RNAi CyclinE对肝癌HepG2细胞生长及细胞周期的影响

RNAi CyclinE对肝癌HepG2细胞生长及细胞周期的影响

摘

要

方 法

根据

s

i

R

N A 目标序列的选取

原

设计 并合成 2 对 cyclin E 基 因靶 向 siR N A 序 列 的 D N A 单 链 ， 退 火 成

双 链 发 卡 样 D N A ; 将 其 重 组 入 siR N A 载 体 pG FP-V -R S ; 得到

重组子 pG FP -V -R S-siC E 951 和 pG FP -V -R S-siC E 1122 ; 对重组 子 的插 入 序 列进 行 D N A 序 列测 定 ，并 与 设 计 序 列 做 同源 性 比较 。利 用 脂 质 体 Lipofec t A m ine? 2000 包裹，将 pG FP-V -R S-siC E951、pG FP-V -R S-s iC E 11

2

2

和

p

G

F

P

-V -C

o n 分别转入

人肝癌细 胞 的 增 殖 ，软 琼 脂 克 隆 形 成 检 测 胞 克 隆 形 成 能

力 。

结 果

1. 经 过 同源 性 检 索 和 优 选 确 定 95 1-96 9 位 （G C A A A A G G T T T C A G G G T A T ) 、 1 122 -114 0 位 (G G A C A A A G C C C G A G C A A A G ) 为 siR N A 靶 序 列 。

2. 筛选 得到重组子 pG FP -V -R S-siC E 95 1 和 pG FP -V -R S-siC E 1122 ，测序分 析其 插 入 序 列 与 设 计 完 全 一 致 。

3. 干 扰 1 组 （转 染 pG F P-V -R S-siC E 95 1 ) 和 干 扰 2 组 （转 染 PG FP -V -R S-siC E 1122 ) 细 胞 cyclin E m R N A 的 相 对 表 达 量 分 别 为 0 .2 15±0 .02 1 和 0 .17 8±0 .0 19 ，显 著 低 于 空 白对 照 组 和 无 关 siR N A 对 照 组 （

分 别为 0.406±0.037 和 0.372±0.042 , p<0.05 ) ；在空 白对照组与无关 siR N A 对照组之 间，cyclin E

m R

N

A 4 . 空 白对 照 组 、 无 关 siR N A 对 照 组 、干 扰 1 组 和 干 扰 2 组 细 胞 在 大

约 54K D

处 均 有 免 疫 印 迹 出现 ， 其 中 空 白对 照 组 和 无 关 siR N A 对 照 组 的 免 疫 印 迹 显

著 强 于 干 扰 1 组 和 干 扰 2 组 。 5. 细 胞 增 殖 实验 显 示 ，干 扰 1 组 和 干 扰 2 组 与 空 白对 照 组 和 无 关 siR N A 对 照 组

比

< 0 .0 5 ) 。

6

摘 耍

性

差

异p< 0 .0 5)。

7. 软 琼 脂 集 落 形 成 能 力 实 验 显 示 ，干 扰 1 组 和 干 扰 2 组 平 均 集 落 形 成 数 为

12 4 .6±16 .3 和 14 1.2士15 .2 ，显 著 低 于 无 关 siR N A 对 照 组 和 空 白对 照 组 （

分 别 为 209.2士25.8 和 226.7±34 .2 , p < 0.05 )；空 白对 照 组 与无 关 siR N A 对 照 组平 均集落 形

成

数

比

较

，

差

异

无

显

著

性

结 论 1. cyclin E 95 1-969 位 （G C A A A A G G T T T C A G G G T A T ) 、 1 122-1140

位 ( G G A C A A A G C C C G A G C A A A G ) 为 靶 区 段 ， 构 建 的 siR N A

载 体 PG FP -V -R S-siC E 95 1 和 pG F P -V -R S-siC E l122 ，转 染人肝癌 H epG

2 细胞 能显 著 降低 细胞 cyclin E 基 因 的表 达 ，是理 想 的 siR N A 靶 区段 。

2. 抑制 肝癌 H epG 2 细胞 cyclin E 基 因表达 ，可 以使肝癌细 胞 S 和 G 2/M 期细 胞 比例 减 少 ，G 0/G 1 期细 胞 比例增 加 ，可 以降低 肝癌 H epG 2 的生长速

度 和

细 胞 软 琼 脂 集 落 形 成 能

力 。

关键 词 ：周期蛋 白 E ; 肝癌 ；H epG 2 ，细 胞周 期 ；细 胞增 殖 ； I I I

A b s tra c t

T h e effect o f C y clin E R N A i o n th e g row th a n d cell cy cle o f

H ep a to cellu la r ca rcin o m a cells H ep G 2

P o stg rad uate H ai-qu an Jia

T u to r G u o -q ian g Z h ao M in g -Y ao Z h ao

D ep artm ent o f P ath yp h sio lo gy ,C o lleg e o f B asic M ed ical S

cien ce Z h en g zh ou U n iv ersity

Z h en gz h o u 4 50 0 0 1

A b s t ra c t

B ack g ro u n d a n d a im s

U n contro lled p r o liferatio n in duced by deregu lat io n o f cell cycle is an im p o r tan t m ech an ism fo r tu m o r i g en e sis. cy cli n E w h i ch is a k i n d o f cy clin s, co m b in ed vvi ih C D K 2 , p lay s a g reat ro le in G l/S tran sition . O v erex p re ssio n o f cy clin E lead s to ex isti n g of cy clin E d u ring th e w ho le cell cy cle an d su b seq u en tl y activ ates C D K 2an d p rom otes ph o s ph o r y lat ion of pR b contin u ou sly an d th en indu ces tum origen esis as a resu l t o f in creased G l/S tran sitio n. A dd

i tio n a ll y , i n tracellu lar accu m u lat io n o f cy clin E lead s to ch rom o som e in stab

il i t y , w h ich is an altern at i v e m ech an ism for th e t u m orig enesis in du ced b y ov erex p r ession of cy clin E . I t is rep orted that cy clin E ov erexp r essio n w as

related to the centro so m e am p lificatio n an d st ru ctural ab n o rm ali t ies, in d icatin g th at o v erex p ression o f cy c lin E resu lted in c en t ro so m e ab n o rm alitie s an d th en in d u ced tu m o rig en e sis.

C y clin E is p r ob ab ly related t o h ep atic t u m o rig en esis.H ep ato cellu lar carcin

om a(H C C ) is th e m o st co m m o n tu m o r in th e w o rld . O u r co u ntry is p rev alen t fo r H C C an d o c cup ies o v er 5 0 % p op u l atio n s w h o w ere d ied o f H C C in th e w o rld . C lin ical stu d ies an d an im al ex p erim en t s sh o w ed th at o v erexp ression o f cy clin E w as ob serv ed in p atients w ith H C C an d w as prob ab ly relat ed to dif ferentiation , in v asion

I

A b stra c t

an d clin ical stag es o f H C

C .

B ased o n th e eff ect o f cy clin E on cell cy c le an d th e relation sh ip b etw een cy clin E an d H

C C , w e in v estigate the ef fect o f decreased ex p ressio n o f cy clin E o n th e grow th an d cell cycle of hep at ocellu lar carcin om a cells b y u sin g siR N A vector for cyclin E to inh ib i t th e expression of cyclin E in h ep atocellular carcin om a cells H ep G 2 .

M e t h o

d s

A ccord i ng to th e pri n cip l e o f selection of siR N A sequen c es, tw o single-stran ded D N A s targetin g to cy clin E siR N A w ere designed and ob tain ed and th en w ere fo rm ed in to d o ub le-stran d ed h airp in D N A by an n ealin g. T w o recom b in an t s o f p G F P -V -R S -siC E 9 5 1 an d p G F P -V -R S -siC E l122 w ere o b tain ed b y inertion o f h airp in D N A into siR N A v ector, p G F P -V -R S . T h e in serted seq u en ces w ere an aly z ed an d com p ared w ith d e sign ed seq u e n c es. C o n s tructed cy clin E siR N A

expr ess ion vect ors w er e t ransfect ed i nt o H epG 2 using Lipofect A m i ne? 2000. A l l

t h e cells w ere div id ed in to fo ur g roup s: silen cin g gro up 1 (tran sfect ed w ith pG F P -V -R S -siC E 9 5 1)? silen cin g group 1 (t ran sfected w ith pG F P -V -R S -siC E 112 2 ),unrelated siR N A co ntro l gro u p (tran sfected w ith p G F P -V -C on ) an d b lan k co ntro l group (ad ded by tran sfection reagent w it h out any tran sfection ). R T-P C R an d W estern -B lot w ere u sed to st u d y t h e ex p ressio n o f cy clin E in th e fou r gro up s. T h e cell cy cles and p roliferat ion of H ep G 2 cells w ere test ed by f low cytom et ry an d C C K -8 k i t resp ectiv ely. S o ftagar clo n e ex p erim en t w as u sed to test clo n e fo rm atio n o f H ep G 2 .

R e s u

lts

1 . G C A A A A G G T T T C A G G G T A T a n d G G A C A A A G C C C

G A G C A A A G w e re

selected as t h e siR N A targ etin g sequ en ces by h o m o lo go u s an aly sis.

2 . T w o recom b in an t s o f p G F P -V -R S -siC E 9 5 1 an d p G F P -V -R S -siC E 112 2 w h ich

w ere co n sisten t w ith our design s w ere o btain ed .

A b stra c t

unrelated siR N A an d b l ank co n t ro l gro u p s (0 .2 15±0 ,0 2 lan d0 .17 8士

0 .0 19 V S

0.4 06士0 .03 7 and 0 .3 72土0 .042 resp ectively , p <0 .0 5). T h e re w as n o sign

ificant

d iff eren c

e b etw een th e tw o con tro l gro u p s (p > 0 .0

5 ).

4 . C y cli n E exp resio n w as ob serv ed in all group s in w estern b lot exp erim

ents. I t is sh ow ed th at cyclin E expression w as h igher in unrelat ed siR N A

an d b lank cont ro l g roup s com p a red to silencin g grou p1 and 2 ,

5. In pro liferation t est,A t 3d ,4 d and 5d ,the ab s orban ce in silen cin g group 1

and 2decreased significan tl y com p ared w it h th e tw o cont rol group s (p <

0 .0 5).

6. C om p ared w i t h th e tw o contr ol group s,t h e n um b e r of cells i n si l en ci n g g

roup 1an d 2 sh ow ed decrease in S an d G 2/M and in crease in G 0/G 1 (p <

0 .0 5).St atistical sign ifi can ce w as n ot ob serv ed betw een the tw o

co ntro l gro up s (p> 0 .0 5).

7 . In so f tag a r clon e form ation exp e rim ent,t h e n u m b e r o f clones in silencin g group

1 an d

2 d ecrea sed sign ifican tly co m p ared w it h u nrelated siR N A an d b

lank contro l gro ups (124 .6士16 .3 an d 14 1.2±15 .2 V S 2 09 .2±2 5 .8 an d

2 2 6 .7士34 .2resp ectiv ely , p < 0 .0 5). T h ere w as no sign ifi cant d ifference

betw een th e tw o control group s (p> 0 .05 ).

C o n c lu s io n s

1. C on st ru ct ed cyclin E siR N A v ectors, p G F P -V -R S -siC E 9 5 1 an d

pG F P -V -R S -siC E 1122 ，in w hich G C A A A A G G T T T C A G G G T

A T an d

G G A C A A A G C C C G A G C A A A G w ere select ed as target

sequ e n ces,dram ati cally decreased exp ression of cy clin E in H ep G 2 .T h

erefore,th e selected target sequences w ere optim al fo r cyclin E siR N A .

2 . Inh ibition of cyclin E ex pressio n decreased the num ber o f cells enterin g

S an d G 2/M and increased the num ber of cells in G 0/G 1. A dd i ti o n a lly,

Inh ib i tion of cyclin E expression inh ib ited t h e gro w th of H ep G 2 .

K ey w o r d sr C yclin E ,hep atocellu lar carcin o m a,H ep G2 ,cellcycle,pro l iferation

目录

目录

正文部分

中英缩略词对照表I 前言1实验材料4实验方法9实验结果 2 1 \-m 2 9

参考文献 3 5综述部分

细胞周期蛋白 E 研究进展 3 9参考文献 4 8附录部分

麵59个人简介 6 0攻读硕士期间发表文章 6 0

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/5wme.html