最终版PCR SOP体系文件

基因扩增实验室 标准操作规程

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PCR实验室清洁程序 发布部门:XXXXXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XXXX 1

审核者:XXX 批准者:XXXX 文件编号:PCR(N)-SOP-003 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日 目的：保证实验室环境的整洁，防止污染。适于实验室工作环境、实验台面、工作服、移液器等的清洁消毒工作。实验室地面必须平整、干净，通道要利于通行，没有无用的物品阻碍。 3.2 合理规划实验室内物品，做到摆放整齐、有序，无用的或使用效率低的物品放置到储存处，

常用的物品要容易寻找到。

3.3 抽屉、柜子、文件类物品要作好标记，以方便识别。 3.4 实验结束后清洁台面，并用移动紫外灯进行消毒。

3.5 每周对使用过的移液器用75%酒精进行擦拭，若使用过程中发生污染应随时移液器咀进行

75%酒精浸泡15分钟左右。

3.6 实验过程中如发生标本或试剂外溅，应立即用浸有2000mg/L有效氯溶液滤纸盖上半小时，

然后用酒精擦洗，并用移动紫外灯消毒。

3.7 每天实验前开启各区的通风系统，各区实验结束后，分别打开传递窗紫外灯、移动紫外灯

（对实验台面消毒）、天花板紫外灯消毒实验室，每次开启 30～60分钟。 3.8 待紫外灯消毒时间足够后，依次关闭各区紫外灯并记录。

3.9 依次清洁三个区的实验台面和地面，各区清洁消毒工具均专用，不可混用，注意按照单一

方向流程的原则来进行清洁。 3.10 处理好各区废弃物，交医院集中处理。

3.11 每周将工作服交院洗衣房洗涤消毒，不同实验区的工作服隔开洗涤。

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PCR实验室废弃物处理程序 发布部门:XXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XXX 审核者:XXX 批准者:XXX 文件编号:PCR(N)-SOP-004 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日

目的：保证实验室、实验人员和外部环境的安全。

适用范围：核酸扩增荧光检测实验室常用化学试剂（NaOH、EDTA、乙醇、生理盐水等）、实验室

废弃物的处理； 细则：

1. 科室职责应对本室工作人员讲明本程序在预防交叉、实验室污染及切断传播途径中的重要性，

并要求严格执行。

2. 实验室所有垃圾，装入专用污物袋内，各区备有：生活垃圾袋（黑色）及生物污染垃圾袋（黄

色）。

3. 使用过的一次性消耗品(如试管、吸头、离心管、等)，置于盛2000mg/L有效氯消毒液的废物盒

中，使用过的手套、鞋套等直接放入黄色垃圾袋内交医院集中处理。

4. 废弃标本及其容器装入黄色垃圾袋内、封闭，交本科室废弃物处理室预处理，然后交医院污物

处理中心处理。

5. 日常生活垃圾如纸屑等按一般垃圾交医院处理。

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PCR实验室化学试剂配制程序 发布部门:XXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XXXX 审核者:XXX 批准者:XXX 文件编号:PCR(N)-SOP-005 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日

目的：保证实验中用到的各种溶液符合实验要求。

适用范围：核酸扩增荧光检测实验室常用溶液：4%NaOH溶液、75%酒精、2000mg/L有效氯溶液等。 程序： 1

用具：干燥洁净的250ml量桶一只，三角烧瓶，天平一架，100ml试剂瓶。配制步骤： 2.1 配制4%NaOH溶液:

a) 用天平称取4克分析纯的NaOH固体，置于一只三角烧瓶中。

b) 用250ml量桶准确取100ml水，缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中。 c) 摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解。 d) 然后缓缓倾倒入100ml试剂瓶中密封保存备用。

2.2 配制2000mg/L有效氯溶液消毒剂: 本室采用片剂配制有效氯溶液，根据实际配制液体体积

加入适当数量片剂。

2.3 75%酒精溶液: 由医院库房直接领取。

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PCR实验室应急处理程序 发布部门:XXXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XXXX

1.目的：在实际工作中，仪器设备发生故障、试剂盒发生质量问题时，为保证检验结果的准确性、

及时，应正确采取应急措施，最大程度上避免或减轻不利影响。

2．适用范围：适用于满足核酸扩增荧光检测实验室检测需要并可能对检验结果造成误差的仪器设备

和试剂盒。 3．负责人： XXXX 4．细则：

4．1 核酸扩增荧光检测实验室工作人员在职责范围内均有责任熟悉各种仪器和相关设备的性能、要

求、维护和保养、常见故障的排除、尤其要严格按照操作规程操作。

4．2 工作人员在职责范围内均有责任有意识地注意以求及时发现并报告仪器设备和试剂盒的异常情

况。

4．3 作为应急处理，潜在着一定的可能影响检测质量的不确定因素。室负责人负责在第一时间检

查核实应急措施的有效性。 4．4 仪器设备故障

4．4．1 室负责人接到异常情况报警后，立即现场确认异常情况的性质：观察有无误操作、偶发

现象或确属不能立即排除的故障。

4．4．2 用红牌故障标志标示故障仪器，以防被错误使用。

4．4．3有满足要求的替用设备的，启用替用设备（准用仪器）。借用其他部门仪器设备时，及时

联系借用并核实该设备的使用状态。替用、借用或备用设备的使用在满足质量要求的同时，必须同时满足实验室管理措施（特别是防污染）的要求。

4．4．4不能解决的问题，应及时与供应方会同解决。根据双方合同约定，及时通知供应方。供应

方技术支持人员将在规定的时间内随身携带备用设备到达现场。

4．4．5仪器维修后，必须经验收合格并供需双方签字，调试实验通过后才能重新启用。取下红色

故障标示（暂停使用），换上绿色正常标示（正常使用）。 4．4．6 室主任须检查并随时跟踪所采取措施的有效性。

审核者:XXX 批准者:XXX 文件编号:PCR(N)-SOP-006 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日 第 7 页/共 93 页

4．4．7对未能及时排除故障时，必须及时上报科室，在科主任批准下，应积极联系附近的其他已

得到上海市临检中心认证的临床基因扩增检验实验室检验，以满足患者和临床需求。 4．5 试剂盒质量发生问题，经核实后，及时通知供货商迅速更换另一批次试剂，使用前需先作质

量检测，合格后方可使用。

4．6 仪器设备故障或试剂质量问题不能得到解决，预期将会影响到检测报告的及时发出，可将标

本送至其它已得到上海市临检中心认证的临床基因扩增检验实验室检查；如已影响到报告的及时发出，应在门诊取报告处向病人公告或向相关病区公告，取得病人的谅解。 4．7 影响到检测报告发出的情况，应在应急处理记录表作记录。 5 相关表格

应急处理记录表，编号PCR(N)-SOP-006-01。

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PCR实验室试剂质检标准操作程序 发布部门:XXXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XXX

1．目的：保证每批用于临床实验的试剂的质量良好，符合要求。 2．适用范围：各种用于临床实验的核酸扩增荧光检测试剂。 3．负责人：XXXX 4．程序：

4．1 收到试剂后，目测试剂是否处在冻存状态。

4．2 核对试剂品种和数量并检查包装：外包装（厂名厂址、批准文号、批号和有效期等）；内包装

（试剂瓶完整性、试剂配备品种完整性、使用说明书有否等）。

4．3 及时将试剂转入－20℃冰箱保存。将上述检测核对情况在记录表上登记。

4．4 最迟在前批次试剂存量尚可维持常规实验一周时，按如下要求对新批号试剂进行效验实验。 4．5 效验实验：

4．5．1 要求设置：空白对照、阴性对照、阳性对照、室内质控各一，阳性标准品梯度（104、105、106、107）。

4．5．2 出现如下情况中任何一种的，判断为试剂不合格，不能用于临床检测：

a）空白对照出现扩增。如扩增曲线CT值大于25，需重复实验确证试剂污染。

b）阳性对照和阳性标准品均未检出，或阳性对照未检出而阳性标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。

4．5．3 阳性对照未检出，阳性标准品检测正常，提示样品提取液可能存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。更换提取液后该批试剂方可使用。

4．5．4 空白对照无扩增，阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。单独用提取液点样上机，出现扩增，需更换提取液后方可使用该批试剂。

4．5．5 阳性对照检出，阳性标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT值偏大5个循环以上。提示阳性标准品存在问题。更换阳性标准品后该批试剂方可投入使用。

4．5．6空白对照、阴性对照无扩增，阳性对照正常检出，阳性标准品导出的标准曲线之斜率（－2.9～－3.9）、截距（26～34）、相关性（﹤－0.99）均在使用范围内，表明该批试剂良好，可以投入

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审核者:XXX 批准者:XXX 文件编号:PCR(N)-SOP-007 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日

临床使用。

4．6 将实验结果归入记录。 6 相关表格

试剂入库使用记录表，编号PCR(N)-SOP-007-01。 试剂质检记录表，编号PCR(N)-SOP-007-02。

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乙型肝炎病毒核酸定量检测标准操作程序 发布部门:XXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XXX 审核者:XXX 批准者:XXX 文件编号:PCR(N)-SOP-101 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日 7 项目名称

乙型肝炎病毒核酸定量检测

8 检验方法名称

TaqMan荧光定量检测

9 方法学原理

PCR扩增时加入一对乙型肝炎病毒DNA特异性引物，同时加入一个特异性的、能与PCR产物杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。

10 标本要求

10.1 血清：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无抗凝剂普通试管，待凝固后1500r/min离心5分钟，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管；

10.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的试管，轻轻颠倒混匀5~10次，使抗凝剂与静脉充分混匀，5~10分钟后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管；

10.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。

11 试剂

11.1 试剂名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 11.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司； 11.3 试剂货号：#DA-B051； 11.4 包装规格：20人份/盒； 11.5 试剂成份: 组成部分 DNA浓缩液（2000μl/管） DNA提取液（500μl/管） HBV PCR反应液（400μl/管） Taq酶（60μl/管） HBV临界阳性质控品（200μl/管） 数量 1管 2管 2管 1管 1管 主要组成成份 PEG6000、NaCl NaOH、Tris-HCl、（PH8.0）、TritonX-100、NP-40、Chelex-100、EDTA（PH8.0） PCR反应缓冲液、上下游引物、荧光探针 Taq酶原液、dNTPs 灭活的HBV阳性血清（1×104IU/ml） 第 11 页/共 93 页

组成部分 HBV强阳性质控品（200μl/管） 阴性质控品（250μl/管） 数量 1管 1管 主要组成成份 灭活的HBV阳性血清（1×107IU/ml） HBV阴性血清 含有HBV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×104IU/ml） 含有HBV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×105IU/ml） 含有HBV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×106IU/ml） 含有HBV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×107IU/ml） HBV阳性定量参考品（1.0×104IU/ml）10μl/管 1管 紫色 HBV阳性定量参考品（1.0×105IU/ml）10μl/管 1管 黄色 HBV阳性定量参考品（1.0×106IU/ml）10μl/管 1管 蓝色 HBV阳性定量参考品（1.0×107IU/ml）10μl/管 1管 绿色 11.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。

12 仪器

ABI 7500全自动基因扩增检测仪

13 操作步骤

13.1 DNA提取

13.1.1 标本处理（血清和血浆标本处理相同，在样本处理区操作） 13.1.1.1 取100μl血清加入等量DNA，振荡器振荡混匀5秒； 13.1.1.2 12000r/min离心10min；

13.1.1.3 去上清，沉淀中加入30μl DNA提取液，振荡器剧烈振荡混匀5~10秒，瞬时离心数秒，100℃恒温处理10±1分钟；

13.1.1.4 12000r/min离心5min，备用。 13.1.2 阴性质控品处理

取出阴性质控品，8000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12000r/min离心5min，备用。

13.1.3 HBV临界阳性质控品处理（同阴性质控品）； 13.1.4 HBV强阳性质控品处理（同阴性质控品）；

13.1.5 HBV阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用； 13.2 PCR扩增

13.2.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（HBV PCR反应液40μl/人份+ Taq酶3μl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中备用。

13.2.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2μl，或直接加入阳性定量参考品2μl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。

13.2.3 设置PCR循环扩增程序如下

93℃ 2分钟 预变性；

93℃ 45秒 → 55℃ 60秒 10个循环 93℃ 30秒 → 55℃ 45秒 30个循环

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14 结果判断：

14.1.1 在Results/Amplification 页面查看反应曲线，分析结果时，基线（baseline）取为12-18个循环的荧光信号，此时的阈值（threshold）约为400。

14.1.2 4管阳性标准管、临界阳性对照管的荧光强度对应反应循环数曲线（ΔRn vs. Cycle）应呈较典型的S型曲线，阴性对照管则无此特征，否则实验视为无效。

14.1.3 根据预先输入的5个阳性参考品浓度，仪器自动以阳性参考品基因拷贝浓度的对数值为横坐标，以其实际测得的Ct值为纵坐标，作标准曲线，相关系数应大于等于0.990，否则应视为实验无效。

14.1.4 定量结果分析：质控、标准曲线均满足要求时，可对样品进行定量分析。分析数据时，根据标准曲线自动计算未知标本的相应基因拷贝浓度。

14.1.5 如果增长曲线不呈S型或Ct值=30，则判样品的HBV DNA总含量小于检测极限。 14.1.6 如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<30，则按以下方法判断： a ) 若定量数值在线性范围内：1.00E+002≤C≤1.00E+008，则样品HBV DNA总含量为C IU/ml； b ) 如果定量数值在线性范围外，有两种情况：

i. C>1.00E+008，则样品HBV DNA总含量>1.0×108 IU/ml。如果需要精确定量结果，

可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测； ii. C<1.00E+002，则样品的HBV DNA总量为C IU/ml，定量数值供参考。

15 质控

a ) 阴性质控品：增长曲线不呈S型曲线或Ct值=30； b ) 阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考值在1.0×106IU/ml~2.0×

107IU/ml范围，临界阳性质控品定量参考值在2.0×102IU/ml~2.0×104IU/ml范围；（参考值为仪器自动分析计算出的数值）； c ) 阳性定量参考品：全部阳性，且线性相关系数0.97≤|r|≤1； d ) 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

16 参考范围

低于检测下限

17 性能指标

检测限：1.0×102IU/ml

线性范围：1.0×102IU/ml~1.0×108IU/ml

18 临床意义

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18.1 观察抗病毒药物疗效，指导用药

血循环中HBV DNA水平与HBV感染者病情和预后的关系密切，尤其是急性和慢性乙型肝炎患者。研究发现HBV DNA一直保持较高水平的急性肝炎患者易慢性化，而HBV复制水平较高的慢性肝炎患者不仅对干扰素治疗的反应性差，而且肝组织炎症反应更明显，病情更重，更易发生肝硬化和肝癌。根据《2000 年拉米夫定临床应用指导意见》，中国慢性乙型肝炎病人治疗的目的主要就是降低血清HBV DNA，诱导HBeAg血清转换，使ALT正常化，改善肝脏组织学病变，改善疾病症状、体征，提高生活质量，降低肝硬化和肝癌的发生率。同时血清的HBV DNA滴度的动态变化还可在临床上对用药的剂量、用药时间以及是否需要联合用药等提供参考。

18.2 器官移植中的作用

肝脏器官移植是目前肝硬化晚期治疗的唯一方法，但有约86%以上既往HBsAg携带者术后HBsAg重新出现。检测HBV DNA 可用于观察免疫受损患者的HBV感染状况。肝移植后乙肝主要是复发，再感染为次要因素。特别是移植前HBV复制水平高者，复发的几率更高。定量检测HBV DNA对肝移植术后的跟踪观测具有较好的临床价值。

18.3 对阻断母婴传播的监测

联合应用高放价免疫球蛋白和乙肝疫苗时有效地阻断母婴传播，但仍有一些婴儿对疫苗呈低反应，检测婴儿血循环中HBV DNA可对此进行监测，分析阻断失败的原因。

19 注意事项

19.1 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；

19.2 为试剂和标本制备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；

19.3 对每次实验进行质量控制；

19.4 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融；

19.5 试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截；

19.6 提取的DNA可于—20℃保存6个月； 19.7 “C”表示样品的浓度或含量；

19.8 标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃； 19.9 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

19.10 所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。

20 参考文献

中华人民共和国卫生部医政司编．全国临床检验操作规程(第三版) ．南京：东南大学出版社，2006

乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR—荧光探针法）说明书.2009年7月，第一版/0 批准记录 批准人 批准时间 有效期 □1年；□其他： □1年；□其他： 第 14 页/共 93 页

□1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： 第 15 页/共 93 页

丙型肝炎病毒核酸检测标准操作程序 发布部门:XXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XXX 审核者:XXX 批准者:XXX 文件编号:PCR(N)-SOP-102 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日 1 项目名称

丙型肝炎病毒核酸检测

2 检验方法名称

TaqMan荧光定性检测

3 方法学原理

对丙肝病毒进行逆转录反应生成cDNA，PCR扩增时加入一对丙型肝炎病毒cDNA特异性引物，同时加入一个特异性的、能与PCR产物杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。

4 标本要求

4.1 血清：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无抗凝剂普通试管，待凝固后1500r/min离心5分钟，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管；

4.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的试管，轻轻颠倒混匀5~10次，使抗凝剂与静脉充分混匀，5~10分钟后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管；

4.3 标本保存：分离后的血清或血浆在2~8℃条件下保持不应超过72小时；-20℃可保存1个月；要长期保存的，需分装后储存于-70℃。

5 试剂

5.1 试剂名称：丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 5.2 生产厂家：XXXXXXX 5.3 试剂货号：#DA-B070； 5.4 包装规格：10人份/盒； 5.5 试剂成份: 组成部分 RNA提取液A（100μl/管） RNA提取液B（4000μl/管） HCV PCR反应液Ⅰ（180μl/管） 数量 1管 1管 1管 主要组成成份 二氧化硅、DEPC水（pH2.0） GuSCN、Tris-HCl（pH6.4）、EDTA（pH8.0）、Triton-100 引物、dNTPs、5×逆转录缓冲液 第 16 页/共 93 页

组成部分 逆转录酶系（20μl/管） HCV PCR反应液（400μl/管） Taq酶（30μl/管） DEPC H2O（200μl/管） 阴性质控品（250μl/管） HCV临界阳性质控品（200μl/管） HCV强阳性质控品（200μl/管） 数量 1管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 主要组成成份 mMLV逆转录酶、RNasin 上下游引物、荧光探针、dNTPs、5×PCR反应缓冲液、双蒸水 Taq酶原液、Tris-HCl（pH8.0）、KCl、EDTA（pH8.0）、DTT、丙三醇 DEPC H2O HCV阴性血清 HCV强阳性血浆（2×107IU/ml）稀释1600倍制成 HCV强阳性血浆（2×107IU/ml）稀释16倍制成 含有HCV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×105IU/ml） 含有HCV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×106IU/ml） 含有HCV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×107IU/ml） 含有HCV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×108IU/ml） HCV阳性定量参考品（1.0×105IU/ml）10μl/管 1管 红色 HCV阳性定量参考品（1.0×106IU/ml）10μl/管 1管 黄色 HCV阳性定量参考品（1.0×107IU/ml）10μl/管 1管 蓝色 HCV阳性定量参考品（1.0×108IU/ml）10μl/管 1管 绿色 5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。

6 仪器

ABI 7500全自动基因扩增检测仪

7 操作步骤

7.1 RNA提取

7.1.1 阴性质控品处理

7.1.1.1 取出阴性质控品，8000rpm离心数秒；

7.1.1.2 取灭菌的0.5ml离心管加入10μlRNA提取液A（充分混匀后吸取），加入100μl阴性质控品，再加入200μlRNA提取液B，振荡混匀，室温放置5分钟，8000rpm离心1分钟，小心吸去上清；

7.1.1.3 加200μlRNA提取液B，充分混匀（用移液器吹打），000rpm离心1分钟，小心吸去上清；

7.1.1.4 加预冷的75%乙醇400μl，充分混匀，8000rpm离心1分钟，小心吸去上清； 7.1.1.5 加预冷的75%乙醇400μl，充分混匀，8000rpm离心1分钟，小心吸去上清； 7.1.1.6 打开管盖，65℃干燥10分钟，盖上管盖待用于逆转录。 7.1.2 标本处理（血清和血浆标本处理相同）

7.1.2.1 取灭菌的1.5ml离心管加入10μl RNA提取液A（充分混匀后吸取），加100μl血清，再加入200μl RNA提取液B，振荡混匀，室温放置5分钟，8000rpm离心1分钟，小心吸去上清；

7.1.2.2 一下步骤同“阴性质控品处理”的7.1.1.3~7.1.1.6. 7.1.3 HCV临界阳性质控品处理（同阴性质控品）； 7.1.4 HCV强阳性质控品处理（同阴性质控品）；

7.1.5 HCV阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用； 7.2 逆转录

第 17 页/共 93 页

7.2.1 向干燥后的沉淀管加入18μl PCR反应液Ⅰ打匀，再加逆转录酶系2μl，振荡混匀； 7.2.2 37℃放置45分钟，95℃加热3分钟。8000rpm离心1分钟，待用。 7.3 PCR扩增

7.3.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（HCV PCR反应液40μl/人份+ Taq酶3μl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中备用。

7.3.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入逆转录后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液5μl，或直接加入阳性定量参考品5μl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。

7.3.3 设置PCR循环扩增程序如下

93℃ 2分钟 预变性；

93℃ 45秒 → 55℃ 60秒 10个循环 93℃ 30秒 → 55℃ 45秒 30个循环

8 结果判断：

8.1 如果增长曲线不呈S型或Ct值=30，则判样品的HCV RNA总含量小于检测极限。 8.2 如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<30，则按以下方法判断： a ) 若样品的C<1.00E+003，则样品HCV RNA总含量<1.0×103 IU/ml。 b ) 若样品的1.00E+003≤C≤1.00E+008，则样品HCV RNA总含量为C IU/ml； c ) 若样品的C>1.00E+008，则样品HCV RNA总含量>1.0×108 IU/ml。如果需要精确定量结果，

可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测；

9 质控

a ) 阴性质控品：增长曲线不呈S型曲线或Ct值=30； b ) 阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考值在5.0×106IU/ml~5.0×

108IU/ml范围，临界阳性质控品定量参考值在2.0×103IU/ml~5.0×105IU/ml范围；（参考值为仪器自动分析计算出的数值）； c ) 阳性定量参考品：增长曲线呈S型曲线，Ct值<27，且线性相关系数0.97≤|r|≤1； d ) 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

10 参考范围

低于检测下限

11 性能指标

检测限：1.0×103IU/ml

第 18 页/共 93 页

线性范围：1.0×103IU/ml~1.0×108IU/ml

12 临床意义

HCV是引起输血后肝炎的主要因素，其在血中的含量极低，仅为HBV的1%，其免疫学标志只有抗-HCV 和核心抗原两项，且至今病毒分离尚未成功，所以HCV的检测存在一些问题，因此，RT-PCR技术在HCV的检测中非常重要。由于个体间免疫功能的差异，部分患者出现抗-HCV较晚，免疫功能低下者和经免疫抑制治疗者甚至可能不产生抗-HCV，因此HCV-RNA是HCV感染的确诊标志。即使在“窗口期”，也可检测出HCV RNA。

13 注意事项

13.1 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；

13.2 为试剂和标本制备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；

13.3 对每次实验进行质量控制；

13.4 由于涉及RNA操作，应严防RNase的污染； 13.5 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融；

13.6 反应管中加入RNA模板后，应尽快完成荧光测定，开始PCR反应；

13.7 标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃； 13.8 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

13.9 所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。

14 参考文献

中华人民共和国卫生部医政司编．全国临床检验操作规程(第三版) ．南京：东南大学出版社，2006

中山大学达安基因股份有限公司.丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR—荧光探针法）说明书.2009年7月，第一版/0

批准记录 批准人 批准时间 有效期 □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： 第 19 页/共 93 页

人巨细胞病毒核酸定量检测标准操作程序 发布部门:XXXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XXX 审核者:XXX 批准者:XXX 文件编号:PCR(N)-SOP-103 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日 1 项目名称

人巨细胞病毒核酸定量检测

2 检验方法名称

TaqMan荧光定量检测

3 方法学原理

选用人巨细胞病毒株（即人疱疹病毒5型）-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因的一高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计一对针对该区域的特异性引物，同时加入一个特异性的、能与PCR产物杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。

4 标本要求

4.1 适用标本类型：尿液、乳汁、血清或全血等。

4.2 尿液、乳汁：取晨尿或成熟乳10ml于无菌的干燥玻璃管中，密闭送检；

4.3 血清：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无抗凝剂普通试管，待凝固后1500r/min离心5分钟，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管；

4.4 全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的试管，轻轻颠倒混匀5~10次，使抗凝剂与静脉充分混匀。全血标本可立即用于测试，也可保存于4℃待测，保存期为24小时。

4.5 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测（全血除外），保存期为6个月。

5 试剂

5.1 试剂名称：人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 5.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司； 5.3 试剂货号：#DA-B061； 5.4 包装规格：20人份/盒； 5.5 试剂成份： 组成部分 DNA提取液（500μl/管） HCMV PCR反应液（400μl/管） Taq酶（60μl/管） 第 20 页/共 93 页

数量 2管 2管 1管

组成部分 DNA浓缩液（2000μl/管） HCMV阴性质控品（50μl/管） HCMV弱阳性质控品（200μl/管） HCMV弱阳性质控品（200μl/管） HCMV阴性质控品（250μl/管） HCMV阳性定量参考品（1.0×104IU/ml）10μl/管 红色 HCMV阳性定量参考品（1.0×105IU/ml）10μl/管 黄色 HCMV阳性定量参考品（1.0×106IU/ml）10μl/管 蓝色 HCMV阳性定量参考品（1.0×107IU/ml）10μl/管 绿色 5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。

数量 1管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 6 仪器

ABI 7500全自动基因扩增检测仪

7 操作步骤

7.1 DNA提取

7.1.1 阴性质控品处理

取出阴性质控品，8000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12000r/min离心5min，备用。

7.1.2 标本处理

7.1.2.1 乳汁（尿液处理同乳汁） a ) 摇匀乳汁，取1ml至1.5ml离心管中，12000rpm离心5min； b ) 去上清，沉淀（沉淀如不明显，重复上述步骤）加灭菌生理盐水1ml混匀，12000rpm离心

5min； c ) 12000r/min离心5min，备用。 7.1.2.2 血清 a ) 取100μl血清加入等量DNA浓缩液，充分混匀； b ) 12000r/min离心10min； c ) 去上清，沉淀中加入20μl DNA提取液，充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟； d ) 12000r/min离心5min，备用。 7.1.2.3 全血 a ) 取全血1ml至干燥玻璃试管中，加入生理盐水1ml轻摇混匀； b ) 取干燥玻璃试管卷入500μl淋巴细胞分离液； c ) 将稀释好的全血用加样枪缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中（注意沿管壁，速度要慢）； d ) 2000rpm离心20min； e ) 吸取白细胞层（从上而下的第二层），加入1.5ml离心管，12000rpm离心5分钟； 以下处理同7.1.2.1.b~7.1.2.1.c

7.1.3 HCMV弱阳性质控品处理（同阴性质控品）； 7.1.4 HCMV强阳性质控品处理（同阴性质控品）；

7.1.5 HBV阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用； 7.2 PCR扩增

7.2.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（TB PCR反应液40μl/人份+ Taq酶3μl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中备用。

7.2.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、

第 21 页/共 93 页

临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2μl，或直接加入阳性定量参考品2μl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。

7.2.3 设置PCR循环扩增程序如下

93℃ 2分钟 预变性；

93℃ 45秒 → 55℃ 60秒 10个循环 93℃ 30秒 → 55℃ 45秒 30个循环

8 结果判断：

8.1.1 如果增长曲线不呈S型或Ct值=30，则判样品的HCMV DNA总含量小于检测极限。 8.1.2 如果增长曲线呈S型曲线，且Ct值<30，则按以下方法判断： a ) 若样品的C<5.00E+002，全血、乳汁、尿液样品HCMV DNA总含量<5.0×102基因拷贝/ml，

血清样品HCMV DNA总含量<2.0×103基因拷贝/ml b ) 若样品的5.00E+002≤C≤5.00E+008，全血、乳汁、尿液样品HCMV DNA总含量=C基因

拷贝/ml，血清样品HCMV DNA总含量=4.0×C基因拷贝/ml； c ) 若样品的C>5.00E+008，全血、乳汁、尿液样品HCMV DNA总含量>5.0×108 基因拷贝/ml，

血清样品HCMV DNA总含量>2.0×109 基因拷贝/ml。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测； d )

9 质控

a ) 阴性质控品：增长曲线不呈S型曲线或Ct值=30； b ) 阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考值在1.0×106基因拷贝/ml~2.0

×107基因拷贝/ml范围，临界阳性质控品定量参考值在2.0×102基因拷贝/ml~2.0×104基因拷贝/ml范围；（参考值为仪器自动分析计算出的数值）； c ) 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

10 参考范围

低于检测下限

11 性能指标

灵敏度：5.0×102基因拷贝/ml

线性范围：5.0×102基因拷贝/ml~5.0×108基因拷贝/ml

12 临床意义

第 22 页/共 93 页

人群中感染CMV非常广泛，通常呈隐性感染，少数有临床症状。CMV感染可发生在产前、长时、产后。先天感染妊娠时，母体发生CMV感染时，病毒可经过胎盘传至胎儿，引起宫内感染。在查到的引起先天感染的病因当中，CMV 最常见。有症状的新生儿可在出生后的第一个月之内死于并发症。而幸存儿常有神经系统的损伤，有可能在数月或至数年后出现听力缺陷或智力低下。产时感染新生儿出生时，在经过产道时与病毒接触，也可能被感染。但通常不出现症状或后遗症。产后感染由于CMV可再在于血液、精液、宫颈阴道分泌物、尿液、乳汁、唾液、泪液等体液中，病毒可通过口腔、生殖道、输血或骨髓移植等多种途径传播。经输血而感染早产儿死亡率较高。

13 注意事项

13.1 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；

13.2 为试剂和标本制备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；

13.3 对每次实验进行质量控制；

13.4 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融； 13.5 自备灭菌生理盐水；

13.6 标本处理时“去上清”步骤，注意吸头不要碰触沉淀；

13.7 试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截；

13.8 提取的DNA可于—20℃保存6个月；

13.9 标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃； 13.10 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

13.11 所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。

14 参考文献

中华人民共和国卫生部医政司编．全国临床检验操作规程(第三版) ．南京：东南大学出版社，2006

中山大学达安基因股份有限公司．人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒（PCR—荧光探针法）说明书.2011年4月，第三版/0 批准记录 批准人 批准时间 有效期 □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： 第 23 页/共 93 页

结核分枝杆菌核酸检测标准操作程序 发布部门:XXXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: 李佳 审核者:黄盛 批准者:李莉 文件编号:PCR(N)-SOP-104 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日 1 项目名称

结核分枝杆菌核酸定性检测

2 检验方法名称

TaqMan荧光定性检测

3 方法学原理

选用一对结核分枝杆菌特异性引物，同时加入一个特异性的、能与PCR产物杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。

4 标本要求

4.1 适用标本类型：痰液、肺及支气管灌洗液、尿液。

4.2 痰液：清晨从肺深部咳出的痰液，用无菌5ml玻璃管收集1~3ml，密闭送检； 4.3 肺及支气管灌洗液：用无菌5ml玻璃管收集灌洗液1~3ml，密闭送检； 4.4 尿液：用无菌5ml玻璃管收集中段尿1~3ml，密闭送检。

4.5 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。

5 试剂

5.1 试剂名称：结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 5.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司； 5.3 试剂货号：#DA-B052； 5.4 包装规格：20人份/盒； 5.5 试剂成份： 组成部分 DNA提取液（500μl/管） TB PCR反应液（400μl/管） Taq酶（60μl/管） TB阴性质控品（250μl/管） TB强阳性质控品（200μl/管） TB临界阳性质控品（200μl/管） TB阳性定量参考品（1.0×104IU/ml）10μl/管 红色 第 24 页/共 93 页

数量 2管 2管 1管 1管 1管 1管 1管

组成部分 TB阳性定量参考品（1.0×105IU/ml）10μl/管 黄色 TB阳性定量参考品（1.0×106IU/ml）10μl/管 蓝色 TB阳性定量参考品（1.0×107IU/ml）10μl/管 绿色 5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。

数量 1管 1管 1管 6 仪器

ABI 7500全自动基因扩增检测仪

7 操作步骤

7.1 DNA提取

7.1.1 阴性质控品处理

取出阴性质控品，8000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12000r/min离心5min，备用。

7.1.2 标本处理 7.1.2.1 痰液 a ) 向玻璃管中加入4倍体积4%NaOH，摇匀，室温下放置15~30分钟左右液化； b ) 取1ml液化后标本至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟； c ) 弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml混匀。12000rpm离心5分钟； d ) 弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml混匀。12000rpm离心5分钟； e ) 弃上清。沉淀中加50μlDNA提取液充分混匀。100℃干式恒温浴10±1分钟； f ) 12000r/min离心5min，备用。 7.1.2.2 肺及支气管灌洗液 a ) 取灌洗液1ml至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟； b ) 弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml混匀。12000rpm离心5分钟； c ) 弃上清。沉淀中加50μlDNA提取液充分混匀。100℃干式恒温浴10±1分钟； d ) 12000r/min离心5min，备用。 7.1.2.3 尿液 a ) 摇匀尿液，取1ml至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟； b ) 弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml混匀。12000rpm离心5分钟； c ) 弃上清。沉淀中加50μlDNA提取液充分混匀。100℃干式恒温浴10±1分钟； d ) 12000r/min离心5min，备用。

7.1.3 TB临界阳性质控品处理（同阴性质控品）； 7.1.4 TB强阳性质控品处理（同阴性质控品）；

7.1.5 TB阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用； 7.2 PCR扩增

7.2.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（TB PCR反应液40μl/人份+ Taq酶3μl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中备用。

7.2.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2μl，或直接加入阳性定量参考品2μl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。

7.2.3 设置PCR循环扩增程序如下

93℃ 2分钟 预变性；

93℃ 45秒 → 55℃ 60秒 10个循环 93℃ 30秒 → 55℃ 45秒 30个循环

第 25 页/共 93 页

8 结果判断：

8.1.1 如果增长曲线不呈S型或Ct值=30，则判样品的HBV DNA总含量小于检测极限。 8.1.2 如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<30，则按以下方法判断： a ) 若样品的C<5.00E+002，灌洗液、尿液样品的TB DNA总含量<5.0×102基因拷贝/ml，痰液

的TB DNA总含量<2.5×103基因拷贝/ml b ) 若样品的5.00E+002≤C≤5.00E+008，则灌洗液、尿液样品的TB DNA总含量=C基因拷贝

/ml，痰液的TB DNA总含量=5.0×C基因拷贝/ml； c ) 若样品的C>5.00E+008，则灌洗液、尿液样品的TB DNA总含量>5.0×108 基因拷贝/ml，

痰液的TB DNA总含量>2.5×109 基因拷贝/ml。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测；

9 质控

d ) 阴性质控品：增长曲线不呈S型曲线或Ct值=30； e ) 阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考值在1.0×105基因拷贝/ml~2.0

×106基因拷贝/ml范围，弱阳性质控品定量参考值在1.0×103基因拷贝/ml~2.0×104基因拷贝/ml范围；（参考值为仪器自动分析计算出的数值）；

f ) 阳性定量参考品：全部阳性，Ct值<27，且线性相关系数0.97≤|r|≤1； g ) 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

10 参考范围

低于检测下限

11 性能指标

灵敏度：5.0×102基因拷贝/ml

线性范围：5.0×102基因拷贝/ml~5.0×108基因拷贝/ml

12 临床意义

结核杆菌为难培养的微生物，PCR方法对结核杆菌感染的快速检测有重要应用价 12.1 结核杆菌感染的快速诊断

结核杆菌因其培养周期长，临床很难采用培养方法进行结核杆菌感染的快速检测，而采用PCR方法，则可以做到这一点。如通过对痰、血液、淋巴液、脑脊液、胸腹水等标本中结核杆菌的PCR检测，快速诊断肺结核、结核杆菌菌血症、淋巴结核、结核性脑膜炎、结核性胸腹膜炎等。

12.2 抗结核治疗的监测

第 26 页/共 93 页

在抗结核治疗中，采用PCR方法定期检测，可评价抗结核药物的疗效。

13 注意事项

13.1 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；

13.2 为试剂和标本制备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；

13.3 对每次实验进行质量控制；

13.4 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融； 13.5 自备灭菌生理盐水；

13.6 标本处理时“去上清”步骤，注意吸头不要碰触沉淀；

13.7 试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截；

13.8 提取的DNA可于—20℃保存6个月；

13.9 标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃； 13.10 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

13.11 所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。

14 参考文献

中华人民共和国卫生部医政司编．全国临床检验操作规程(第三版) ．南京：东南大学出版社，2006

中山大学达安基因股份有限公司.结核分支杆菌核酸检测试剂盒（PCR—荧光探针法）说明书.2009年7月，第一版/0 批准记录 批准人

批准时间 有效期 □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： 第 27 页/共 93 页

人乳头瘤病毒（6,11型）核酸检测标准操作程序 发布部门:XXXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XXX 审核者:XXX 批准者:XXXX 文件编号:PCR(N)-SOP-105 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日 1 项目名称

人乳头瘤病毒（6,11型）核酸检测

2 检验方法名称

TaqMan荧光定量检测

3 方法学原理

选用人乳头瘤病毒（HPV）6型（GenBank序列号为：AF092932）基因组中编码主要外壳蛋白L1基因编码区为扩增靶区域，设计一对针对该区域的特异性引物，同时加入一个特异性的、能与PCR产物杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。

4 标本要求

4.1 适用标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子、生殖道刮片、组织活检标本等。 4.2 标本采集

4.2.1 泌尿生殖道分泌物棉拭子 a ) 男性—用细小棉拭子伸入尿道约2～4 厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃

管，密闭送检(采集分泌物前2小时禁小便) b ) 女性生殖道—用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用宫颈刷或无菌棉拭子插入宫颈

内，停5 秒钟后旋动宫颈刷或棉拭子采集宫颈分泌物，将宫颈刷或棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。 c ) 女性尿道—用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2 厘米，捻动拭

子采集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。

4.2.2 生殖道刮片：用刮片刮取宫颈病灶处脱落细胞,置入无菌玻璃管，密闭送检。

4.2.1 组织活检标本（包括宫颈组织、外阴组织、尖锐湿疣疣状组织等）：取可疑组织适量置无菌玻璃管，密闭送检。

4.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。

5 试剂

5.1 试剂名称：人乳头瘤病毒（6,11型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 5.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司； 5.3 试剂货号：#DA-B056； 5.4 包装规格：20人份/盒；

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5.5 试剂成份： 组成部分 DNA提取液（500μl/管） HPV6,11 PCR反应液（400μl/管） Taq酶（60μl/管） HPV6,11阴性质控品（500μl/管） HPV6,11强阳性质控品（200μl/管） HPV6,11临界阳性质控品（200μl/管） HPV6,11阳性定量参考品（1.0×104基因拷贝/ml）10μl/管 红色 HPV6,11阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝/ml）10μl/管 黄色 HPV6,11阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝/ml）10μl/管 蓝色 5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。 数量 2管 2管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 T HPV6,11阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝/ml）10μl/管 绿色 1管 6 仪器

ABI 7500全自动基因扩增检测仪

7 操作步骤

7.1 DNA提取

7.1.1 阴性质控品处理

取出阴性质控品，8000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12000r/min离心5min，备用。

7.1.2 标本处理

7.1.2.1 泌尿生殖道分泌物棉拭子 a ) 向玻璃管中加入1 ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子； b ) 吸取全部液体转至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5分钟； c ) 去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12,000rpm离心5分钟； d ) 去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟； e ) 12,000 rpm离心5分钟，备用。 7.1.2.2 生殖道刮片 a ) 向有生殖道刮片的玻璃管中加入1 ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀； b ) 吸取全部液体转至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5分钟； 以下处理同2.1.2.1：步骤a~e。 7.1.2.3 组织活检标本 a ) 用适量灭菌生理盐水清洗送检组织沾带的血液； b ) 取约50毫克组织，加1 ml灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织匀浆，转移至1.5ml离心管中，

12,000rpm 离心5分钟； c ) 去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟； d ) 12,000 rpm离心5分钟，备用。

7.1.3 HPV6,11临界阳性质控品处理（同阴性质控品）； 7.1.4 HPV6,11强阳性质控品处理（同阴性质控品）；

7.1.5 HPV6,11阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用； 7.2 PCR扩增

7.2.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（HPV6,11 PCR反应液40μl/人份+ Taq酶3μl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中备用。

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7.2.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2μl，或直接加入阳性定量参考品2μl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。

7.2.3 设置PCR循环扩增程序如下

93℃ 2分钟 预变性；

93℃ 45秒 → 55℃ 60秒 10个循环 93℃ 30秒 → 55℃ 45秒 30个循环

8 结果判断：

8.1.1 如果增长曲线不呈S型或Ct值=30，则判样品的HBV DNA总含量小于检测极限。 8.1.2 如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<30，则按以下方法判断： a ) 若样品的C<5.00E+002，则样品的HPV6,11总含量<5.0×102基因拷贝/ml； b ) 若样品的5.00E+002≤C≤5.00E+008，则该样品的HPV6,11总含量=C基因拷贝/ml； c ) 若样品的C>5.00E+008，则样品的HPV6,11总含量>5.0×108 基因拷贝/ml，。如果需要精确

定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。

9 质控

a ) 阴性质控品：增长曲线不呈S型曲线或Ct值=30； b ) 阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考值在1.0×106基因拷贝/ml~2.0

×107基因拷贝/ml范围，临界阳性质控品定量参考值在2.0×102基因拷贝/ml~2.0×104基因拷贝/ml范围；（参考值为仪器自动分析计算出的数值）； c ) 阳性定量参考品：增长曲线呈S型，Ct值<27，且线性相关系数0.97≤|r|≤1； d ) 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

10 参考范围

低于检测下限

11 性能指标

灵敏度：5.0×102基因拷贝/ml

线性范围：5.0×102基因拷贝/ml~5.0×108基因拷贝/ml

12 临床意义

HPV是一组病毒的总称，组成一个科，其病毒形态类似，但DNA限制性内切酶图谱各异，核壳体蛋白质的抗原性不同。目前已经确定的HPV型别大约有80余种，依其感染的上皮所在部位分

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为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV，大约35种型别可感染妇女生殖道，约20种与肿瘤相关。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型别和高危险型别HPV，低危险型别HPV包括HPV6、11、42、43、44等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变（CIN I），高危险型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变（CIN II/III）的发生相关，尤其是HPV16和18型。

13 注意事项

13.1 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；

13.2 为试剂和标本制备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；

13.3 对每次实验进行质量控制；

13.4 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融； 13.5 自备灭菌生理盐水；

13.6 标本处理时“去上清”步骤，注意吸头不要碰触沉淀；

13.7 试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截；

13.8 提取的DNA可于—20℃保存6个月；

13.9 标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃； 13.10 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

13.11 所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。

14 参考文献

中华人民共和国卫生部医政司编．全国临床检验操作规程(第三版) ．南京：东南大学出版社，2006

中山大学达安基因股份有限公司.结核分支杆菌核酸检测试剂盒（PCR—荧光探针法）说明书.2009年7月，第一版/0 批准记录 批准人

批准时间 有效期 □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： 第 31 页/共 93 页

解脲脲原体核酸定量检测标准操作程序 发布部门:XXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XX 审核者:XX 批准者:XXX 文件编号:PCR(N)-SOP-106 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日 1 项目名称

解脲脲原体核酸定量检测

2 检验方法名称

TaqMan荧光定量检测

3 方法学原理

用一对解脲脲原体特异性引物和一条解脲脲原体特异性荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。

4 标本要求

4.1 适用标本类型：生殖泌尿道分泌物等。 4.2 标本采集（泌尿生殖道分泌物） a ) 男性—用细小棉拭子伸入尿道约2～4 厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃

管，密闭送检(采集分泌物前2小时禁小便) b ) 女性生殖道—用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用宫颈刷或无菌棉拭子插入宫颈

内，停5 秒钟后旋动宫颈刷或棉拭子采集宫颈分泌物，将宫颈刷或棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。 c ) 女性尿道—用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2 厘米，捻动拭

子采集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。

4.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。

5 试剂

5.1 试剂名称：解脲脲原体核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 5.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司； 5.3 试剂货号：#DA-B055； 5.4 包装规格：20人份/盒； 5.5 试剂成份： 组成部分 DNA提取液（500μl/管） UU PCR反应液（400μl/管） 第 32 页/共 93 页

数量 2管 2管

组成部分 Taq酶（60μl/管） UU阴性质控品（50μl/管） UU强阳性质控品（50μl/管） UU弱阳性质控品（50μl/管） UU阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝/ml）10μl/管 红色 UU阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝/ml）10μl/管 黄色 UU阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝/ml）10μl/管 蓝色 UU阳性定量参考品（1.0×108基因拷贝/ml）10μl/管 绿色 5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。

数量 1管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 6 仪器

ABI 7500全自动基因扩增检测仪

7 操作步骤

7.1 DNA提取

7.1.1 阴性质控品处理 a ) 向阴性质控品管中加入等量DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟； b ) 12000r/min离心5min，备用。 7.1.2 标本处理(生殖泌尿道分泌物) a ) 向玻璃管中加入1 ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子； b ) 吸取全部液体转至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5分钟； c ) 去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12,000rpm离心5分钟； d ) 去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟； e ) 12,000 rpm离心5分钟，备用。

7.1.3 UU弱阳性质控品处理（同阴性质控品）； 7.1.4 UU强阳性质控品处理（同阴性质控品）；

7.1.5 UU阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用； 7.2 PCR扩增

7.2.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（UU PCR反应液40μl/人份+ Taq酶3μl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中备用。

7.2.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2μl，或直接加入阳性定量参考品2μl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。

7.2.3 设置PCR循环扩增程序如下

93℃ 2分钟 预变性；

93℃ 45秒 → 55℃ 60秒 10个循环 93℃ 30秒 → 55℃ 45秒 30个循环

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