物种的不同个体、同一个体的不同器官、组织和细胞、同一细胞的不同部位、生长发育的不同阶段、不同的代谢条件下，都有不同的同工酶分布。现在已发现的酶中，有一半以上的酶已经发现有同工酶存在。可以进行同工酶分析的酶已有100多种。不同同工酶可以根据电泳迁移率予以区别和编号，以向阳极方向泳动最快的编为同工酶1。

从分子结构上看，同工酶的形成有以下学说或原因：

（一）亚单位结构学说 亚单位结构学说是研究同工酶理论并对作用机理阐述的较为

透彻的学说之一。该学说认为同工酶是由不同亚基按不同方式结合而成的。这个学说有广泛的实验证据。如已经证明乳酸脱氢酶（LDH）是由A、B两个亚基，按不同比例结合成的四聚体，所以有5种同工酶：LDH1（A4）、LDH2（A3B1）、LDH3（A2B2）、LDH4（A1B3）、LDH5（B4）。 （二）不同基因编码 由不同的基因或等位基因编码会形成一级结构完全不同或有个

别氨基酸残基不同的多肽链。因而产生同工酶。由不同基因引起的同工酶存在于同一物种的所有个体中，而由等位基因引起的同工酶以一定比率存在于同一族中。

（三）单一亚单位聚合程度不同 有些同工酶的亚单位是完全相同的，如胆碱脂酶（ChE），但不同的酶分子中，亚基数目不同，这就形成分子量不同的5种同工酶。经研究发现，目前发现的100多种同工酶，其组成比例不同，但以单体（26%）、二聚体（52%）、四聚体（20%）较多，三聚体极少。 （四）多肽链的续发变化 多肽链合成后的续发变化与遗传因素无关。续发变化如果只改变部分分子的非活性中心局部结构、组成或对部分分子影响程度不一，都回产生不同的同工酶。常见的续发改变有脱氨基作用、甲酰或乙酰化作用、巯基氧化、磷酸基团相加、部分肽段脱落、多糖或辅酶的增减。 （五）酶空间构象的差异 组成、结构相同但空间构象不同的酶分子，其暴露在分子外 表的残基不同，会导致其理化性质上的差异，从而形成不同的同工酶。从以上关于同工酶形成的来看，除了续发改变形成的次生同工酶外，可以说同工酶的差异都是由它们的基因决定的。因此同工酶作为基因表现的标记是可靠的。 同工酶多型性研究、原级和次级同工酶的鉴别、同工酶结构与功能关系的研究等，必须将不同的同工酶分子分离，区带电泳是分离同工酶的最佳方法之一，等电聚焦电泳可将一级结构相同而空间构象不同的同工酶分子分离开来，进而

拓宽了该技术的使用范围。通过电泳分离出来的同工酶带，再采用酶组织化学技术染色形成酶谱即可进行分析鉴定。显色的主要方法有以下几种： （一）呈色法 直接利用酶作用于底物产生有色产物。如以无色的磷酸酚酞作为底物，经酸性磷酸脂酶催化水解脱出酚酞，反应系统再改为碱性条件，酚酞即呈红色，直接标出同工酶带。同理，用兰色淀粉可测定淀粉同工酶谱，用联苯胺可测定过氧化物酶同工酶酶谱。

（二）化学反应显色法 采用不同的化学试剂使酶促反应的产物或尚未分解的底物显色，借以指示出酶所在的位置和活力大小。如酯酶作用于萘酯，再用坚牢蓝和该酶反应产物作用显示出褐色，标出酶的位置。又如用化学染色剂NBT（硝基四唑氮蓝）照光后可还原成兰色的甲 ，而超氧化物歧化酶（SOD）分布区域抑制了NBT光还原作用，故在兰色的背景上呈现出清晰的SOD谱带。前者称为阳性染色法，后者为阴性染色法。

（三）电子转移染色法 应用酶将电子转移给染料，通过染料变色显示出酶的区带。此法仅使用于脱氢酶、氧化酶同工酶的染色，如下图所示： （四）荧光染色法 借助酶促反应使无荧光底物变成高荧光的产物或使有荧光的底物转变成荧光熄灭的产物，用荧光仪进行检测。其中又有阳性和阴性染料之分：阳性荧光染料应用较广泛的是4-甲基伞形酮的衍生物。在水解酶催化过程中，在酸性或中性条件下得到的水解产物4-甲基伞形酮，用氨气熏蒸或用碱性缓冲液将反应系统调成碱性，则出现强烈荧光。该法灵敏度高，但易弥散，必须及时检测并记录酶谱。阴性荧光染料是利用还原型NADH和NADPH在紫外线照射下能产生黄色荧光，而氧化态的NAD+和NADP+不产生荧光的原理，在氧化还原酶作用的底物内加入定量的还原态NADH和NADPH，在紫外灯照射下，有没存在区域NADH或NADPH变成氧化态（NAD+或NADP+），显示出暗带或弱荧光谱带。

（五）偶联酶显色法 有些酶促反应的底物或产物均不能显色，在反应体系中加入特异性的酶，即可使产物显色。如要分离鉴定己糖激酶同工酶，可偶联6-磷酸-葡萄糖脱氢酶催化反应，只要检测脱氢酶的电子转移反应，即可测出己糖激酶的存在。

上述显色后的同工酶谱放置时间过长易退色，必须用照相或光电扫描仪等手段适时记录。

免疫化学法是分离同工酶的另外一种方法，多基因位点与复等位基因决定的同工酶间，其氨基酸组成有较大的差异，故有不同的抗原性。利用分离、纯化的同工酶，通过免疫学方法制备出相应的抗血清，再加到同工酶混合样品之中，该抗体即可与相应的同工酶抗原形成免疫复合体沉淀，而将免疫性不同的同工酶留在样品液中，从而达到分离的目的。有时可以从沉淀中回收全部酶活力。如肌酸激酶同工酶，只要测出上清夜中残余酶活力，再从不加抗体样品中测出总活力，两者之差即为被沉淀同工酶的活力。

采用免疫学方法鉴定同工酶，由于抗原抗体反应特异性强，灵敏度高，可对同工酶进行定性、定量分析，但此法仅适用于抗原性差异比较大的同工酶的鉴定。

层析法可用于同工酶之间分子量比较接近，表面电荷差异较大的同工酶的分离。最后用一般酶活测定方法分别测定洗脱液中同工酶的活力。利用亲和层析鉴定同工酶，依据同工酶和相应的配基（如底物、辅酶、抑制剂、抗体等）亲和力不同的原理，将同工酶混合样品液缓缓流过固相配基层析柱，进行亲和吸附，然后再选用不同的缓冲液将吸附程度不同的同工酶顺次洗脱下来，从而达到分离的目的。层析法样品承载量大，操作条件温和、简单，更适于纯化或制备不同型的同工酶，是研究同工酶结构、功能的重要手段。

同工酶技术广泛应用于医学、生理学、分类学、病理学、遗传学及育种学中。同工酶技术在遗传育种中的应用主要体现在种质资源的研究、杂交优势的预测、体细胞融合杂种的鉴定等方面。（1）按照一个基因编码一个同工酶亚基的理论，可以从同工酶的表现型变异而直接推测其基因的变异水平。测定酶活力即可反应出DNA结构差异，甚至是DNA上一个碱基的微小差异。因此，同工酶分析技术是研究物种起源、演化及变异程度的最有价值的手段之一。种质资源在品种改良中的应用，关键在于对收集材料的鉴定研究的程度。对栽培植物和近源野生植物材料同工酶谱进行分离和鉴定，依据同工酶谱相同值大小，直观而科学地确定物种亲缘关系远近，演化过程中的变异程度。（2）在杂种优势的预测中，具有优势的杂种，常出现新的为双亲所不具备的同工酶谱。通过PAGE并染色后会发现，有优势的杂种一代除出现双亲的酯酶谱型之外，还出现了新的“杂种酶带”。这种新酶谱在代谢中，具有比亲代更高的活性。同工酶分析技术还可用于遗传基因定位、远缘杂种鉴定、雄性不育等领域。植物生长发育的不同阶段，不同组织、不同器官不仅酶分子表现出阶段特异性和组织特异性，同工酶也有同样的趋势。种子活力、组织与器官分化、生长及胚胎发育、环境因素和植物激素等均可额影响同工酶的变化，使得同工酶技术在生理学中也得到了广泛的应用。同工酶技术还广泛应用于病理诊断和临床治疗中。同工酶是生物体中的天然标记物，根据同工酶的变化，可以反映生物体的感病情况。如在正常人的血清中，乳酸脱氢酶的存在是LDH2＞LDH1＞LDH3＞LDH4＞LDH5。若LDH1失常即LDH1＞LDH2，为急性心肌梗塞、心肌损伤、心肌病及溶血性贫血的征兆；若LDH5＞LDH4，多见于肝脏损伤、皮肌炎、肌肉损伤等疾病。同工酶技术还可作为植物抗病性鉴定和筛选的生化指标。当病原微生物侵染生物体后，可引起组织内的代谢变化，进而可诱导产生许多新的同工酶，而且新产生的同工酶带活性高，病情越重同工酶数目越多，染色也就越浓。因此同工酶的活性和数量变化可作为生物抗病性鉴定的生化指标。

三、简述生物膜流体镶嵌模型的要点。什么是膜脂的多形性，非双脂层结构的生理意义是什么。（12分） 生物膜的流动镶嵌模型是一种生物膜结构的模型,它认为生物膜是磷脂以疏水作用形成的双分子层为骨架,磷脂分子是流动性的,可以发生侧移、翻转等.蛋白质分子镶嵌于双分子层的骨架中,可能全部埋藏或者部分埋藏,埋藏的部分是疏水的,同样,蛋白质分子也可以在膜上自由移动.因此称为流动镶嵌模型.

四、什么是反义RNA？举例说明它的理论和实践意义。（12分）

与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互补的RNA分子。反义mRNA技术通过向细胞导入一段与特定编码mRNA互补的非编码RNA链，使其与该段mRNA特异性结合而定向阻抑靶基因表达的技术。这一技术的成熟，为功能基因组学的研究和基因治疗提供了新的思路。在反义mRNA技术的研究过程中，科学家们意外发现导入正义mRNA（sense RNA）与导入反义mRNA具有等效的阻抑效应。而更令人吃惊的是如果导入相应双链RNA（dsRNA），其阻抑效应比导入任一单链RNA强十倍以上，dsRNA若经纯化则阻抑效应更强。这种双链RNA特异性地作用于与其序列配对的基因而抑制其表达的现象叫做RNA干涉。RNA干涉技术作为一种新的定点敲除

knockdown技术，赋与了功能基因组学、基因治疗等全新的思路，堪称生命科学近年来的革命性的突破。因而发现RNA干扰机制的两位美国科学家Fire和Mello荣获2006年诺贝尔生理学或医学奖。可见该项成果的重大科学意义。 五、列举四种不同类型的PCR技术的原理及应用。（12分） 1 PCR 技术的基本原理

PCR 技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下, 依赖于DNA聚合酶(T aq 酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环， 每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制， 经25～30次循环DNA数量可达2×106～ 7拷贝数。 2 PCR技术的种类

2.1 反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技术 原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I)NA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段

2.2 锚定PCR(Anchored PCR, APCR)技术 用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增,

称为APCR。 应用：它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。

2.3 不对称PCR(asymmetric PCR)技术 两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。 应用：可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。

2.4 反转录PCR(reverse transcription, RT- PCR)技术 当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT - PCR应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。

2.5 修饰引物PCR技术 为达到某些特殊应用目的, 如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等, 可在引物的5’-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等 。

2.6 巢式PCR(NEST PCR)技术 先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带, 此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR( drop-in, drop-out PCR)。上述三种方法主要用于极少量DNA模板的扩增。

2.7 等位基因特异性PCR(Allele- specificPCR, ASPCR)技术 ASPCR依赖于引物3’- 端的一个碱基错配,不仅减少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板复合物的热稳定性。这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测基因点突变。

2.8 单链构型多态性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR)技术 SSCP- PCR是根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中,单链DNA迁移率除与DNA长度有关外,更主要取决于DNA单链所形成的空间构象, 相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异所形成的构象就会不同,PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时, 每条单链处于一定的位臵,靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基臵换时,就会出现泳动变位,从而提示该片段有基因变异存在。

2. 9 低严格单链特异性引物PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR, LSSP- PCR)技术 LSSP - PCR 是建立在PCR 基础上的又一种新型基因突变检测技术。要求是“二高一低”, 高浓度的单链引物( 5’- 端/ 3’- 端引物均可),约4. 8Lmol,高浓度的Taq 酶( 16Lmol/ 100ml) , 低退火温度( 30℃),所用的模板必须是纯化的DNA片段。在这种低严格条件下, 引物与模板间发生

不同程度的错配, 形成多种大小不同的扩增产物, 经电泳分离后形成不同的带型。对同一目的基因而言, 所形成的带型是固定的, 因而称之为“基因标签”。这是一种检测基因突变或进行遗传鉴定的快速敏感方法。

2.10 复合PCR(multiplex PCR)技术 在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。复合PCR主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。

2.11 重组PCR技术 重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中, 两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。

2.12 随机引物扩增技术(arbitrary primedPCR, AP- PCR) AP-PCR技术通过随意设计或选择一个非特异性引物,在PCR反应体系中,首先在不严格条件下使引物与模板中许多序列通过错配而复性。如果在两条单链上相距一定距离有反向复性引物存在,则可经Taq酶的作用使引物延伸而发生DNA片段的扩增, 经一至数轮不严格条件下的PCR循环后,再于严格条件下进行扩增。扩增的产物经DNA测序凝胶电泳分离后,经放射性自显影或荧光显示即可得到DNA指纹图。AP-PCR用于肿瘤的抑制基因、癌基因的分离；菌种、菌株及不同物种的鉴定；遗传作图；不同分化程度或某些不同状态下的组织的基因表达差异等方面的研究。

2.13 差示PCR (differential PCR, d -PCR)技术 d-PCR可以定量检测标本靶基因的拷贝数。它是将目的基因和一个单拷贝的参照基因臵于一个试管中进行PCR扩增。电泳分离后呈两条区带,比较两条区带的丰度,或在引物5’- 端标记上放射性核素后,通过检测两条区带放射性强度即可测出目的基因的拷贝数。

2.14 定量PCR(quantitative PCR, qPCR)技术 qPCR技术是用合成的RNA作为内标来检测PCR扩增目的mRNA的量,涉及目的mRNA和内标用相同的引物共同扩增,但扩增出不同大小片段的产物,可容易地电泳分离。一种内标可用于定量多种不同目的mRNA。qPCR可用于研究基因表达,能提供特定DNA基因表达水平的变化,在癌症、代谢紊乱及自身免疫性疾病的诊断和分析中很有价值。 2.15 竞争性PCR(competitive PCR, c-PCR)技术 c-PCR技术是竞争cDNA模板与目的cDNA 同时扩增,使用同样的引物,但一经扩增后, 能从这些目的cDNA区别开来。通常使用突变性竞争cDNA模板,其序列与目的cDNA序列相同,不过模板中仅有一个新内切位点或缺少内切位点,突变性的cDNA 模板可用适当的内切酶水解,并用分光计测定其浓度。cDNA目的序列和竞争模板相对应的含量,可用溴化乙锭染色,电泳胶直接扫描进行测定,或掺入放射性同位素标记的方法测定。竞争模板开始时的浓度是已知的,则cDNA目的序列的最初浓度就能测定。这种方法能精确测定mRNA中cDNA靶序列,可用于几个到10个细胞中mRNA 的定量。

2.16 半定量PCR(semiquantitative PCR,sq- PCR)技术 sq-PCR不同于c-PCR

的是参照物ERCC-2的PCR产物与目的DNA的PCR产物相似,并分别在试管中扩增。sq- PCR的流程为样品和内参照RNA分别经反转录为cDNA,然后样品cDNA和一系列不

同量参照cDNA分别在不同管进行扩增, PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳拍照,光密度计扫描,作出标准曲线,通过回归公式便可定量表达的基因量。虽然管与管之间的扩增效率难以控制,但由PCR扩增的所有样本和参照物在不同的实验中差异很小。这种敏感的技术可用于其他低表达的基因定量

2.17 原位PCR( in situ PCR)技术 原位PCR综合了PCR 和原位杂交( Insitu hybridization, ISH) 的优点,是一种在组织切片或细胞涂片上原位对特定的DNA或RNA进行扩增,再用特异性的探针原位杂交检测。原位PCR标本一般需先经化学固定,以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜有一定的通透性,PCR扩增所需的各种成分可进入细胞内或核内,在原位对特定的DNA或RNA进行扩增。扩增产物由于分子量较大或互相交织, 不易透过细胞膜向外弥散, 故保留在原位。这样就很容易应用ISH将其检出,同时还可对目的DNA序列的组织细胞进行形态学分析。

2.18 免疫PCR(immuno PCR)技术 抗原-抗体反应与PCR技术的结合产生了免疫PCR，是目前为止最为敏感的检测方法,理论上可测到一个抗原分子的存在。通过用一个具有对DNA和抗体双重结合活性的连接分子,使作为标记物的DNA分子特异地结合到Ag- Ab复合物上，从而形成Ag- Ab- DNA复合物，附着的DNA标记物可用适宜的引物进行PCR扩增。特异性PCR产物的存在证明DNA标记物分子特异地附着于Ag - Ab复合物上，进而证明有Ag存在。吴自荣等将Ab通过化学交联剂直接连接到分子上构建成Ab-DNA探针,组成免疫PCR检测新模式，具有高度灵敏和特异性。免疫PCR可对流行性传染病( 如肝炎、爱滋病等)进行检测，检测体液中致癌基因和癌基因表达的微量蛋白等。 2.19 长片段PCR(long-PCR)技术 长片段PCR是用高质量模板DNA保证其完整性,引物应较长( 21～34bp)，使用高的退火温度及错配率更低的酶，将无3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶和低浓度有3’- 5’外切酶活性的DNA聚合酶组合使用，缓冲体系通过提高Tris的浓度或改用Tricine缓冲液以增强缓冲能力，并调高体系的pH。热循环参数总的来说需增加延伸时间，一般1kb/ min，同时采用热启动。长片段PCR在限制性片段多态性及单体型分析、染色体基因步移、DNA序列分析及基因突变的鉴定等方面得到应用。

六、影响DNA变性和复性的条件是什么？如何根据DNA复性和反应动力学分离基因组中重复频率不同的序列？（12分） 1.变性,这是DNA最重要的一个性质.

①DNA双链之间以氢键连接,氢键是一种次级键,能量较低,易受破坏,在某些理化因素作用下,DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂,使DNA双螺旋结构松散,变成单链,即为DNA变性.DNA变性只涉及二级结构改变,不伴随一级共价键的断裂.②监测DNA是否变性的一个最常用的指标是DNA在紫外区260nm波长处的吸收光值变化.因为DNA变性时,DNA双链发生解离,共轭双键更充分暴露,故DNA变性,DNA在260nm处的吸收光度值增加,并与解链程度有一定的比例关系,

这种关系叫做DNA的增色效应.③DNA的变性从开始到解链完全,是在一个相当窄的温度内完成的,在这一范围内,紫外光吸收值增加达到最大增加值的50％时的温度叫做DNA的解链温度（Tm）.一种DNA分子的 Tm值的大小与其所含碱基中的 G＋C的比例相关也与DNA分子大小及变性条件有关,G+C的比例越高,DNA分子越长,溶液离子强度越高,Tm值越大.④加热、低盐及强酸、强碱均可使DNA变性. 2.复性

变性DNA在适当条件下,两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象,这种现象称为复性.热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性,这一过程也叫退火,一般认为,比Tm值低 25℃ 的温度是DNA复性的最佳条件.

3.DNA复性的实际应用——杂交：通过变性DNA的复性性质,我们可知道,DNA单链之间、RNA单链之间、一条DNA和一条RNA链之间只要存在序列互补配对区域,不管是整条链互补,还是部分序列互补,即可重新形成整条双链或部分双链,这即为核酸分子杂交,这在分子生物学研究中有极大的应用,比如：可用于在基因组中对特异基因的定位及检测,PCR技术扩增目的基因等,很多分子生物学实验技术应用的都是核酸分子杂交的原理,如Southern Blot,Northern Blot,包括PCR技术等.

1998年

一、名词解释：（40分）

1.糖蛋白和蛋白聚糖：糖蛋白含有共价连接的葡萄糖残基的蛋白质：蛋白聚糖由杂多糖与一个多肽连组成的杂化的在分子，多糖是分子的主要成分。 1. 多酶体系：指催化机体内的一些连续反应的酶互相联系在一起，形成的反应链体系

2. 共价催化：一个底物或底物的一部分与催化剂形成共价键，然后被转移给第二

个底物。许多酶催化的基团转移反应都是通过共价方式进行的。

3. A、B和ZDNA: A-DNA 为右手螺旋，每螺旋11个碱基对 看不清大沟和小沟 是中空的。高盐分或脱水状态时，DNA常以A型存在。B-DNA watson-crick模型，右手螺旋，每螺旋10个碱基对，看清大沟和小沟。Z-DNA 左手螺旋， 是呈Z字型，每一圈12碱基对。

4. 糖异生：由简单的非糖前体转变为糖的过程。糖异生不是糖酵解的简单逆转。

虽然由丙酮酸开始的糖异生利用了糖酵解中的七步进似平衡反应的逆反应，但还必需利用另外四步酵解中不曾出现的酶促反应，绕过酵解过程中不可逆的三个反应。 5. 非蛋白质性氨基酸：不存在于蛋白质分子中而以游离状态和结合状态存在于生物体的

各种组织和细胞的氨基酸。

其不参与蛋白质合成，但有些是很重要的代谢物前体或中间产物，如瓜氨酸与鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物。

6. 蛋白质的四级结构：多亚基蛋白质的三维结构。实际上是具有三级结构多肽（亚

基）以适当方式聚合所呈现的三维结构。 7. 离子泵：离子泵是膜运输蛋白之一。也看作一类特殊的载体蛋白，能驱使特定

的离子逆电化学梯度穿过质膜，同时消耗ATP形成的能源，属于主动运输。离子泵本质是受外能驱动的可逆性ATP酶。外能可以是电化学梯度能、光能等。被活化的离子泵水解ATP，与水解产物磷酸根结合后自身发生变构，从而将离子由低浓度转运到高浓度处，这样ATP的化学能转变成离子的电化学梯度能。 8. 逆转录转座子（retrotransposon）：将转座子从DNA→DNA的转移过程称转座，从DNA→RNA→DNA的转移过程叫逆转录转座 9. 亲和层析（08年）

二、哪种类型的蛋白质适用于系统学研究？为什么？比较在系统学研究中的依据蛋白质分析的技术和依据DNA分析的技术。（15分）

三、阐明核酸变性的特点及此特点为分子生物学研究提供的实验方法及可能解决的问题。（12分） 核酸的变性：在物理和化学因素的作用下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双链解旋为单链的过程。 2.复性 变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这种现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程也叫退火，一般认为，比Tm值低 25℃ 的温度是DNA复性的最佳条件。 3.DNA复性的实际应用——杂交：通过变性DNA的复性性质，我们可知道，DNA单链之间、RNA单链之间、一条DNA和一条RNA链之间只要存在序列互补配对区域，不管是整条链互补，还是部分序列互补，即可重新形成整条双链或部分双链，这即为核酸分子杂交，这在分子生物学研究中有极大的应用，比如：可用于在基因组中对特异基因的定位及检测，PCR技术扩增目的基因等，很多分子生物学实验技术应用的都是核酸分子杂交的原理，如Southern Blot, Northern Blot,

包括PCR技术等。

四、图示多肽合成后的空间输送中信号肽的识别过程。（9分）

五、什么是酶活性中心？如何判明酶活性中心？（12分）

酶分子中能够直接与底物分子结合，并催化底物化学反应的部位，这一部位就成为酶的活性中心。

一般认为活性中心主要由两个功能部位组成：第一个是结合部位，酶的底物靠此部位结合到酶分子上；第二个是催化部位，底物的键在此被打断或形成新的键从而发生一定的化学变化。组成功能部位的是酶分子中在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团，它们在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同肽链上，而是通过肽链的盘绕、折叠在空间构象上相互靠近；对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构也是功能部位的组成部分。 六、请阐明基因组和蛋白质组概念及两者的关系，如果已知某物种的基因组全序列是否表示该物种的蛋白质组也已破译?（12分）

1999年

1. 简述决定蛋白质构象的作用力。（8分）

2. 举例说明蛋白质结构的可逆变化与该蛋白质功能间的关系。（14分）

3. 跨膜运送中主动运送与被动运送的区别及生物学意义。（14分）

主动运输和被动运输的特点： （1） 浓度梯度：主动运输是物质逆浓度梯度或电化学梯度由低浓度一侧向高浓度一侧跨 膜转运的方式；而被动运输是物质顺浓度梯度或电化学梯度由高浓度向低浓度方向的跨膜转运。 （2） 是否需能：主动运输需要代谢能（由ATP水解直接提供能量）或与释放能量的过程 相偶联（协同运输）；而被动运输不需要提供能量。 （3） 膜转运蛋白：主动运输需要载体蛋白介导；被动运输有些需要载体介导（协助扩散、 水孔蛋白），有的不需要（简单扩散）。 被动运输意义： 保证细胞或细胞器从周围环境中或表面摄取必要的营养物质及将分泌物、代谢物以及一些离子排到细胞外。 主动运输意义： （1）保证细胞或细胞器从周围环境中或表面摄取必要的营养物质，即使这些营养物质在周围环境中或表面的浓度低； （2）能够

将细胞内的各种物质，如分泌物、代谢物以及一些离子排到细胞外，即使这些营养物质在细胞外的浓度比细胞内的浓度高得多； （3）能够维持一些无机离子在细胞内恒定和最适的浓度，特别是K+、Ca2+和H+的浓度。 4. 肽聚糖的结构及在机体中的功能。（14分） 肽聚糖是由若干肽聚糖单体聚合成的多聚糖。肽聚糖单体包括肽和聚糖两部分，其中肽由四肽链和肽间桥组成，而聚糖是由N-乙酰胞壁酸(iv0和N-乙酰葡糖胺(G)两种单糖通过1，4糖苷键连接而成。并根据四肽链中第三位氨基酸的不同，将肽聚糖分为两大类：L．赖氨酸型(Lys型)以及二氨基庚二酸型(Dap型)。不同种类的细菌，肽聚糖的层数、结构和含量不同，革兰氏阳性茵的肽聚糖多是Lys型且含量较高，达细胞干重的90％以上；革兰氏阴性菌中主要是Dap型肽聚糖且含量较低，仅是位于细菌细胞壁脂多糖(LPS)T薄薄的一层，占细胞干重的5％一20％(Schleifer and Kandler,1 972；DoNe and Dziarski，2001；Ibsenthal and Dziarski，1 994)。 2.肽聚糖的免疫刺激功能

先天免疫系统识别外界病原菌是通过一系列的模式识别受体，这些模式识别受体在进化中高度保Cf(Hoffmann et a1．，1999；Janeway and Mexizhitov,2002)．肽聚糖就是先天免疫系统十分理想的识别靶点。因为肽聚糖是几乎所有细菌必须且特有的组成成分，而真核细胞不具有(Schleifer and Kandler,1972；DoNe and Dziarski．2001；RosenthalandDziarski，1994)．在固有免疫系统中，肽聚糖是一种重要的病原相关分子模式，是动物免疫系统的激活剂。

肽聚糖是动物体内常见的炎症刺激因子，许多学者在多种动物和细胞模型上研究了肽聚糖的促炎症特性。有研究者利用细菌的细胞质，细胞壁，多糖和肽聚糖等注射到小鼠的腹腔，结果都诱导了巨噬细胞和炎症细胞的反应，而其中肽聚糖的诱导力最强。肽聚糖作用于吞噬细胞、嗜中性粒细胞及表皮细胞使其活化，能产生出IL．1，IL．6和TNF．仪等细胞因子。肽聚糖或者其片段被宿主识别进而诱导一系列生化反应，包括炎症、化脓、关节炎、发热、食欲降低、低血压、白细胞增多、血小板减少等(Dziarski et a1．，2000；Doyle et a1．，2001)。动物机体是通过PGRPs等识别细菌细胞壁的肽聚糖，对入侵机体的细菌做出相应的免疫应答，抵御病原菌的入侵。 5. 简述影响细胞中某一基因表达的因素。（14分）

6. 举例说明作为调节蛋白的蛋白激酶在生命活动中的作用。（14分）

1 蛋白激酶的定义,命名以及分类

蛋白激酶（protein kinase PK）是指能将γ磷酸基团从磷酸载体分子上转移至底物蛋白的氨基酸受体上的一大类酶.蛋白激酶的命名尚缺乏统一的标准和规则,目前多用3个英文字母命名.大多数名称是由发现者根据该激酶的来源,结构或功能给予.【1】

真核生物中发现的蛋白激酶很多,根据其底物蛋白被磷酸化的氨基酸残基种类,可将它们分为5类,即①丝氨酸/苏氨酸(Ser／Thr)蛋白激酶：蛋白质的羟基被磷酸化；②酪氨酸(Tyr)蛋白激酶：蛋白质的酚羟基作为磷受体；③组氨酸蛋白激酶：蛋白质的组氨酸、精氨酸或赖氨酸的碱性基团被磷酸化,主要出现于“双组分信号系统”(two-component signal system)；④色氨酸蛋白激酶：以蛋白质的色氨酸残基作为磷受体；⑤天冬氨酰基/谷氨酰基蛋白激酶:蛋白的酰基为磷受体【2】.

蛋白激酶的种类繁多,至1999年底,已发现500余种.这些蛋白激酶大都属于重要的信号转导分子,其中对细胞生物学功能影响较大的有蛋白激酶A（PKA）,蛋白激酶G（PKG）,蛋白激酶C（PKC）,MAPK,蛋白激酶B（PKB）等.【1】 2 蛋白激酶的功能

蛋白激酶在信号转导中主要作用有两个方面：其一是通过磷酸化调节蛋白质的活性,磷酸化和去磷酸化是绝大多数信号通路组分可逆激活的共同机制,有些蛋白质在磷酸化后具有活性,有些则在去磷酸化后具有活性；其二是通过蛋白质的逐级磷酸化,使信号逐级放大,引起细胞反应.【1】下面分别介绍几种激酶的功能: 2．1蛋白激酶A的功能

蛋白激酶 A (protein kinase A,PKA) 又称依赖于cAMP的蛋白激酶A (cyclic-AMP dependent protein kinase A),是一种丝/苏氨酸蛋白激酶.一般认为,真核细胞内几乎所有的cAMP的作用都是通过活化PKA,从而使其底物蛋白发生磷酸化而实现的.【3】

PKA全酶分子是由四个亚基组成的四聚体,其中两个是调节亚基(regulatory subunit,简称R 亚基),另两个是催化亚基(catalytic subunit,简称 C 亚基).全酶没有活性.活化的PKA可作用于各种多种与糖脂代谢相关的酶类,一些离子通道和某些转录因子,使它们发生磷酸化并改变其状态.

胞吐和胞吞被认为是需要钙离子、蛋白激酶和GTP酶dynamin等参与的.有实验揭示在DRG神经元上存在一种不依赖于钙离子和dynamin的快速胞吞,胞外钙离子可以阻断细胞内钙离子依赖的胞吐:而且神经电活性和蛋白激酶A都调控这两种囊泡转运形式,且都不需要钙离子内流.【4】 2．2蛋白激酶B的功能

蛋白激酶 B又称ATK,是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,因其与PKA和PKC有相对较高的同源性,而被命名为PKB.分子量60KD,目前分为PKBα、PKBβ、PKBγ三类.PKBα广泛存在于机体各组织中,其活性受多种信息物质调节；PKβ在卵巢癌,胰腺癌中过度表达；PKBγ在大脑和睾丸中表达.PKB 分子约由480 个氨基酸残基组成,包括氨基端的调节区、中间的激酶区及羧基端的尾部三部分.

PKB/AKT是一种作用特殊的蛋白激酶,在细胞因子,生长因子作用下,通过PI3K途径激活,在细胞代谢,生长调节和抑制细胞调亡的生物活动过程中起重要调节作用,有效地将胞外存活因子和胞内生长,代谢和调亡机制的相关性有机地联系起来,并和Ras.G蛋白,PKA及PKC等有复杂的铰链

.7. 近十年来发现了十余种生长因子，例如，表皮生长因子、神经生长因子等，

你能说出他们的共同点吗？（8分）

生长因子定义:是一类调节微生物正常生长代谢所必需，但不能用简单的碳、氮源自行合成的有机物。广义的生长因子除了维生素外，还包括碱基、嘌呤、嘧啶、生物素和烟酸等，有时还包括氨基酸营养缺陷突变株所需要的氨基酸在内;而狭义的生长因子一般仅指维生素。一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质。存在于血小板和各种成体与胚胎组织及大多数培养细胞中，对不同种类细胞具有一定的专一性。通常培养细胞的生长需要多种生长因子顺序的协调作用，肿瘤细胞具有不依赖生长因子的自主性生长的特点。

8. 简述后基因组（蛋白组）的主要研究策略。（14分）

2000年

1． 酶蛋白的构象决定了酶对底物的专一性，请描述并图示酶与底物相互关系的

几种学说。（20分）

2．

3． 什么是DNA的半保留复制和半不连续复制？如何证明？真核细胞与原核细胞

的DNA复制有何不同？（20分）

DNA的半保留复制：DNA复制的一种方式。每条链都可用作合成互补链的模板，合成出两分子的双链DNA，每个分子都是由一条亲代链和一条新合成的链组成。

（一）复制叉由5’向3’方向连续复制，称为前导链；另一条链复制叉由3’向5’移动，而DNA复制方向不变，形成许多不连续片段，称为冈崎片段，最后连接成完整的DNA，称为滞后链。

（二）首先由引物合成酶由5’向3’方向合成10个核苷酸以内的RNA引物，然后聚合酶III在引物3’-羟基上合成DNA，再由聚合酶I切除引物，填补空白，最后DNA连接酶将冈崎片段连接起来，形成完整DNA。

（三）复制具有高度忠实性，其错配几率约为10-10，从热力学上考虑，碱基发生错配的几率约为10-2，酶对底物的选择作用和校正作用各使错配几率下降10-2，所以体外合成DNA的错配几率为10-6。体内复制叉的复杂结构提高了复制的准确性，修复系统对错配加以纠正，进一步提高了复制的忠实性。

1）真核生物有多个复制起始位点——复制原点,而原核只有一个复制原点.

2）真核生物复制一旦启动,在完成本次复制前,不能在再启动新的复制,而原核复制起始位点可以连续开始新的复制,特别是快速繁殖的细胞.

3）真核生物和原核生物的复制调控不同.原核生物的调控集中在复制子（一个复制单位）水平的调控,而真核生物不但有复制子水平的调控还有染色体水平的调控和细胞水平的调控.

4）原核的DNA聚合酶III复制时形成二聚体复合物,而真核的聚合酶保持分离状态.

5）真核生物的聚合酶没有5'-3'外切酶活性,需要一种叫FEN1的蛋白切除5'端引物,原核的DNA聚合酶I具有5'-3'外切酶活性.

4． 概述可作为纯化依据的蛋白质性质及据此发展的方法。（20分）

包括根据分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、配子分子的生物学亲和力等方法进行分离纯化。

（一）蛋白质分子大小的分离方法

1、透析与超滤。透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。

2、密度梯度离心或者超速离心。利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。

3、凝胶过滤法。也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。蛋白质溶液加于柱之顶部，任其往下渗漏，小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。 （二）根据蛋白质溶解度不同的分离方法

1、蛋白质的盐析。不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。中性盐(一般为硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠，其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大，也不易引起变性)对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶（原理：蛋白质吸附某类盐类离子后，带电层蛋白质彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用加强，因而溶解度增高）；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析（原理：将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。）各蛋白质盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

2、等电点沉淀法。不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

3、低温有机溶剂分级分离法。中性且与水可混溶的有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数（降低介电常数后，容易使得相反电荷的之间的引力增大，使得蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因而促进聚集沉淀）比水低，能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。此法分辨力比盐析高。但由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

4、结晶??结晶原理：溶质从溶液中析出的过程，可分为晶核生成（成核）和晶体生长两个阶段，两个阶段的推动力都是溶液的过饱和度（溶液中溶质的

浓度超过其饱和溶解度之值）。晶核的生成有三种形式：即初级均相成核、初级非均相成核及二次成核。在高过饱和度下，溶液自发地生成晶核的过程，称为初级均相成核；溶液在外来物（如大气中的微尘）的诱导下生成晶核的过程，称为初级非均相成核；而在含有溶质晶体的溶液中的成核过程，称为二次成核。二次成核也属于非均相成核过程，它是在晶体之间或晶体与其他固体（器壁、搅拌器等）碰撞时所产生的微小晶粒的诱导下发生的。 （三）根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质

根据在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。

1、电泳法。各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

2、离子交换层析法。离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE等，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。主要有离子交换层析（在交换柱中，树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液上柱，在pH2~3时，氨基酸主要以阳离子存在，与树脂上的钠离子发生交换而被挂在柱子上，其亲和力取决于他们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧脸与树脂之间的疏水作用；洗脱时的洗脱顺序为：酸性氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基酸。而为了使得氨基酸顺利洗脱，一定要降低氨基酸与树脂间的亲和力，有效方法就是逐步提高洗脱液的pH和盐浓度，从而使得氨基酸依次被洗脱下来），凝胶层析，吸附层析及亲和层析等，其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量。 （四）利用选择性吸附的方法分离蛋白质 1、羟磷灰石层析

2、疏水作用层析：根据蛋白质表面的疏水性差别，不是暴露的疏水集团促进蛋白质之间的相互作用，而是连接在支持介质上的疏水集团与蛋白质表面暴露的疏水基团结合。一旦蛋白质吸附于固定相，就可以利用多种方法洗脱。 （五）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法。亲和层析法（affinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：将待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面的功能基上。然而其他蛋白由于无法特异结合就会被洗脱。

例如：GST纯化系统其实就是凝胶亲和层析系统。该纯化柱中，凝胶手臂上通过硫键结合一个谷胱甘肽。然后利用谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶（即GST）之间酶和底物的特异性作用力，使得带GST标签的融合蛋白能够与凝胶上的手臂谷胱甘肽结合，从而将带标签的蛋白与其他蛋白分离开。之后利用带特异配体的洗脱液将目的蛋白洗脱下来-----用于抗体纯化。

4. 简述酵解和发酵两个过程并说明两者的异同。（15分）

1.相同点：(1)都要进行以下三个阶段：葡萄糖——>1,6-二磷酸果糖；1,6-二磷酸果糖——>3-磷酸甘油醛； 3-磷酸甘油醛——>丙酮酸。 (2)都在细胞质中进行。

不同点：通常所说的糖酵解就是葡萄糖——>丙酮酸阶段。 根据氢受体的不同可以把发酵分为两类：

(1)丙酮酸接受来自3-磷酸甘油醛脱下的一对氢生成乳酸的过程称为乳酸发酵。

（有时也将动物体内的这一过程称为酵解。）

(2)丙酮酸脱羧后的产物乙醛接受来自3-磷酸甘油醛脱下的一对氢生成乙醇的过程称为酒精发酵。

糖酵解过程需要的维生素或维生素衍生物有：NAD+。 5． 吃多了高蛋白食物为什么需要多喝水？（10分）

因为人一天吃的蛋白质不完全能被身体吸收，蛋白质在体内则不能完全氧化，其最终产物二氧化碳和水外，还有尿素，尿酸和肌酐等。这些含氧物质必须经过肾脏代谢，随尿液排出体外。所以，高蛋白食物加重肾脏负担。多喝水，就是为了冲淡尿液中的尿素，尿酸和肌酐，保持肾脏正常的工作环境。

6． 在非极端环境的生物体中是否存在氰化物不敏感的呼吸作用？如果有，其可能

的生物学意义是什么？（5分）

以下两题中任选一题（10分）

7． 概述植物或微生物细胞感应（应答）环境刺激因子（如养分缺乏、热、冷、干

旱、强光等）的可能的生物化学过程模式。

8． 细胞编程性死亡又称细胞凋亡是细胞的一种基本生命现象，请阐述细胞凋亡

的生物学意义及主要生物化学特征。

细胞编程性死亡是植物有机体自我调节的主动的自然死亡过程，是一种主动调节细胞群体相对平衡的方式。在这一过程中，可主动清除多余的与机体不相适应的、已经完成其生理功能并不再需要的、或是其存在有潜在危险的细胞。由此可见，细胞编程性死亡是生物体内普遍发生的一种积极的生物学过程，对有机体的正常发育有着重要意义，是长期演化过程中进化的结果。

细胞凋亡时的形态特征是细胞变成圆球状，细胞外膜鼓起形成腔泡，细胞核膜和细胞的一些内部结构破裂，细胞核内的染色体DNA被酶切成断片；当细胞破裂成碎片之前细胞膜不破裂，因此细胞内含物不泄漏出来，不引起炎症反应；细胞碎片被周围的活细胞吞噬，而不是被专职的巨噬细胞所清除。细胞坏死则是细胞受到急性损伤而出现的死亡，表现为细胞胀大，裂解，释放出大量内含物，引起炎症，坏死细胞最终被巨噬细胞清除。目前，鉴定细胞凋亡最常用的分子生物学方法是抽提细胞的DNA，经琼脂糖凝胶电泳，如出现——系列长度不等的DNA片段电泳条带，则可初步判定该细胞为凋亡的细胞。

2001年

1. 请阐明蛋白质间最重要的原子相互作用。（15分） 2. 蛋白质的测活是蛋白纯化过程中的重要组成部分，可以从哪些方面来考虑建立

一个快速、简便、定量的测活方法。（15分）

3. 质膜是细胞的第一屏障，请概述小分子通过质膜的转运机制。（15分） 4. 举例说明蛋白质三级结构决定于它的氨基酸结构。（15分）

蛋白质分子处于它的天然折叠状态的三维构象。三级结构是在二级结构的基础上进一步盘绕，折叠形成的。三级结构主要是靠氨基酸侧链之间的疏水相互作用，氢键，范德华力和盐键维持的。

5. 运用免疫学的方法能开展哪些分子生物学研究？（15分） 6. “一个基因一个蛋白”的说法对吗？为什么？（12分）

不确切。

1.有的基因不可以翻译成蛋白质，只能转录成RNA.。（如rRNA,tRNA等）但参与蛋白质的合成.

2.基因是携带蛋白质制造指令的DNA片段，这些蛋白质又行使所有生命功能。通过一种叫做“选择性拼接”的过程，基因中包含的信息被修改，因此使一个基因能够制造不同种类的蛋白质。

3.基因中的信息并不是直接转化成蛋白质，而是首先被特殊的酶复制成前体mRNA。在整个基因被拷贝成前体mRNA时，不是所有信息都能用于制造蛋白质。叫做外显子的RNA片段携带蛋白制造信息，而处于外显子之间的内含子则被特定的酶剪切掉。当然，外显子也可能被剪切掉。一旦这种剪切完成，

7. 请从生化角度评论目前市售的“核酸营养液”。（13分）

2002年

一．名词解释：（20分） 1. 同源蛋白质(homologous protein)：来自不同种类生物的序列和功能类似的蛋

白质，例如血红蛋白。

2. 构型 (configuration)有机分子中各个原子特有的固定的空间排列。这种排列

不经过共价键的断裂和重新形成是不会改变的。构形的改变往往使分子的光学活性发生变化。

3. 构象 (conformation)指一个分子中，不改变共价键结构，仅单键周围的原子

放置所产生的空间排布。一种构象改变为另一种构象时，不要求共价键的断裂和重新形成。构象改变不会改变分子的光学活性。

4. 钙调蛋白(calmodulin, CAM or CaM)是一种钙依赖性调节蛋白，广泛存在于一

切真核细胞中，结构十分保守。它是一种小分子酸性蛋白，分子量16700，有4个钙结合部位。钙调蛋白与钙结合后被活化，可刺激多种酶的活性，包括C激酶、腺苷酸环化酶、磷酸二酯酶和糖原磷酸化酶、糖原合成酶激酶等15种酶。

5. 逆转座子 (retrotransposon)（2006）

二、 以动物细胞或植物细胞为例说明细胞中的膜结构及其功能。（12分）

细胞膜有重要的生理功能，它既使细胞维持稳定代谢的胞内环境，又能调节和选择物质进出细胞。细胞膜通过胞饮作用（pinocytosis）、吞噬作用（phagocytosis）或胞吐作用（exocytosis）吸收、消化和外排细胞膜外、内的物质。在细胞识别、信号传递、纤维素合成和微纤丝的组装等方面，质膜也发挥重要作用。有些细胞间的信息交流并不是靠细胞膜上的受体来实现的，比如某些细胞分泌的甾醇类物质，这些物质可以作为信号，与其他细胞进行信息交流，但是这些物质并不是和细胞膜上的受体结合的，而是穿过细胞膜，与细胞核内或细胞质内的某些受体相结合，从而介导两个细胞间的信息交流的！所以说细胞膜的生理作用并不是很大，只是用来保护细胞。

三、在研究位置基因的功能时往往采用推定的该基因所编码的氨基酸序列与已知功能的蛋白质的氨基酸序列比较来推断，你认为这种比较应采用什么原则？为什么？（12分） 四、真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常失去生物活性，为什么？举例说明。（12分）

五、简述信号肽的结构特点、功能和从蛋白质产物中切除的机理。（12分） 信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15～30个氨基酸组成。包括三个区：一个带正电 信号肽 的N末端，称为碱性氨基末端：一个中间疏水序列．以中性氨基酸为主，能够形成一段d螺旋结构，它是信号肽的主要功能区；一个较长的带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点．也称加工区。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒(SRP)所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内质网腔．而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除[21。如终止转运序列存在于新生肽链的C端．也可以不被信号肽酶切除．如卵清蛋白含有内部信号肽。它的前体与成熟形式都没有被信号肽酶切除的过程．其N一端氨基酸结构在第9位有带电基团，疏水结构并不明显 功能：信号肽合成后被信号识别体(SRP)识别。信号识别体与核糖体结合，使肽链延伸暂停，将核糖体带到内质网，形成粗糙内质网。这里合成溶酶体蛋白、分泌蛋白和构成质膜骨架的蛋白。信号识别体与内质网上的停泊蛋白结合，将核糖体送入多肽移位装置，信号识别体被释放，肽链继续延伸。合成的肽链进入内质网小腔。

六、分子筛、离子交换和亲和层析是三种分离、醇化蛋白质的方法，你如何根据所要分离、纯化的蛋白质的性质选择使用。（12分）

七、酶联免疫吸附实验（ELISA）的基本原理是什么？如何用此方法检测样品中的抗原和抗体？（12分） ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗

原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 八、某一个蛋白，SDS凝胶电泳表明其分子量位于16900于37100标准带之间，当用巯基乙醇和碘乙酸处理该蛋白后经SDS凝胶电泳分析仍得到一条带，但分子量接近标准带13370处，请推断此蛋白质的结构？为什么第二次用前要加碘乙酸？（8分）

生物化学2003

一、简要解释下列名词（每词5分，共30分）

1、寡糖与多糖：寡糖是由2~20个单糖通过糖苷键连接而成的糖类物质，有的结构非常复杂。多糖是由多个单糖分子缩合脱水而形成的。由于构成它的单糖的种类、数量以及连接方式的不同，多糖的结构极其复杂而且数量、种类庞大。多糖是重要的能量贮存形式。

2、端粒酶：染色体端粒不是由染色体DNA复制时连接合成的，而是由端粒酶合成后添加到染色体的末端的，体细胞内没有端粒酶的活性，端粒与细胞的寿命有关。

3、酮体：指脂肪酸在肝中分解氧化产生特有的中间代谢产物，包括乙酰乙酸，β-羟基丁酸，丙酮3种。（脂代谢）

4、生糖氨基酸与生酮氨基酸：凡能形成丙酮酸、α-酮戊二酸、琥珀酸和草酰乙酸的氨基酸都称为生糖氨基酸；有些氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、色氨酸，在分解过程中转变为乙酰乙酸-CoA，而乙酰乙酸-CoA在动物的肝脏中可变为乙酰乙酸和β-羟基丁酸，因此这5种氨基酸称为生酮氨基酸。有的氨基酸如苯丙氨酸和酪氨酸，既可生成酮体又可生成糖，称为生酮和生糖氨基酸。（蛋白质降解和氨基酸的分解代谢）

5、终止子和终止因子：转录的终止控制元件为终止子，是基因末端一段特殊的序列，它使RNA聚合酶在模板上的移动减慢，停止RNA合成。终止子的辅助因子为终止因子。大肠杆菌有两类终止子；依赖于rho因子的终止子和不依赖rho的终止子。终止子还可用于控制下游基因的表达。

6、分子伴侣（molecular chaperone）：是一个协助新合成的多肽链正确折叠和转运的蛋白质家族。它们能够抑制新生肽链的不恰当的聚集，排除与其它蛋白质的不合理结合，协助多肽链的正确折叠和跨膜转运，协助寡聚蛋白的组装。 二、以下问答题任选7题回答（每题10分，共70分）：

1、简述关于生物膜运输的分子机制的几种主要假设以及他们间的相互关系。 移动性载体模型（mobile carrier model）：运输体或其结合被运输物质的部位在运输过程中，由于通过膜的来回穿梭运动，或由于通过膜平面的旋转运动改变它在膜内的定向，可以使物质从膜的一侧运至另一侧。

孔道或通道模型(pore or channel model )：运输蛋白在膜内有较确定的方向，并且形成一个对被运输物具有立体构型的亲水性孔道。孔道在识别被运输物作出反应时才瞬时打开，让被运输物质通过膜。

构象变化假设(conformational change model)：物质的跨膜运输具有主动的选择性和方向性，运输的这种专一性与运输过程中运输蛋白的构象变化相关。对一个多聚体蛋白来说，由于亚单位之间相互位置的变化所导致的亚单位重排，运输物质与运输蛋白的结合以及代谢、能量状态等都可导致蛋白质的构象变化。 这三种假设模型有共同点，就是三种模型都是被运输的物质与膜上的特异蛋白结合，才能引起物质的运输，而且在运输过程中，一般这种特异性的运输过程中都需要消耗能量。 （生化下21章，P60生物膜运输的分子机制）

2、蛋白质磷酸化和去磷酸化的生物学意义是什么？

蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程是生物体内存在的一种普遍的调节方式，几乎涉及所有的生理及病理过程，如代谢调控、细胞的增殖及生物发育、转录调控、基因表达、肌肉收缩、神经递质的合成与翻译，甚至癌变等，并在细胞信号的传递过程中占有极其重要的位置。真核细胞中1/3到1/2的蛋白质可以磷酸化。在各个信号系统中，一个共同的环节就是由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白质的磷酸化与脱酸化反应。

磷酸化主要是转移ATP上的磷酸在Mg2+参与下转移到Ser、Thr上形成P—O键。 （生化上第10章，P424）

3、请解释酶促反应的前馈和反馈（feedforward 和 feedback）及其意义。

前馈是在代谢途径中前面的底物对其后某一催化反应的调节酶起到调节的作用。激活酶的活性是正前馈，反之，抑之酶的活性为负前馈。前馈调节意义：常用于调节某一反应物的量保持在体内一个安全的水平，当某一反应物积累太多，如一些对机体积累的用过的、无意义的蛋白、摄入的有害物质，可能影响生物体液浓度、渗透压的不平衡，这时正前馈调节，可以提高酶的活性，加快反应物的代谢，解决高浓度反应所产生的可能危害，恢复体内的代谢平衡。

反馈是指代谢反应产物使代谢过程中酶速度的改变，加快酶促反应的是正反馈；如果抑制反应为负反馈。正反馈意义常出现在信号传递和级联放大，以及快速解除底物对机体产生的影响。如某人体吸入的底物，会对机体产生不良的影响，可由某种酶代谢转化为无害物质基础，代谢当产生此无害物质时可由其产物激活酶进一步加快代谢，快速解除该物质的影响，有利有生物代谢快速做出利己的反应。负反馈意义是调节体内代谢产物水平稳定的有效途径，当机内某代谢产物需求量达到满足量时，其产物的量可进一步抑制酶的活性，如别构调节等，降低产物的生成速度。当产物被消耗后，浓度下降，对酶的抑制解除，反应速度可恢复。负反馈调节是生物体代谢过程中维持各种代谢产物平衡的一个重要机制。 （生化下39章，P544酶促反应的前馈和反馈） 4、什么机制保证了DNA复制的准确性？

DNA的半保留复制机证保证了DNA复制的准确性。半保留复制是DNA在复制时，DNA双链解开，利用DNA自身的特点，依据碱基互补配对原则，对两条链同时合成其互补链。形成的新DNA分子中，其中各有一条链来自亲代，这样保证了DNA信息的准确复制，而且DNA在复制的过程中DNA聚合酶有核酸内切酶活性，可对自身对错误碱基因的混入有切除重亲添加的机制，此外复制中还有突变修复系统中各酶系的修复。

(1)DNA双螺旋结构的稳定性。核酸的碱基部分处理疏水环境中，不会受到活性水溶性物质的攻击，从而保证了遗传信息的稳定；dNTP比NTP还原性更高，保证了其聚合物与组蛋白等物质的结合，而使DNA更稳定，不易被DNase降解。

(2)dNTP与模板之间以A=T,G≡C配对，形成大量氢键，氢键的形成有方向性，并放出大量自由能来保证配对的准确性。

(3)DNA聚合酶有外切酶活性，对聚合中的错误可及时校正。3＇→5＇外切酶活性切除错配核苷酸，5＇→3＇外切酶活性对损伤的DNA和RNA引物进行切除。

(4)DNA的错配修复系统能够区别“新链”与“旧链”，将“新链” 上的错配碱基切除，并重新合成正确的碱基。

1、复制时以一条链为模板进行半保留复制,且复制时严格按照碱基配对原则. 2、DNA聚合酶具有反向校读机制,在复制中对错配碱基进行校正. 3、DNA聚合酶可以将DNA链弯曲,防止非合成点对合成点的干扰.

4、复制完成后若存在错误,DNA会启动修复机制,包括错配修复(DAM甲基化酶)、切除修复(DNA切割酶)、重组修复(DNA切割酶聚合酶)、DNA直接修复(dna光解酶)、SOS系统等.

5、神经和肌肉等细胞活动的直接供能者是ATP。然而，ATP在细胞中含量很低，在哺乳动物肌肉中仅3 - 8mmol / kg。问：是否存在其它的贮能物质，又是怎样“运作”的呢? 有，很多。 磷酸肌酸，其含量远超过ATP，是细胞内首先供应ADP使之再合成ATP的能源物质。 人

和高等动物体内最重要的储能物质是糖元(肌糖元和肝糖元)，可分解为萄葡糖，经糖酵解途径生成三磷酸甘油醛，并释放能量，补充ATP，此步是在无氧的条件下即可进行；此后进一步反应，在无氧条件下可生成乳酸，并释少量能量，或在有氧的条件下进行三羧酸循环，最终生成CO2和H2O，并释放大量能量。

储能量最多的是脂肪，可以经糖异生途径生成糖，或进行氧化生成乙酰CoA进入三羧酸循环，释放能量，合成ATP。 （生化下P40）

6、为什么C4植物即使在大气CO2 浓度很低时其光合效率仍很高？

C4途径是作为CO2的收集、浓缩和转运的系统，并需要消耗能量。将CO2从氧含量较丰富的叶片表面转动到内部的细胞，这里O2浓度较低，与CO2竞争核桐糖二磷酸羧化酶/加氧酶(rubisco)反应的能力较弱。在这个富集过程中，有丰富的CO2被转移进来与rubisco反应，从而排除了外界CO2浓度高低对光合作用的影响。具体反应过程为邻近气隙的叶肉细胞在富含O2的叶片表面吸引CO2，并用它与羧化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）在PEP羧化酶催化下生成草酰乙酸（OAA），然后被NADPH和苹果酸脱氢酶作用下还原为苹果酸或通过转氨作用生成天冬氨酸。这些携带CO2的载体通过胞间连丝被转动到邻近的维管束鞘细胞，在这里脱羧生成丙酮酸并释放CO2。

7、逆转座子广泛存在于真核生物基因组中，简述它的生物学意义并说明原因。（2006年2）

8、DNA重组中同源重组是最基本的重组方式，它的过程是什么？有什么意义？

同源重组是最基本的重组方式，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。Hollidy模型是较好的解释同源重组的模型，关键步骤有四个：⑴两个同源染色体DNA排列整齐；⑵一个DNA的一条链断裂并与另一个DNA对应的链连接，形成连接分子，称为Hollidy中间体；⑶通过分支移动产生异源双链DNA；⑷Hollidy中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。

意义：打破基因原来的连锁关系，产生更多子代配子类型；可引起不等交换引起的插入或缺失突变加速进化；增加物种的遗传多样性；可以整合外源基因，获得有利性状，增加适应性。 （生化下P438）

2004年

一、分离纯化蛋白质是根据蛋白质的哪些性质进行的？举例说明3种层析的操作（解释溶液的盐离子浓度、PH值等变化）及其原理。(20分)

分离纯化蛋白主要是根据蛋白质溶解度的差异，电荷性质的差异，分子大小的差异，吸附性质及与配体亲合力的差异等。 凝胶过滤层析：当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔隙内部，只能穿过凝胶颗粒之间的间隙，很快流出层析柱；比网孔小的分子能不同程序地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。 聚焦层析：是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质。当用特种多缓冲液填充在柱中形成的特种多缓冲交换剂，会在层析柱中形成自上到下的连续的pH梯度，同时将蛋白质样品加在柱上端也会随着缓冲液的展开按各自的等电点聚焦在相应的pH值区段，并在展开过程中随pH梯度下移，蛋白质混合物的各组分先后从柱中流出，达到分离纯化的目的。 （生化上P301-311） 离子交换层析：是一种用离子交换树脂作支持剂的层析法，离子交换树脂是具有酸性或碱性基因的高分子化合物，分离蛋白质常用纤维素离子材料，可以在不同酸碱性条件下交换吸附不同的蛋白质，然后改变pH值和盐离子浓度，洗脱回收目的蛋白。 （生化上P152） 亲和层析：（2008名词3）

二、试举一例说明激素介导的信号转导的生理意义和作用机制。(20分)

肾上腺素：是在应激状态、内脏神经刺激和低血糖等情况下，释放入血液循环，促进糖原分解并升高血糖，促进脂肪分解，引起心跳加快，这种快速应激反应可以机体瞬间准备大量能量用于应对内部或外部的突发情况做准备。

肾上腺素作用机制采用腺苷酸环化酶途径：激素与受体结合后，首先活化G蛋白，通过

G蛋白与激素受体的偶联，将信息传递给腺苷酸环化酶，然化活化了的环化酶再触发一系列由cAMP倡导的级联放大反应。凡有cAMP的细胞都有一类能催化蛋白质产生磷酸化反应的酶，称为蛋白激酶。cAMP通过蛋白激酶发挥它的作用。实际上，G蛋白参与许多信号传导过程，信号传导过程在细胞膜上发生。这种作用反应快，通过生成cAMP而立刻作用于机体组织。

三、简述两类真核细胞蛋白质降解的机制以及它们的生物学意义。(20分)

细胞中蛋白降解主要有两条途径：1.不依赖ATP的溶酶体途径，没有选择性，主要降解外源蛋白、膜蛋白及长寿命的细胞内蛋白；2.依赖ATP的泛素途径，在细胞质中进行，主要降解异常用蛋白和短寿命蛋白，泛素是一种高保守的小分子蛋白，作用过程为某些具有泛素化功能的蛋白，可与其指定类型的蛋白发生互作，识别，然后将泛素小分子标记在待降解蛋白上，这个过程叫泛素化，被泛素化的蛋白可进于溶酶体途径被降解为氨基酸、小肽和泛素。此途径在含溶酶体的红细胞中尤为重要。

四、基因HOR的转录受激素X的正调控。试设计实验分析鉴定其顺式作用元件（cis-elements）、反式因子(trans-factors)及其调控模式。(20分)

1. 首先你要克隆HOR基因的启动子，构建克隆载体回收质粒，并测序获得启动子序列； 2. 获得高表达HOR时该组织的总蛋白；

3. 使用DNaseI足迹试验*或染色体免疫共沉淀法来鉴定蛋白与启动子区顺式作用元件的互

作，从而得到顺式作用元件序列； 4. 利用得到的顺式作元件序列，采用DNA亲和层析法*来分离上游的调控转录因子； 5. 分离到的特定转录因子，可以鉴定其理化性质，或用酶切和质谱来鉴定其序列进一步研 究其功能。

6. 从获得的序列为出发点，利用网络资源查找相关元件和因子的功能研究，进一步确定其

激素X通过何种转录因子的途径，正调控基因HOR的。 *附：DNaseI足迹实验：蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被DNase破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。DNase I足迹试验是一种鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上结合位点的方法，它不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。足迹试验的方法较多，常用的有DNase I足迹试验和硫酸二甲酯足迹试验(dimethylsulfate，DMS)，两者原理基本相同。 DNase I足迹试验的实验流程如下：①待检双链DNA分子用P同位素作末端标记，通常只标记一端；②蛋白质与DNA混合，等两者结合后，加入适量的DNase I，消化DNA分子，控制酶的用量，使之达到每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键断裂，并列设置未加蛋白质的对照；③从DNA上除去蛋白质，将变性的DNA加样在测序凝胶中作电泳和放射性自显影，与对照组相比后解读出足迹部位的核苷酸序列。足迹试验特异性好，定位精确，使用广泛。 DNA亲和层析：将特异的或非特异的DNA分子固定在支持物（如纤维素、凝胶粒等）上，用作亲和层析介质，能够纯化天然形态的DNA结合蛋白，或分析该蛋白质的DNA结合区域的方法。 五、在应用重组DNA技术表达某些蛋白时，经常在表达的蛋白末端加上一段氨基酸序列作

为标签(tag)。说明标签序列在生物学研究中的应用。(20分)

1． 分离标记：可以对表达的含标签的融合蛋白，利用对标签有专一抗性的抗体或有亲和的

材料对蛋白进行特异性结合并分离纯化蛋白。

2． 转基因检测的标记：可能某些基因在生物体内本身存在，过表达基因时为确定是否该基

因过真正过表达，需要检测该基因的表达产物，用标签来区别过表达的基因与生物体原

本自己表达的该基因。

3． 检测位点：如无目的蛋白抗体，可用标签的抗体来检测目的蛋白的表达。 六、举2－3例说明组蛋白翻译后修饰的机制及其生物学意义。(20分)

许多真核生物的新生豚都要经过翻译后加工或修饰，这种加工修饰可以发生在正延伸着的肽链中和翻译后。

1． 切除加工：典型的情况包括切除N-端蛋氨酸、信号肽序列和切除部分肽段，将无活性的前体转变成活性形式。一些酶的前体（称为前体酶，或酶原）或无活性的多肽前体（称为前体蛋白）只有切除特定的肽段后才能从无活性形成转变成活性形式。

2． 糖基化：真核生物中糖基化修饰很普遍，通常情况下，分泌蛋白的寡糖链较复杂，而内

质网膜蛋白含有较高的甘露糖。影响肽链的折叠以及蛋白质的分泌和定位。

3． 羟基化：在结缔组织的胶原蛋白和弹性蛋白中pro和lys是经过羟基化的。在乙酰胆碱

酯酶（降解神经递质乙酰胆碱）和补体系统（参与免疫反应的一系列血清蛋白）都发现有4-羟辅氨酸。谷氨酸的羧化，可在一些凝血因子等蛋白质中引进钙离子结合位点。 4． 磷酸化：蛋白磷酸化参与代谢调控和信号转导以及蛋白与蛋白之间的相互。 5． 亲脂修饰：最常见的亲脂修饰是酰化和异戊二烯化。豆蔻酰化是最常见的酰化形式之一。

蛋白抽亲脂修饰后可以改变膜结合能力和特定的蛋白与蛋白之间的作用。乙酰化可以防止肽链降解。

6． 甲基化：通过甲基转移酶进行。在2,3二磷酸核酮糖羧化酶、钙调蛋白、组氨酸、某些

核糖体蛋白的细胞色素C中都有甲基化的赖氨酸残基。影响组蛋白等蛋白质和其它分子的相互作用。

7． 二硫键形成：二硫键通常只发现于分泌蛋白（如胰岛素）和某些膜蛋白中，在细胞质中

由于有各种还原性物质（如谷胱甘肽和硫氧还蛋白），所以细胞质蛋白没有二硫键。 8． 泛素化：将特定蛋白标记上泛素分子，是调节细胞内蛋白降解的信号。 七、简述miRNA（microRNA）和siRNA的结构和功能。（20分）(2007年名词4,5)

2005

1. 在研究蛋白与蛋白间相互作用时，酵母双杂交和免疫共沉淀是较常用的方法。请简述这两种方法的原理。（15分）（见2008年第五题）

2．说明产生自由基的常见途径，并写出两个抗氧化保护酶。（10分）

自由基也称游离基，是指含有奇数价电子并因此在一个轨道上具有一个不成对电子的原子或原子团。具有顺磁性，反应性强，寿命短。一般是由反应均裂获得，常见有途径有辐射诱导，包括可见光、紫外线和电离辐射（高能光子和高能粒子）；热诱导，提高温度也可使共价键均裂产生自由基；凡是能够单电子氧化还原的金属离子都可以与过氧化氢反应使其发生裂解，产生自由基因。（生化P96-97） 重要的抗氧保护酶 （1）超氧化物歧化(superoxide dismutase, SOD) 是体内催化下列歧化反应的一种抗氧化保护酶，属于金属酶类，其活性中心所含金属离子可为Cu、Zu、Mn、Fe，广泛存在于各种生物中。 （2）过氧化氢酶(catalase)，人和动物体内此酶以肝和红细胞中最为丰富，并集中在过氧化物酶体中，谷胱甘肽过氧化物酶是人体内清除H2O2的最重要的酶。此外，还有维生素E，也是人体中最重要的自由基清除剂。 （生化P101-102）

3．SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)是生化中常用试剂，请说明它在聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质分子量中的作用以及它在碱裂解法提取pUC18质粒DNA中的作用。（10分） 在聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质分子量中，SDS可以断烈分子内和分子间氧键，破坏蛋白质的二、三级结构，与蛋白质按一定比例结合，形成保持原有分子大小为特征的负离子

团块，从而降低或消除了蛋白质分子之间天然的电荷差异，因此，蛋白质的迁移速度取决于分子大小。 SDS在碱裂解法提取pUC18质粒DNA中，SDS可与基因组线性DNA、大分子RNA和蛋白质结合，生成沉淀，而环状的质粒仍保持溶解状态，从而使质粒得到分离。

4．请设计实验，纯化在大肠杆菌中表达的Taq DNA polymerase(Taq DNA 聚合酶)并鉴定其纯度和生物学活性。（20分）

1) 离心富集菌体； 2) 采用缓冲液重悬菌液； 3) 冻熔法裂解菌体，或加入裂解液裂解菌体； 4) 裂解产物可以采用盐析法分离蛋白，还需进行透析纯化；也可采用加热变性法沉淀蛋白和其它杂质，而Taq酶具有热稳定性仍溶于缓冲液；此外还可以采用亲和层析法如DNA-纤维素材料亲合DNA分离Taq酶。 5) 采用 SDS-PAGE鉴定Taq酶的纯度，与分子标准对照； 6) 采用PCR方法鉴定酶活力，与商品酶作对照。(秦川 et al. 2008) 5．现在，在药店购买抗生素时，一般要求出示医生处方，以避免抗生素的滥用。请说明细菌产生对抗生素耐药性的生物化学机制。（15分）

细菌细胞里有一种复合型转座因子，两端有反向重复序列，中间含有抗生素的抗性的基因，不同细菌不含有，或含有不同的抗性基因，这些抗性基因，在自然情况下可以通过整合入噬菌体基因组中或是接合的质粒中传播到其它细菌细胞，这是细菌产生抗药性的重要来源。其它是自身基因的突变和重组也可能导到抗药性的出现。这些情况发生的频率是很低的。而在有抗生素选择的情况下，没有抗性的细菌会被很快杀死，而如果存有对此抗生素有抗性的细胞个体时，此时该细胞在人体内不但不会被杀死，反而会因为其它无抗性的细菌被杀死后，获得了更广阔的生存和繁殖空间，使自身大量繁殖，这样更利于这种含有抗性的细菌进一步传播。从而使下次再用同类型抗生素时也无法治疗此类细菌性感染，这在医疗上是很严重的问题，所以抗生素要抗医生处方使用，如果滥用可能会导致细胞的各种抗药性菌株被筛选并成为主流菌株，可能将来有些很常见的细菌的感染而无药可救。

6．随着石油能源的减少，可再生能源的利用越来越重要，利用发酵工程产生的乙醇是一种可能的石油替代产品。请说明酵母在无氧条件下，将丙酮酸转化为乙醇的生化反应过程（包括中间产物和所需要的酶和辅酶）。（15分）

丙酮酸在丙酮酸脱羧酶催化丙酮酸脱羧生成乙醛，乙醛被NADH+H+还原生成乙醇。 7．在高等生物蛋白组学研究中发现，逆境条件下某蛋白A含量远远高于它在正常条件下的含量，但是在mRNA水平上检测表明在逆境条件和正常条件下此基因的表达水平基本一致。请根据你所学的知识说明其可能的表达调控机制。（15分）（见2008年第四题） mRNA水平上检测水平基本一致，只能说明转录水平上相似。从mRNA到蛋白质还要经历很多步的调节。 转录后水平的调节：包括mRNA的修饰，选择性剪切，加帽子结构和尾巴，还有碱基修饰等，这些结构的差别可能导到mRNA的稳定性，还有密码子的偏好性，也会影响蛋白表达水平。此外还有可能有内源的microRNA或外源的siRNA对mRNA进行沉默，来改变最终用于翻译的mRNA量。 翻译水平的调节：mRNA的运输，从细胞核运送到细胞质才能进行翻译；翻译的起始，有些阻谒物可以结合在mRNA的5`端影响翻译的效率；mRNA的稳定性，也对翻译的蛋白量有影响；起始因子的磷酸化，也可影响翻译的产物量。 翻译后水平的调节：蛋白质的切割，如：去除Met端多作的氨基酸；二硫键的形成；特定氨基酸的修饰；切除非功能分段；其它特定的化学修饰，如糖基化、磷酸化、亲脂修饰、甲基化等。这些修饰对蛋白终产物的产量和蛋白质的生命周期都有调节作用，来改变蛋白含量。

2006

1、试举5例说明绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）在生物化学研究中的应用。（15）（见2008年第三题）

2、请说明真核生物中逆转座子(retrotransposon)的结构特征和生物学意义。（1５） 逆转座子也叫，反转录转座子，是指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件。分为两类，一类是病毒超家族，这类反转录转座子编码反转录酶或整合酶，能

自主地进行转录，其转座的机制同反转录病毒相似，但不能像反转录病毒那样以独立感染的方向进行传播，特征结构为两端有长末端重复序列（LTR）；另一类是非病毒超家族，自身没有编码转座酶或整合酶的能力，而在细胞内己有的酶系作用下进行转座。所有反转录转座子都有一个共同的特点，即在其插入位点上产生短的正向重复序列。 生物学意义：1>影响所在位点或邻近基因的活性；2>成为基因组的不稳定因素，；3>促进生物进化。

3、 某一蛋白样品在SDS-PAGE上经考马斯亮蓝染色呈现单一的条带。是否可以认为此蛋白样品只包含一种蛋白？如何进一步鉴定这个蛋白的纯度。（15） 不可以。

可以采用等电聚胶电泳，可以按蛋白质的等电点（pI值）不同将不同蛋白质分开。现在有较成型的蛋白双向电泳胶条，先按让蛋白样品在存在pH梯度的胶条上预电泳聚焦，使蛋白质先按pH值的不同在水平方向的胶条上分开，再在垂直方向进行SDS-PAGE按蛋白的分子量进行电泳，可得到二维的蛋白质图。 4、试简述免疫共沉淀（immunoprecipitation）的原理及应用。（1０）（见2008年第五题） 5、转基因食品(GM food)正逐渐地被摆上餐桌，请根据你的生化知识谈一谈你对转基因食品安全性的认识。（10）

从基因角度上讲，转基因食品是比较安全的，因为转基因那些转入的基因也都是自然存在的基因，人类只是通过技术手段，让目标特种快速获得较高的目的性状，加速了育种效率和育种周期，有效的解决目前日益增长的人口问题和粮食危机。 但从长期适应角度和选择标记基因上，转基因食品也存在一定风险，因为转基因食品中有些基因是自然进化上无法获得的，也是人类未曾世代长期食用的，转基因食品人类开始食用才十几年，虽然未报道过严重问题，但是否绝对安全，还是需要一个长期研究的过程。还有在转基因过程中常使用标记基因，如抗生素、抗除草剂等选择标记基因，这些基因产物如果不能有效去除，人类长期食用还是存在一定风险的。 6、请详细说明真核生物基因表达在不同水平上的调节机制。（２5）（见2008年第四题） 7、中国科学家2005年在生命科学研究领域获得了大丰收，在Cell，Science和Nature上发表了多篇原创性文章(通讯地址为国内)。请说出其中两篇的主要内容和主要作者或主要作者单位。（10）

2007

一.名词解释

1.Alternative splicing： 可变剪切，同一个miRNA前体分子，可以在不同的剪切位点发生剪接瓜，生成不同的mRNA分子，最终产生不同的蛋白质分子。这也许是生物进化过程中增加遗传信息的复杂性、经济而有效地利用遗传信息以有利于生存的一种途径。选择性剪接可能有其时间和空间的专一性。

2.Nonsense mediated decay：无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）能够选择性降解含有翻译提前终止密码子（premature translation termination condon，PTC）的mRNA，从而防止对机体有害的截短蛋白（truncated proteins）的产生，它是真核生物中广泛存在的一种高度保守的有效的监督机制。NMD与肿瘤发生发展过程中的基因突变有密切关系。 3.RNA editing：RNA编辑 这是在生成mRNA分子后，通过核苷酸的插入、缺失或转换，改变来自DNA模板的遗传信息，翻译生成不同于模板DNA所规定的氨基酸序列，也就是合成了不同于基因编码序列的蛋白质分子。

4.miRNA：MicroRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA 分子,可与RNA介导的沉默复合物结合（RISC）结合，介导与其序列大部分互补或完全互补的靶基因降解的作用，参与动植物中转录后水平的基因表达调控。 5.siRNA：Small interfering RNA (siRNA)，是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由RNAase Ⅲ家族中Dicer酶对外源的双链RNA进行特异性加工而成。主要介导转录后水平的基因沉默（PTGS）。

二.简述真核生物中分泌型蛋白质的转运途径和主要的生理功能。 分泌型蛋白质转运途径:

首先在粗面内质网上,由mRNA和2个核糖体亚基组成复合物,经翻译得到蛋白原,经过内质网的运输(同时,对蛋白质进行多种修饰和加工),到高尔基体后,对蛋白质进行最后的糖基化修饰,并形成膜泡,向细胞膜运输,至膜表面后,膜泡与细胞膜融合,将蛋白质分泌到胞外。 主要的生理功能有:

1.执行抗体功能,如:IgA等分泌型抗体,在支气管的黏液层,执行抗体功能。 2.激素功能,如:人生长激素,为蛋白质类激素,由垂体分泌。

3.消化酶,如:胰腺的外分泌部,分泌胰蛋白酶原,当运到小肠内后被激活,表现分解蛋白质的活性。

三.真核生物中转座子的两大类型，各自的转座方式及生物学意义。

1．复制转座(replicative transposition) 转座因子在转座期间先复制一份拷贝，而后拷贝转座到新的位置，在原先的位置上仍然保留原来的转座因子。复制转座有转座酶(transposase)和解离酶(resolvase)的参与。转座酶作用于原来的转座因子的末端，解离酶则作用于复制的拷贝。TnA是复制转座的例子。

2．非复制转座(non-replicative transposition) 转座因子直接从原来位置上转座插入新的位置，并留在插入位置上，这种转座只需转座酶的作用。非复制转座的结果是在原来的位置上丢失了转座因子，而在插入位置上增加了转座因子。这可造成表型的变化。

意义 目前转座子元件是植物分子生物学操作和植物基因工程中分离克隆基因和研究基因功能最有力的工具之一，其中的一大类—反转录转座子具有分布广、异源转座高和受组织培养诱导激活等优势，因此它的发现和利用又为转座子标签的应用提供了更广阔的前景。此外通过对现有转座元件的改造以及转座元件作为载体改造的工具，也将大大加速植物基因和功能序列的分离与研究，如利用转座子元件构建启动子捕捉载体，效率比T-DNA标签高。转座子可以改变其附近基因的调控、创造新基因、引起DNA断裂和基因组信息量的增加，为生物的进化提供了多样的原料。 四.免疫共沉淀和酵母双杂交实验的原理及各自的优缺点。

免疫共沉淀含原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 免疫共沉淀优点 （1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；

（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响； （3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 免疫共沉淀缺点

（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；

（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

酵母双杂交原理：二个结构域不但可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达， 其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequenc e)， 而GAL4-ad没有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的

重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。 酵母双杂交优点:

⑴ 作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。

⑵ 检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 ⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或 暂时的相互作用。

⑷ 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库， 能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。 酵母双杂交缺点

⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。 另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。

⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是\假阳性\。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生\假阳性\结果。

五、用大肠杆菌(E. coli) 表达带有GST标签的X蛋白，通过免疫家兔获得针对该融合蛋白的多克隆抗体血清，请你设计实验纯化X蛋白特异性抗体 (与GST无免疫交叉反应)。(10分)

用GST标签把X蛋白结合到层析柱上，血清用这个柱子亲和层析。 六.你的课题涉及到研究某个蛋白的生物学功能，在你开始具体实验之前，利用网络资源，你需要获得该蛋白的哪些相关信息？通过这些信息，可预测该蛋白的结构和功能。 利用NCBI的查找与比对功能，找到此蛋白的序列或同源蛋白的序列，对序列注释进行分析，对序列利用Interproscan，pfam进行结构域注释，对注释进行综合分析。

2008

一名词解释

1染色体重塑（chromatin remodeling）：改变核小体的结构和位置，造成染色质凝集程度的变化，从而影响到基因表达活性的改变，产生不同的表型的过程。（现代遗传学P127） 基因的活化和转录需要一系列重要的染色质变化, 如染色质去凝集、核小体变成疏松的开放式结构等, 使转录因子等调节因子更易接近和结合核小体。与基因表达调节所伴随的这类染色质结构改变现象就叫做染色质重塑, 需要特异的因子结合在启动子和增强子等顺式作用元件上,并和聚合酶之间建立起有效的联系。染色质重塑的机理涉及特殊的蛋白复合体。对基因表达的限制, 主要有两种类型，一是依赖的物理修饰—在ATP水解所翻译能量驱动下，组蛋白和的构象发生局部变化，二是共价性化学修饰—包括组蛋白末端的乙酞化、磷酸化、甲基化和泛素化等修饰。(梁前进 2007)

已经分化了的细胞核在去核的卵细胞或合子中进行了重编程，恢复了细胞的全能性的过程就叫染色体重塑。(潘晓燕 et al. 2007) 2同源蛋白：在不同生物体内行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质，例如各种脊椎动物中的氧转运蛋白——血红蛋白。同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性，这种相似性序列同源。具有明显序列同源的蛋蛋白质也称同拥蛋白质， 同源蛋白质的氨基酸序列中有许多位置的氨基酸残基对所有已研究过的物种来说都是相同的，因此称为不变残基(invariant residue) 。但是其他位置的氨基酸属基对不同物种有相当大的变化，因而称可变残基。同源蛋白质一般具有几乎相同长度的多肤链，并且它们的氨基酸序列与那些

提取它们的物种的亲缘关系具有同一性。 （生物化学P181-182）

3亲和层析（affinity chromatography：利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。可以选用生物化学、免疫化学或其他结构上吻合等亲和作用而设计的各种层析分离方法。如用Oligo dT-纤维素分离纯化mRNA；用DNA-纤维素分离依赖DNA的DNA聚合酶；用琼脂糖-抗体制剂分离抗原；用金属螯合柱分离带有成串组氨酸标签的重组蛋白质等。

4 酶的竞争性抑制(competitive inhibition)：抑制剂与底物竞争酶的活性中心，阻止底物与酶结合。竞争性抑制剂具有与底物类似的结构，可与酶形成可逆的EI复合物。增加底物浓度可以减小或解除此种抑制。（生物化学上P368-369） 5逆转座子（retrotransponson、retroposon）：指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件。分为病毒超加族和非病毒超加族两类。（现代遗传学P63-64）。

6糖异生：非糖物质生成葡萄糖或糖元的过程。非糖物质包括氨基酸，乳酸，甘油醛及三羧酸循环中的各种有机酸。进行糖异性的器官主要是肝脏，其次是肾脏。 二 举5例真核生物体内非编码RNA以及其功能（往年试题） 非编码RNA（Non-Coding RNA），指的是不被翻译成蛋白质的RNA，如tRNA, rRNA等，这些RNA不被翻译成蛋白质，但是参与蛋白质翻译过程。 此外还有snRNA,snoRNA等参与RNA剪接和RNA修饰miRNA也是非编码RNA，是小的RNA分子与转录基因互补，介导基因沉默。 siRNA，外源的small RNA，介绍转录后水平的基因沉默。 piwiRNA，长度26-30bp的非编辑RNA，在动物生殖相关中起重要作用。

gRNA又称引导RNA，真核生物中参与RNA编辑的具有与mRNA互补序列的RNA； eRNA，从内元（introns）或非编码DNA转录的RNA分子，精细调控基因的转录和翻译效率；信号识别颗粒RNA，细胞质中与含信号肽mRNA识别，决定分泌的RNA功能分子； pRNA，噬菌体RNA，fi29噬菌体中用6个同样的小RNA分子利用ATP参与DNA的包装； tmRNA，具有tRNA样和mRNA样复合的RNA，广泛存在细菌中，识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问题的核糖体的崩解； 最后就是mRNA中的非翻译区，含有核糖体识别元件如5'-UTR,3'-UTR等。 内元（introns）也可看作非编码RNA。

三 举5例GFP在生物化学中的应用（2006年试题）

绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,简称GFP)是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。

1．分子标记：各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。

2．药物筛选：光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，基于细胞的荧光分析可分为三类：为药物筛选的GFP即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。

3．生物传感器：蛋白质工程技术已经开始采用将一具有信号传导功能分子识别位点的分子结合到另一分子上来设计生物感受器。绿色荧光蛋白由于其独特的光信号传导机制，以及在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用所影响的特性，因而极适于用做活细胞体内

的光学感受器。第一个基于GFP的生物感受器为Ca2+

感受器，当缺少目标分子时，GFP处于静止状态不会产生荧光。但是当目标分子β-内酰

胺酶抑制蛋白(BLIP)与Bla结合后，即使GFP活化产生荧光，而这一变化很容易被检测到。 4．信号传导：通过偶联 GFP 到适当的转录因子、跨膜受体、细胞间信号转导指示分子 , 来动态观测活细胞的生理功能。 5．融合抗体：利用GFP与抗体结合来观察抗体与抗原靶位点的结合及作用效果观察。 2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura（下村修）、哥伦比亚大学的Marin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健，钱学森的堂侄）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）. 四 真核生物转录起始水平到翻译后水平上的基因表达调控（往年试题）

转录起始水平：包括DNA的活化，DNA的有些基因区域进行了化学修饰，或是以特定的空间结构存在，RNA聚合酶无法与启动子结合，需要特定的活化；转录因子与顺式作用元件的识别，RNA聚合酶与启动子核心区TATA box结合，有时还需要在相应条件下的转录因

子与启动子中的顺式作用元件作用，才能启始转录并决定转录的效率；

转录后水平：即RNA水平上的修饰，包括加5`帽子反应，加poly A尾巴反应，RNA的剪接，RNA的切割及可变剪切，RNA的化学修饰等，还有转录后水平的基因沉默（PTGS），如miRNA/siRNA的。

翻译水平：mRNA向细胞质的定向严格运输；mRNA的稳定性调节；翻译的负调，如某些特定蛋白的结合；超始因子的磷酸化等。

翻译后水平：蛋白质的切割，如：去除Met端多作的氨基酸；二硫键的形成；特定氨基酸的修饰；切除非功能分段；其它特定的化学修饰，如糖基化、磷酸化、亲脂修饰、甲基化等。 （现代分子生物学 第3、4章）

五 蛋白质免疫共沉淀(CoIp）与ChIP的原理以及应用 蛋白质免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是研究蛋白与蛋白互作的一种方法。细胞在变性条件下被裂解时，完整细胞内的许多蛋白质间的相互作用被保留，如果用蛋白X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的相互作用蛋白Y也能沉淀被下来。再利用带有磁珠偶联的抗体的抗体对沉淀的结果进行特异性分离，再经电泳可分离得到蛋白及与蛋白互作的蛋白。有于研究蛋白与蛋白的互作反应、抗原抗体反应，蛋白互作的空间结构和作用机制等。 染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）：是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。特别是近年来由于该技术不断的发展和完善，其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用，发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用；从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用，发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用；从研究启动子区域的组蛋白的修饰，发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物，顺式作用元件及反式作用因子的相互作用。因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。

六 简述线粒体、叶绿体、膜蛋白和分泌质白的合成后运送途径。 线粒体和叶绿体蛋白的运输较类似，都是大部分蛋白由核基因表达，先在细胞核内转录，然后在细胞质中游离的核糖体上翻译，再往线粒体中转运需要。在转运入双层膜的细胞器中是一个十分复杂的过程，需要多肽链结合蛋白的参与使蛋白去折叠，还需要ATP和质子梯度帮助跨膜。此外，被运输的蛋白还有双信号肽，分别完成与细胞器外、内两层膜的识别和两次跨膜运输。

膜蛋白和分泌蛋白在内质网中形成，先经过修饰，包括N端信号肽的切除，二硫键形成，以及空间结构形成及糖基化。加工后被膜包裹成小泡，转动至高尔基体，然后再转动再

细胞表面或溶酶体中。 (生物化学 下P534-535)

2009

1. 某研究生得转基因植物，并得到了该转基因。 1.1 证明转基因至基因组？ 1.2 证明该基因转录成mRNA? 1.3 证明该基因表达成蛋白质 2. 三种蛋白质之间相互作用的方法。

3. 在细胞受到X-ray伤害是，P21基因相应P53蛋白 3.1 P21基因与P53结合的最小启动子？

3.2 为找到P21基因与P53结合区，证明体外能结合？ 3.3 在细胞内证明P53能与P21启动子结合？ 4. 在细胞发生凋亡时，凋亡抑制因子AAP1下调。 4.1 实验证明AAP1是否转录下降？ 4.2 实验证明AAP1稳定性下降？

4.3 蛋白水平是否下调？若是，写出降解方法。

5. 某研究生得一cDNA，想研究其开放读码框架，问有几种读码框架？ 6. 激素加可刺激拟南芥生长，现有一研究生用诱变剂基因筛选的方法得到突变株x，用该激素处理不敏感，呈矮株。 6.1 有哪几种方法可克隆得到该基因？ 6.2 如何验证已得到正确的基因？

6.3 X若编码转录因子，则说明为何突变为显性？

7. 果蝇基因x编码蛋白X，蛋白X为一种重要受体家族，有研究生的缺失突变x纯合体，欲研究x在发育中的作用，但果蝇发育正常，表型正常，育性正常，试述x突变体表型、育性正常果蝇的原因，并证明其理由。 8. 通过药物诱变得到a序列，通过T载体插入得到b和c序列。 8.1 证明a序列和b序列是同一序列，而c序列是另外的序列？ 8.2 系统研究受a基因编码的A蛋白正调控的X蛋白的方法

2010年

1、谈谈你对缺陷血红蛋白有关疾病的致病分子机制的认识。（15 分） 2、谈谈你对蛋白质变性的认识？为什么说十二烷基磺酸钠（SDS）是蛋白质的变形剂？（15 分）

生物大分子的天然构象遭到破坏导致其生物活性丧失的现象。蛋白质在受到光照，热，有机溶济以及一些变性济的作用时，次级键受到破坏，导致天然构象的破坏，使蛋白质的生物活性丧失。

SDS作用：是一种有效的变性剂，能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用，而

巯基乙醇可以打开二硫键，因此两者作用下，多肽链处于展开状态，此时SDS与蛋白结合成复合体，这种结合可带来两种结果：（1）SDS是阴离子，使得多肽链覆盖上相同密度的负电荷，该电荷远超过蛋白质分子原有的电荷，因此掩盖了不同蛋白间的电荷差异，从而使得蛋白以同样的迁移速度向正极移动。（2）改变了蛋白质分子构象，SDS-蛋白复合体呈现长椭圆棒状，不同蛋白质的SDS复合体的短轴长度一致，而长轴的长度与分子质量成正比例变化。 在质粒DNA提取中的应用如下：

3、论述糖脂代谢途径的相互关系。（15 分）

4、真核生物的基因组及基因比原核生物复杂，体现在哪几方面？（20 分） 5、逆转座子的类型和意义。（15 分）

6、随着人类基因组计划的完成，单核苷酸多态性（single nucleotidepolymorphism, SNP）的筛选及检测成为核酸研究的焦点之一。请阐述分析已知SNP和未知SNP的检测方法。（20）

2011年

1、 反刍动物的蛋白质代谢。 *

(1)消化：

进入瘤胃的饲料蛋白质其中约有70%(60-80%)经受细菌和纤毛虫的分解，仅有30%(20-40%)的蛋白质未经变化而进入消化道的下一部分。

①瘤胃：饲料蛋白质在瘤胃微生物，蛋白质水解酶的作用下，首先分解为肽，进一步分解为游离氨基酸，蛋白质消化分解产物—肽和氨基酸，部分被微生物用于合成菌体蛋白质，部分氨基酸亦可在细菌脱氨酶的作用下经脱氨基进一步降解为NH3、CO2和挥发性脂肪酸，饲料中NPN化合物亦可在细菌尿素酶的作用下分解为NH3和CO2，NH3可被细菌用于合成微生物蛋白质(MCP)亦称菌体蛋白质。在瘤胃中被发酵而分解的蛋白质称为瘤胃降解蛋白质(RDP)。

②皱胃和小肠：未经瘤胃微生物降解的饲料蛋白质直接进入后部胃肠道，通常称这部分饲料蛋白质为过瘤胃蛋白质(RBPP)，亦称未降解蛋白质(UDP)。过瘤胃蛋白质与瘤胃微生物蛋白质一同由瘤胃转移至皱胃，随后进入小肠，其蛋白质的消化过程和单胃动物相近，靠胃肠道分泌的蛋白质酶水解。 (2)吸收

反刍动物对蛋白质消化产物的主要吸收部位是瘤胃和小肠。

瘤胃壁对NH3的吸收能力极强，瘤胃蛋白质的降解产物—NH3，除用于合成细菌蛋白质外，瘤胃壁粘膜扩散吸收进入门静脉，据测定当瘤胃中NH3的浓度不超过10mg%时，细菌对其利用性很高，当达到0mg%时，大量氨被瘤胃壁所吸收，被吸收的NH3随血液循环进入肝脏，通过鸟氨酸循环合成尿素，所生成的尿素大部分进入肾脏随尿排出，部分可进入唾液腺随唾液返回瘤胃或通过瘤胃壁由血液又扩散回瘤胃，再次被微生物合成菌体蛋白，由于这一过程是反复循环的，所以称之为“瘤胃—肝脏的N素循环”(或称“尿素循环”)，瘤胃亦可吸收少量的游离氨基酸。

小肠对蛋白质的吸收形式同单胃动物一样，亦是氨基酸。

进入盲肠和结肠的含N物质主要是未消化的蛋白质和来自血液的尿素，在此降解和合成的氨基酸几乎完全不能被吸收最终以粪的形式排出。 代谢特点：

(1)蛋白质消化吸收的主要场所是瘤胃，靠微生物的降解，其次是在小肠，在酶的作用下进行。

(2)反刍动物不仅能大量利用饲料中的蛋白质，而且也能很好地利用氨化物。 (3)饲料蛋白质在瘤胃进行较大改组，通过微生物合成饲粮中不曾有的氨基酸。 (4)反刍动物的小肠可消化蛋白质来源于瘤胃合成的微生物蛋白质和饲料过瘤胃蛋白质。

(5)瘤胃微生物蛋白质品质好，仅次于优质动物蛋白质，与豆饼、苜蓿叶蛋白质相当，而优于大多数谷物蛋白质。

2、 蛋白质的一级结构及其在结构层次中的作用。 一、蛋白质一级结构与功能的关系 （一）种属差异

对不同机体中表现同一功能的蛋白质的一级结构进行详细比较，发现种属差异十分明显。例如比较各种哺乳动物、鸟类和鱼类等胰岛素的一级结构，发现它们都是由51个氨基酸组成的，其排列顺序大体相同但有细微差别。不同种属的胰岛素其差异在A链小环的8、9、10和B链30位氨基酸残基。说明这四个氨基酸残基对生物活性并不起决定作用。起决定作用的是其一级结构中不变的部分。有24个氨基酸始终不变，为不同种属所共有。如两条链中的6个半胱氨酸残基的位置始终不变，说明不同种属的胰岛素分子中AB链之间有共同的连接方式，三对二硫键对维持高级结构起着重要作用。其他一些不变的残基绝大多数是非极性氨基酸，对高级结构起着稳定作用。

对不同种属的细胞色素C的研究同样指出具有同种功能的蛋白质在结构上的相似性。细胞色素C广泛存在于需氧生物细胞的线粒体中，是一种含血红素辅基的单链蛋白，由124个残基构成，在生物氧化反应中起重要作用。对100个种属的细胞色素C的一级结构进行了分析，发现亲缘关系越近，其结构越相似。人与黑猩猩、猴、狗、金枪鱼、飞蛾和酵母的细胞色素C比较，其不同的氨基酸残基数依次为0、1、10、21、31、44。细胞色素C的氨基酸顺序分析资料已经用来核对各个物种之间的分类学关系，以及绘制进化树。根据进化树不仅可以研究从单细胞到多细胞的生物进化过程，还可以粗略估计各种生物的分化时间。 （二）分子病

蛋白质分子一级结构的改变有可能引起其生物功能的显著变化，甚至引起疾病。这种现象称为分子病。突出的例子是镰刀型贫血病。这种病是由于病人血红蛋白β链第六位谷氨酸突变为缬氨酸，这个氨基酸位于分子表面，在缺氧时引起血红蛋白线性凝集，使红细胞容易破裂，发生溶血。血红蛋白分子中共有574个残基，其中2个残基的变化导致严重后果，证明蛋白质结构与功能有密切关系。

用氰酸钾处理突变的血红蛋白(HbS)，使其N端缬氨酸的α氨基酰胺化，可缓解病情。因为这样可去掉一个正电荷，与和二氧化碳结合的血红蛋白相似，不会凝聚。现在正寻找低毒试剂用以治疗。

（三）共价修饰

对蛋白质一级结构进行共价修饰，也可改变其功能。如在激素调节过程中，常发生可逆磷酸化，以改变酶的活性。 （四）一级结构的断裂

一级结构的断裂可引起蛋白质活性的巨大变化。如酶原的激活和凝血过程等。 凝血是一个十分复杂的过程。首先是凝血因子XII被血管内皮损伤处带较多负电荷的胶原激活，然后通过一系列连续反应，激活凝血酶原，产生有活性的凝血酶。凝血酶从纤维蛋白中切除4个酸性肽段，减少分子中的负电荷，使其变成不溶性的纤维蛋白，纤维蛋白再彼此聚合成网状结构，最后形成血凝块，堵塞血管的破裂部位。

根据激活凝血因子X的途径，可分为内源途径和外援途径。前者只有血浆因子参与，后者还有血浆外的组织因子参与，一般是机体组织受损时释放的。内源途径中凝血因子XII被血管内皮损伤处带较多负电荷的胶原纤维激活，也可被玻璃、陶土、棉纱等异物激活。凝血因子XIIa激活凝血因子XI，此时接触活化阶段完成，反应转移到血小板表面进行，称为磷脂胶粒反应阶段，产生凝血因子Xa，最终激活凝血酶。最后一个阶段是凝胶生成阶段，产生凝块。 3、 酮体的生成？它与糖代谢的关系。 酮体的生成和利用

- 1 - 酮体的生成和利用 酮体是脂肪酸在肝内分解氧化时的正常中间代谢产物，它包括乙酰乙酸、β-羟丁酸及丙酮三种有机物质。其中β-羟丁酸含量较多，丙酮含量极微。 （1） 酮体的生成 以乙酰CoA为原料，在肝线粒体经酶催化先缩合，后再裂解而生成酮体，除肝之外，肾也含有生成酮体的酮体系。酮体的合成过程可分三步进行。 ① 首先由两分子乙酰CoA在硫解酶的作用下缩合生成乙酰乙酰CoA，同时释放 出一分子CoA-SH。【反应式1

】 ② 然后，乙酰乙酰CoA再与一分子乙酰CoA结合生成6个碳的3-羟甲基戊二酸单酰CoA（HMGCoA），并释放出CoA-SH，此反应是由HMGCoA合成酶催化的，该酶在肝线粒体含量极高。【反应式2 】 ③ 乙酰乙酸被还原生成β-羟丁酸，该还原反应是由紧密结合在线粒体内膜上的β-羟丁酸脱氢酶（此酶在肝中活性极高）催化，还原反应所需的氢由NADH提供。该 反应速度取决于NADH／NAD+ 之比值。部分乙酰乙酸还可缓慢地自发脱羧，亦可经乙酰乙酸脱羧酶催化脱羧生成丙酮。 【肝内酮体的生成】

肝含有合成酮体的酶体系，故能生成酮体，但肝缺乏利用酮体的酶，因此不能氧化酮体，肝产生的酮体需经血液运输到肝外组织进一步氧化分解。 （2） 酮体的利用 酮体的生成和利用

- 2 - 酮体被氧化的关键是乙酰乙酸被激活为乙酰乙酸辅酶A，激活的途径有两种：一是在肝外组织细胞的线粒体内，β－羟丁酸经β－羟丁酸脱氢

酶作用，被氧化生成乙酰乙酸，乙酰乙酸与琥珀酰CoA在β－酮脂酰CoA转移酶（β-ketoacyl CoA transferase）（3-氧酰CoA转移酶），即琥珀酰CoA；乙酰乙酸辅酶A转移酶催化下，生成乙酰乙酰CoA，同时放出琥珀酸。另一途径是在有HSCoA和ATP存在时，由乙酰乙酸硫激酶催化，使乙酰乙酸形成乙酰乙酰辅酶A，后者再经硫解生成两分子乙酰CoA。乙酰CoA进入三羧酸循环被彻底氧化。【肝外组织对酮体的利用】 丙酮不能按上述方式氧化，它可随尿排出。丙酮易挥发，如血中浓度过高时，丙酮还可经肺直接呼出。 肝是生成酮体的器官，但缺乏氧化酮体的酶，故肝中酮体不能氧化；肝外组织缺乏HMG CoA裂解酶，不产生酮体，却可氧化利用酮体。 【酮体的性质】 （3） 酮症 正常情况下，血中酮体含量很少，每1OOml血中酮体含量低于3mg（0.3mmol／L）。但在饥饿、高脂低糖膳食及糖尿病时，脂肪动员加强，脂肪酸氧化增多，酮体生成过多，超过肝外组织利用酮体的能力，引起血中酮体升高，当高过肾回收能力时，则尿中出现酮体，即为酮症（ketosis）。因酮体中乙酰乙酸及β－羟丁酸都是相对强的有机酸，如在体内堆积过多可引起代谢性酸中毒。 饥饿、高脂低糖膳食及糖尿病均造成体内糖氧化利用的减低，呈现胰高血糖素与胰岛素的比值升高，，则大量脂酰CoA转移入线粒体进行氧化，产生大量乙酰CoA。另外还使脂解作用增强，则长链脂酰CoA增多而堆积起来。在线粒体内，此时由于脂酰CoA特别是长链脂酰CoA增多，通过别构抑制柠檬酸合成酶，致使乙酰CoA难于进入三羧酸循环氧化，在肝内堆积的乙酰CoA缩合生成酮体。过多的酮体将随血液循环运至肝外组织氧化利用，肝外组织氧化酮体是有一定限度的。当血酮体过高，如超过肝外组织氧化能力时，则血中酮体将堆积，尿中出现大量酮体，呈现酮症。 【糖代谢紊乱与酮症的关系】

（4） 酮体生成的生理意义 ① 肝脏输出酮体为肝外组织提供了能源。 ② 肝脏输出酮体对低血糖时保证脑的供能，以维持其正常生理功能方面起着重要作用。 甘油的代谢 甘油在组织细胞内的氧化，必须先在甘油磷酸的催化下，形成α-甘油磷酸，后者脱氢后生成二羟丙酮磷酸，然后再沿糖代谢的途径分解或沿酵解逆行的途径生成糖。肝、肾和肠粘膜等组织含有丰富的甘油磷酸激酶，但在肌肉和脂肪组织细胞内，这种酶的活性很低。

4、 羊毛衫热水洗涤后容易皱缩，而蚕丝蛋白则没有这种现象，为什么？ *

这里牵涉到蚕丝蛋白和羊毛蛋白的结构问题.

羊毛是由α角蛋白组成的.α角蛋白由两条链构成,相互盘绕,每条链自身又有所盘绕,因此α角蛋白就是一个螺旋的螺旋结构,可以将它想象成两个弹簧互相围绕着同一个轴盘绕而成.因此α角蛋白有着很好的弹性.当在纺成毛线的时候,外力会将蛋白进行一定程度的拉扯,使得螺旋的间隙变大,而水洗时这些螺旋在水分子的帮助下重新恢复了旧有的结构,因此会发生皱缩

而蚕丝蛋白是由β丝蛋白构成的.β丝蛋白由若干条肽链平行组成,肽链之间通过氢键（氢键就是一种分子间的作用力）相连,每条链自身采用锯齿状的折叠.这种情况其实已经是蛋白质充分伸展下的情况,在外力的作用下即使蛋白质被拉断结构很难发生变化.因此抽丝的时候蛋白质并不会像羊毛中α角蛋白那样被“拉开”,所以水洗的时候自然也不会变形了.

5、 真核生物与原核生物DNA复制的不同之处？DNA复制具备什么条件？

原核生物与真核生物DNA复制共同的特点： 1分为起始、延伸、终止三个过程； 2必须有提供3’羟基末端的引物；

3亲代DNA分子为模板,四种脱氧三磷酸核苷(dNTP)为底物,多种酶及蛋白质 ：DNA拓扑异构酶、DNA解链酶、单链结合蛋白、引物酶、 DNA聚合酶、RNA酶以及DNA连接酶等.

4一般为双向复制、半保留复制、半不连续复制. 原核生物与真核生物DNA复制不同的特点：

1真核生物为线性DNA,具有多个复制起始位点,形成多个复制叉,DNA聚合酶的移动速度较原核生物慢.原核生物为一般为环形DNA,具有单一复制起始位点. 2真核生物DNA复制只发生在细胞周期的S期,一次复制开始后在完成前不再进行复制,原核生物多重复制同时进行. 3真核生物复制子大小不一且并不同步.

4原核生物有9-mer和13-mer的重复序列构成的复制起始位点,而真核生物的复制起始位点无固定形式.

5真核生物有五种DNA聚合酶,需要Mg+.主要复制酶为DNA聚合酶δ（ε）,引物由DNA聚合酶α合成.原核生物只有三种,主要复制酶为DNA聚合酶III. 6真核生物末端靠端粒酶补齐,而原核生物以多联体的形式补齐.

7真核生物冈崎片段间的RNA引物由核酸外切酶MF1去除,而原核生物冈崎片段由DNA聚合酶I去除.8真核生物DNA聚合酶γ负责线粒体DNA合成.9真核生物DNA聚合酶δ的高前进能力来自于RF-C蛋白与PCNA蛋白的互相作用.原核生物DNA聚合酶III的前进能力来自与γ复合体（夹钳装载机）与β亚基二聚体（β夹钳）的相互作用

DNA复制具备条件：

原料：四种游离的脱氧核苷酸（A.T.C.G） 模版：DNA的两条母链 酶：解旋酶,聚合酶,DNA连接酶 能量：ATP

6、 当溶液的PH为丙氨酸等电点时，它以什么形式存在？

在某一PH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时的溶液ph称该氨基酸的等电点。 7、 操纵子与操纵基因的概念？它们在基因表达中的作用？

操纵子是由一个或多个相关基因以及调控他们转录的操纵因子启动子序列组成的基因表达单位。操纵基因控制操纵子中结构基因转录的基因，位置在结构基因的前端，可与调节基因编码的阻遏蛋白结合，抑制转录。

原核生物大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的。操纵子通常由 2个以上的编码序列与启动序列、操纵序列以及其他调节序列在基因组中成簇串联组成。启动序列是RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列。多种原核基因启动序列特定区域内，通常在转录起始点上游-10及-35区域存在一些相似序列，称为共有序列。大肠杆菌及一些细菌启动序列的共有序列在-10区域是TATAAT，又称Pribnow盒（PribnowBox），在-35区域为 TTGACA。这些共有序列中的任一碱基突变或变异都会影响RNA聚合酶与启动序列的结合及转录起始。因此，与共有序列的一致度决定启动序列的转录活性大小。操纵序列是原核阻遏蛋白的结合位点。当操纵序列结合阻遏蛋白时会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或使RNA聚合酶不能沿DNA向前移动，阻遏转录，介导负性调节。原核操纵子调节序列中还有一种特异DNA序列可结合激活蛋白，使转录激活，介导正性调节。

8、 核糖体的功能？真核与原核生物核糖体的不同？

9、 氨基酸层析的分离依据于氨基酸的那些特性？离子交换层析中选择洗脱液应该那些因素？

2012年

1、名词解释 （考查基础知识） 2、尿素使蛋白变性的机制

第一种机制是变性蛋白质能与尿素和盐酸胍优先结合,形成变性蛋白质-变性剂复合物,当复合物被除去,从而引起N→D反应平衡向右移动.随着变性剂浓度的增加,天然状态的蛋白质不断转变为复合物,最终导致蛋白质完全变性.然而,由于变性剂与变性蛋白的结合是非常弱的.因此,只有高浓度的变性剂才能引起蛋白质完全变性;第二种机制是尿素与盐酸胍对疏水氨基酸残基的增溶作用.因为尿素和盐酸胍具有形成氢键的能力,当它们在高浓度时,可以破坏水的氢键结构,结果尿素和盐酸胍就成为非极性残基的较好溶剂,使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加. 尿素和盐酸胍引起的变性通常是可逆的,但是,在某些情况下,由于一部分尿素可以转变为氰酸盐和氨,而蛋白质的氨基能够与氰酸盐反应改变了蛋白质的电荷分布.因此,尿素引起的蛋白质变性有时很难完全复性. 还原剂(半胱氨酸,抗坏血酸,β-巯基乙醇,二硫苏糖醇)可以还原二硫交联键,因而能改变蛋白质的构象.

3、列举两个实验证明protein-protein相互作用（2007） 4、列举两个实验证明protein-DNA相互作用 二、凝胶阻滞实验 1. 概念：

凝胶阻滞实验（Gelretardationassay），要叫做DNA迁移率变动试验（DNAmobilityshiftassay）或条带阻滞实验（Bandretardationassay）是在八十年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 2. 原理：

在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比。如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质，那么

由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，于是朝正极移动的距离也就相应的缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带，这就是凝胶阻滞实验的基本原理。 3. 过程：

首先制备细胞蛋白质提取物（理论上其中含有某种特殊的转录因子） 用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子的结合位点） 这种被标记的探针DNA同细胞蛋白质提取物一起进行温育，于是产生DNA-蛋白质复合物

在控制使DNA-蛋白质保持结合状态的条件下，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

最后进行放射自显影，分析电泳结果 4. 实验结果的分析：

（1）如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部，这就表明在细胞提取物中不存在可以同探针DNA相互结合的转录因子蛋白质.

（2）如果在凝胶的顶部出现放射性标记的条带，这就表明细胞提取物存在可与探针DNA结合的转录因子蛋白质。 5. DNA竞争实验：

DNA竞争实验（DNAcompetitiveassay）的具体做法如下：

在DNA-蛋白质结合的反应体系中加入了超量的非标记的竞争DNA（competitorDNA），如果它同探针DNA结合的是同一种转录因子蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分转录因子蛋白质都会被竞争结合掉，而使探针DNA仍然处于自由的非结合状态，可以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。

如果反应体系中加入的竞争DNA并不能同探针DNA竞争结合同一种转录因子，结果在电泳凝胶中的放射自显影图片上就会出现阻滞的条带。 6. 应用：

（1）凝胶阻滞实验可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有转录因子结合位点）结合的转录因子蛋白质； （2）DNA竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位； （3）通过竞争DNA中转录因子结合位点的碱基突变可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的影响；

（3）也可以利用DNA同特定转录因子的结合作用通过亲和层析来分离特定的转录因子。 三、足迹实验 1. 定义：

足迹实验（foot-printingassay），是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。 2. 原理：

当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI酶的切割作用，而不会产生出相应的切割分子，结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区，俗称为“足迹”。 3. 过程：

将待检测的双链DNA分子在体外用32P作5‘末端标记，并用适当的限制性内切酶切出其中的一个末端，于是便得到了一条单链末端标记的双链DNA在体外同细胞蛋白质提取物（细胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白质复合体在反应混合物中加入少量的DNaseI，并控制用量使之达到平均每条DNA链，只发生一次磷酸二酯键的断裂：

（1）如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特定蛋白质，使DNaseI消化之后，便会产生出距离放射性标记末端1个核苷酸，2个核苷酸，3个核苷酸------等等一系列前后长度均相差一个核苷酸的不间断的连续的DNA片段梯度群体. （2）如果DNA分子同蛋白质提取物中的某种转录因子结合，被结合部位的DNA就可以得到保护免受DNaseI酶的降解作用.

除去蛋白，加样在20%序列胶上进行电泳分离，实验分两组： 实验组：DNA+蛋白质混合物

对照组：只有DNA，未与蛋白质提取物进行温育

最后进行放射性自显影，分析实验结果。 4. 结果判断:

实验组凝胶电泳显示的序列，出现空白的区域表明是转录因子蛋白质结合部；与对照组序列比较，便可以得出蛋白质结合部位的DNA区段相应的核苷酸序列。 5. 其他的足迹实验方法：

除了DNase1足迹试验之外，目前还发展出了若干种其他类型的足迹实验，例如：

a. 自由羟基足迹实验；b、菲咯啉铜足迹实验；c、DMS（硫酸二甲酯）足迹实验

DMS（硫酸二甲酯）足迹实验的原理

DMS能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割。如果DNA分子中某一区段同转录因子结合，就可以避免发生G残基的甲基化而免受六氢吡啶的切割作用。 四、甲基化干扰实验 1. 概念：

甲基化干扰实验（Methylationinterferenceassay）是根据DMS（硫酸二甲酯）能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同DNA相互作

用的实验方法。

应用这种技术可以检测靶DNA中G残基的优先甲基化，对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细的揭示出DNA与蛋白质相互作用的模式。 2. 实验步骤：

用DMS处理靶DNA使之局部甲基化（平均每条DNA只发生一个G碱基甲基化作用）同细胞蛋白质提取物一起进行温育，促进使DNA与蛋白质的结合 进行凝胶电泳形成两种靶DNA条带：

（1）其一没有同蛋白质结合的DNA正常电泳条带 （2）其二同特异蛋白质结合而呈现滞后的DNA电泳条带

将这两种DNA电泳条带分别从凝胶中切出，并用六氢吡啶进行切割，结果为： （1）甲基化的G残基被切割:因为转录因子蛋白质只能够同未发生甲基化的正常的结合位点结合，所以在转录因子DNA结合位点序列中的G残基如果被DMS甲。

（2）不具有甲基化G残基的靶DNA序列则不会被切割将结合蛋白质的DNA条带和不结合蛋白质的DNA条带，经六氢吡啶切割作用之后，再进行凝胶电泳。作放射自显影，读片并分析结果 3. 结果判断：

（1）同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割之后，电泳分离呈现两条带，有一个空白区。

（2）不同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割后，电泳分离呈现三条带，没有空白区域的出现。 4. 应用：

（1）甲基化干扰实验可以用来研究转录因子与DNA结合位点中的G残基之间的联系。

（2）是足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹实验中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。 5、缺点：

DMS只能使DNA序列中的G和A残基甲基化，而不能使T和C残基甲基化。 五、体内足迹实验

上面讨论的三种研究转录因子与DNA相互作用的方法，有一个共同的不足之处在于它们是在体外进行的实验，因此人们就会考虑这些实验结果是否能够反映细胞内发生的真实生命过程，即细胞内发生的真实的DNA与蛋白质的相互作用情况。

为了解答这个问题，科学家就设计出了一种体内足迹试验（invivofoot-printingassay），该方法可以看做是体外DMS足迹实验的一个变种。 1. 原理：

体内足迹试验的原理原则上同体外DMS足迹实验无本质差别，即

（1）DMS能够使G残基甲基化。

（2）六氢吡啶能特异的切割甲基化的G残基。

（3）同特异转录因子蛋白质结合的识别序列中的G残基由于受到蛋白质的保护而不会被DMS甲基化，于是不会被六氢吡啶切割。

（4）同对照的裸露的DNA形成的序列梯作比较，就会发现活细胞DNA形成的序列梯中缺少G残基没有被切割的相应条带。 2. 过程：

用有限数量的化学试剂DMS处理完整的游离细胞，使渗透到胞内的DMS浓度恰好导致天然染色体DNA的G残基发生甲基化 ↓

对这些经过DMS处理的细胞提取DNA，并在体外加入六氢吡啶作消化反应 ↓

PCR扩增后作凝胶电泳分析，因为在体外实验中用的是克隆的DNA片段其数量足够，而在体内足迹实验中用的是从染色体DNA中分离获得的任何一种特异的DNA，其数量是微不足道的，所以需要经PCR扩增以获得足够数量的特异DNA放射自显影，读片并记录读片的结果 3. 结果判断：

（1）能够同转录因子蛋白质结合的DNA区段其中G残基受到保护因而不会被DMS甲基化避免了六氢吡啶的切割作用；

（2）体外裸露的DNA分子上，G残基被DMS甲基化而被六氢吡啶切割。 六、拉下实验（Pull-downassay）

拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验（bindingassayinvitro），是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法。其基本原理是将某种小肽（例如生物素、6-His标签以及谷胱甘肽转移酶等）的编码基因与诱饵蛋白的编码基因重组，表达为融合蛋白。

分离纯化融合蛋白并与磁珠结合，使之固相化之后，再与表达目的蛋白的细胞提取物混合保温适当时间，例如在4℃下保温过夜，使目标蛋白同已经固定在磁珠表面的融合蛋白中的诱饵蛋白充分的结合。

离心收集与固定化的融合蛋白（即与磁珠相互结合的融合蛋白）中的诱饵蛋白相结合的目的蛋白，经过煮沸处理使目的蛋白与诱饵蛋白相脱离从而从固相支持物（例如磁珠）上脱离下来，收集样品，再与目标蛋白的抗体作Westernblotting分析，以检测出与诱饵蛋白的目标的目标蛋白。 5、分析题：考查制备分离纯化抗体的实验设计。

单克隆抗体的制备步骤：（1）感兴趣的抗原免疫小鼠脾脏，制备B淋巴细胞悬浮液（2）繁殖小鼠骨髓瘤细胞（3）将B细胞和骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞系，在培养物中不断增殖，但是只合成一种抗体（4）细胞转移到只有杂交瘤细胞才能生长的介质中进行选择性培养（5）用ELISA筛查并找出分泌抗感兴趣蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株（6）所得的细胞株进行扩大化培养，

从培养物中纯化所需的单克隆抗体。

2013

一、名词解释（5’X6）

1、 泛素化：泛素（一类低分子量的蛋白质）分子在一系列特殊的酶作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并对靶蛋白进行特异性修饰的过程。

2、 半保留复制：DNA复制的一种方式。每条链都可用作合成互补链的模板，合成出两分子的双链DNA，每个分子都是由一条亲代链和一条新合成的链组成。

3、 冈崎片段（1997年）

4、 Klenow和DNA聚合酶I：E.coli DNA聚合酶I经部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。

5、 同工酶（1997）和异构酶：亦称异构化酶，是催化生成异构体反应的酶之总称。

6、 tRNA：一类携带激活氨基酸，将它带到蛋白质合成部位并将氨基酸整合到生长着的肽链上RNA。TRNA含有能识别模板mRNA上互补密码的反密码。 二、列举4种蛋白质翻译后修饰（4’

翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)是指对翻译后的蛋白质进行共价加工的过程。它通过在一个或多个氨基酸残基加上修饰基团，可以改变蛋白质的物理、化学性质，进而影响蛋白质的空间构象和活性状态、亚细胞定位、折叠及其稳定性以及蛋白质-蛋白质相互作用。蛋白质翻译后修饰的丰度变化在生命活动研究中具有重大意义，异常的翻译后修饰会导致多种疾病的发生。

磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性，以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受成为一种最普遍的调控手段。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程，几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、细胞骨架调控、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢及肿瘤发生等生命活动的所有过程，并且可逆的蛋白质磷酸化是目前所知道的最主要的信号转导方式。目前已经知道有许多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。

乙酰化修饰是体内高度保守的可逆转的蛋白修饰，对细胞核内转录调控因子的激活有着非常重要的作用。此外，还存在大量的非组蛋白乙酰化修饰参与了代谢通路及代谢酶活性的调节。安必奇生物采用肽段预分离降低高丰度组蛋白对蛋白乙酰化鉴定的影响，再结合免疫共沉淀通过高效的抗体富集乙酰化的肽段，从而实现大规模乙酰化的鉴定及定量。

泛素化修饰是一种重要的翻译后修饰。泛素-蛋白酶体系统介导了真核生物体内80%~85%的蛋白质降解。此外，泛素化修饰还可以直接影响蛋白质的活

性和定位，调控包括细胞周期、细胞凋亡、转录调控、DNA 损伤修复以及免疫应答等在内的多种细胞活动。

糖基化是在酶的控制下,蛋白质或脂质附加上糖类的过程,发生于内质网和高尔基体等部位。在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质,和蛋白质上的氨基酸残基共价结合。蛋白质经过糖基化作用,形成糖蛋白。糖基化是对蛋白的重要的修饰作用,有调节蛋白质功能作用。凝素亲和法是目前糖蛋白质组学中应用最广泛的分离富集方法。凝集素（lectin）是一类糖结合蛋白质，能专一识别某一特殊结构的单糖或聚糖中特定的糖基序列而与之结合，它们与糖链可逆非共价结合，糖蛋白或糖肽被凝集素捕获之后，通常用特定的单糖通过竞争结合凝集素将糖蛋白或糖肽洗脱下来。蛋白质经过酶解后利用凝集素（lectin）富集N-糖基化肽段，然后用N-糖酰胺酶（PNGase）在H218O中切除连接在天冬酰胺残基（Asn）上的糖链。该处理致使Asn分子量增加2.9890Da。最后用高精度LC-MS质谱仪检测脱糖后的肽段，并通过MASCOT软件检索数据库，确认脱糖后分子量与其理论分子量的变化以及糖基化修饰肽段的序列，从而确定该蛋白质的N-糖基化位点。

三、利用等电点分离纯化蛋白的原理（4’ （2000）

使分子处于兼性分子状态，在电场中不迁移（分子的静电荷为零）的pH值。 四、酵母单杂和酵母双杂的原理（2007）和应用（6’

酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA—bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。

应用酵母单杂交体系已经识别并验证了许多与目的DNA序列结合的蛋白质，同时单杂交技术还被应用于识别金属反应结合因子。正向与反向单杂交体系的结合，还可用于筛选阻碍DNA与蛋白质相互作用的突变的单个核苷酸。 目前，在研究DNA—蛋白质相互作用中，酵母单杂交体系主要有以下3种用途：①确定已知DNA—蛋白质之间是否存在相互作用;②分离结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因;③定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域，以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。 酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上发展起来的技术，酵母单杂交主要用于研究蛋白质和DNA的相互作用，而酵母双杂交主要是用于研究蛋白质间的相互作用。

五、乳化作用？去污剂作用原理？（6’

乳化作用是将一种液体分散到第二种不相溶的液体中去的过程．最大一类的乳化剂是肥皂.

六、质子泵的作用原理（6’

质子泵指能逆浓度梯度转运氢离子通过膜的膜整合糖蛋白。质子泵的驱动依赖于ATP水解释放的能量，质子泵在泵出氢离子时造成膜两侧的pH梯度和电位梯度。电子传递导致复合体的构象变化。质子的转移是氨基酸侧链pK值变化产生影响的结果。构象变化造成氨基酸侧链pK值的改变，结果发挥质子泵作用的侧链暴露在外并交替地暴露在线粒体内膜的内侧或外侧，从而使质子发生移位。这种系统即认为是质子泵的机制。

七、用G蛋白偶联受体或生长素为例说明激素信号转导的生化机制 （一）第二信使

含氮激素有较强的极性，不能进入靶细胞（甲状腺素例外），通过与靶细胞表面受体结合发挥作用。这些激素称为第一信使，与受体结合后，在细胞内形成传递信息的第二信使，发挥作用。激素的前三种作用机制都属于第二信使模式。已经发现的第二信使有cAMP、cGMP、Ca2+、三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG)等。

他们具有以下特点： 1.由激素引发形成

2.合成与灭活容易（可通过一步反应完成） 3.浓度低（在10-7mol/L以下），变化大，寿命短

4.生成与灭活都受激素控制，能及时有效地调控其浓度水平 5.能调节细胞的代谢。 （二）第二信使的生成

激素－受体－第二信使调节系统的膜内装置包括三部分：受体、G蛋白和催化第二信使形成的酶。G蛋白是一系列鸟苷酸结合调节蛋白，在细胞内信号传导途径中起着重要作用的GTP结合蛋白，由α，β，γ三个不同亚基组成。形成激素－受体复合物后，受体变构，导致复合物与结合着GDP的专一G蛋白结合，形成三元复合物，然后G蛋白变构，复合物解体，生成G-GTP复合物，此复合物再与有关酶结合，使其活化，形成第二信使。最后G蛋白的GTP酶活性将GTP水解为GDP，释放出无活性的酶，准备下一次反应。

在专一性G蛋白的转导下，腺苷酸环化酶与鸟苷酸环化酶分别催化cAMP、cGMP的生成。磷脂酶C催化二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解，生成1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG)。

G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors， GPCRs）,是一大类膜蛋白受体的统称。这类受体的共同点是其立体结构中都有七个跨膜α螺旋，且其肽链的C端和连接第5和第6个跨膜螺旋的胞内环上都有G蛋白（鸟苷酸结合蛋白）的结合位点。G蛋白偶联受体传递信号的机理包括几个主要步骤：首先来自细胞膜外侧的配体与受体相结合，引起后者的构象变化，这个过程也称为受体的激活。发生了构象变化的受体随即会激活附着在其细胞膜内侧端的G蛋白，

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