酶工程 1~10章题目及答案

第一章 绪论

试题精选

一、名词解释

1、酶 2、酶工程 3、核酸类酶 4、蛋白类酶 5、酶的生产 6、酶的改性 7、酶的应用 8、酶的专一性 9、酶的转换数 二、填空题

1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_蛋白类酶_和 核酸类酶_两大类。

2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是_核糖核酸，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是_蛋白质_。 3、进行分子内催化作用的核酸类酶可以分为_自我剪切酶_，_自我剪接酶_。 4、酶活力是_酶量_的量度指标，酶的比活力是_酶纯度_的量度指标，酶的转换数的主要组分是_酶催化效率_的度量指标。 5、非竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm_减小_，米氏常数Km__不变_。 三、选择题

1、酶工程是（C）的技术过程。

A、利用酶的催化作用将底物转化为产物 B、通过发酵生产和分离纯化获得所需酶 C、酶的生产与应用 D、酶在工业上大规模应用

2、核酸类酶是（D）。

A、催化RNA进行水解反应的一类酶 B、催化RNA进行剪接反应的一类酶 C、由RNA组成的一类酶 D、分子中起催化作用的主要组分为RNA的一类酶 3、RNA剪切酶是（B）。

A、催化其他RNA分子进行反应的酶 B、催化其他RNA分子进行剪切反应的R酶

C、催化本身RNA分子进行剪切反应的R酶 D、催化本身RNA分子进行剪接反应的R酶 4、酶的改性是指通过各种方法（A）的技术过程。

A、改进酶的催化特性 B、改变酶的催化特性 C、提高酶的催化效率 D、提高酶的稳定性 5、酶的转换数是指（C）。

A、酶催化底物转化成产物的数量B、每个酶分子催化底物转化为产物的分子数

C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的分子数D、每摩尔酶催化底物转化为产物的摩尔数 四、判断题

（V）1、相同的酶在不同的pH条件下进行测定时，酶活力不同。

（V）2、竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm不变，米氏常数Km 增大。 （X）3、催化两个化合物缩成一个化合物的酶称为合成酶。

（X ）4、RNA剪切酶是催化RNA分子进行剪切反应的核酸类酶。 （V）5、水解酶在水溶液中不能催化其逆反应。 五、简答题

1、何谓酶工程，其主要内容有哪些？

答：酶的生产与应用的技术过程称为酶工程。

酶的生产是指通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶，动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。

酶的应用是在人工控制条件的反应器中，通过酶的催化作用获得人们所需的物质或者除去不良物质的技术过程。主要包括酶反应器的选择与设计以及酶在各个领域的应用等。

在酶的生产与应用过程中，人们发现酶具有稳定较性差、催化效率不够高、游离酶通常只能使用一次等弱点，为此研究、开发了各种酶的改性技术，以促进酶的优质生产和高效应用。

酶的改性是通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化、酶定向进化等。

酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化、酶定向进化、酶反应器和酶的应用等。 2、试述酶活力测定的基本步骤。

答：酶活力测定通常包括两个阶段。首先在一定条件下，酶与底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物的变化量。一般经过如下几个步骤：

（1）根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。所使用的底物必须均匀一致，达到酶催

1

化反应所要求的纯度。在测定酶活力时，所使用的底物溶液一般要求新鲜配制，有些反应所需的底物溶液也可预先配制后置于冰箱保存备用。 （2）根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。温度可以选择在室温（25℃）、体温(37℃)、酶反应最适温度或其他选用的温度；pH应是酶催化反应的最适pH；底物浓度应大于5Km等。反应条件一旦确定，在整个反应过程中应尽量保持恒定不变。故此，反应应该在恒温槽中进行，pH的保持恒定是采用一定浓度和一定的pH缓冲溶液。有些酶催化反应，要求一定浓度的激活剂等条件，应适量添加。

（3）在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。

（4）反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。 3、简述影响酶催化作用的主要因素。

答：酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。

（1）底物浓度：在底物浓度较低的情况下，酶催化反应速度与底物浓度成正比，反应速度随着底物浓度的增加而加快。当底物浓度达到一定的数值时，反应速度的上升不再与底物浓度成正比，而是逐步趋向平衡。 （2）酶浓度：在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。

（3）温度的影响：每一种酶的催化反应都有其适宜的温度范围和最适温度。在适宜温度范围内，酶才能进行催化反应；在最高温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。

（4）pH的影响：酶的催化作用与反应液的pH有很大关系。每一种酶都有各自的适宜pH范围和最适pH。只有在适宜pH范围内，酶才能显示其催化活性在最适pH条件下，酶催化反应速度达到最大。

（5）抑制剂的影响：在抑制剂的条件下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能。抑制剂有可逆性抑制剂和不可逆性抑制剂之分。不可逆性抑制剂与酶分子结合后，抑制剂难以除去，酶活性难以恢复。可逆性抑制剂与酶的结合是可逆的，只要将抑制剂除去，酶活性即可恢复。

（6）激活剂的影响：在激活剂的影响下，酶的催化活性提高或者由无性得酶原生成有催化活性的酶。 4、举例说明酶催化的绝对专一性和相对一性。

答：一种酶只能催化一种底物进行一种反应，这种高度的专一性称为绝对专一性。当酶作用的底物含有不对称碳原子时，酶只能作用于异构体的一种。这种绝对专一性称为立体异构专一性。例如，天冬氨酸氨裂合酶【EC4.3.1.1】，仅作用于L-天冬氨酸，经过脱氨基作用生成延胡索酸（反丁烯二酸）及其逆反应都一概不起作用。

一种酶能够催化结构相似的底物进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。相对专一性可分为键专一性和基团专一性。

键专一性的酶能够作用于具有相同化学键的一类底物。如，酯酶可催化所有含酯键的酯类物质水解生成醇和酸。 基团专一性的酶则要求底物含有某一相同的基团。如，胰蛋白酶【EC3.4.31.4】选择性地水解含有赖氨酰-或精氨酰- 羰基肽键的物质，不管是氨酰、酯或多肽、蛋白质都能被该酶水解。 六、综合分析题,试述木瓜蛋白酶的生产方法。

答：木瓜蛋白酶可以采用提取分离法、基因工程酶发酵法、植物细胞培养法等多种方法进行生产。 （1）提取分离法：从木瓜的果皮中获得木瓜乳汁，通过各种分离纯化技术获得木瓜蛋白酶。

（2）发酵法：通过DNA重组技术将木瓜蛋白酶的基因克隆到大肠杆菌等微生物中，获得基因工程菌，再通过基因工程菌发酵获得木瓜蛋白酶。

（3）植物细胞培养法：通过愈伤组织诱导获得木瓜细胞，再通过植物细胞培养获得木瓜蛋白酶

第二章 微生物发酵产酶

名词解释

1、酶的发酵生产 2、转录 3、翻译 4、酶的诱导 5、酶的反馈阻遏 6、分解代谢物阻遏 7、发酵动力学 二、填空题

1、转录是以 DNA 为模板，以 核苷三磷酸 为底物，在_依赖DNA的RNA聚合酶 的作用下生成 RNA 的过程。 2、微生物产酶方式可以分为同步合成型， 延续合成型 ,中期合成型， 滞后合成型 四种。 3、生长因素是 细胞生长繁殖 所必需的 微量有机化合物 。

4、莫诺德常数Ks是指生长速率达到 最大比生长速率一半 时的 限制性基质浓度 。

5、发酵动力学是研究发酵过程中细胞生长速率， 产物生成速率 ，基质消耗速率及其影响因素的学科。 三、选择题

1、可以通过添加（ C ）使分解代谢物阻遏作用解除。 A、诱导物 B、激活剂 C、cAMP D、ATP 2、在酶发酵过程中添加表面活性剂可以（D ）。

2

A、诱导酶的生物合成 B、阻遏酶的生物合成C、提高酶活力 D、提高细胞透过性 3、有些酶在细胞进入平衡期以后还可以继续合成较长的一段时间，这是由于（ A）。

A、该酶所对应的mRNA稳定性好 B、该酶所对应的DNA稳定性好C、细胞自溶后使酶分泌出来 D、培养基中还有充足的营养成分

4、莫诺德常数是指（B ）

A、反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。B、比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。 C、产酶速率达到最大产酶速率一半时的限制性基质浓度。D、细胞生长速率达到最大细胞生长速率一半时的限制性基质浓度。 四、判断题

（ X）1、固定化细胞在一定的空间范围内生长繁殖，由于细胞密度增大，使生化反应加速，所以能够提高酶活力。 （ V）2、某些酶的催化反应产物可以诱导该酶的生物合成。

（ V）3、在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的酶合成方式是延续合成型。 （X）4、氨酰-tRNA合成酶具有识别mRNA和tRNA的功能。

（ X）5、固定化原生质体与固定化细胞一样可以进行生长繁殖和新陈代谢。 五、简答题

1、为什么属于滞后合成型的酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成？

答：属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期后才开始合成，主要有两个原因：一是由于酶的生物合成受到培养基中阻遏作用，只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而解除阻遏以后，酶才开始大量合成；二是由于该类型酶对所对应的mRNA稳定性好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。

简述微生物发酵产酶培养基的主要组分及其作用。

答：培养基的主要组成包括：碳源、氮源、无机盐和生长因子等。

碳源是指能够为细胞提供碳素化合物的营养物质。在一般情况下，碳源也是为细胞提供能量的能源。碳是构成细胞的主要元素之一，也是所有酶的重要组成元素。所以碳源是酶的生物合成法生产中必不可少的营养物质。

氮源是指能向细胞提供氮元素的营养物质。氮元素是各种细胞中蛋白质。核酸等组分的重要组成元素之一，也是各种酶分子的组成元素。氮源是细胞生长、繁殖和酶的生产的必不可少的营养物质。

无机盐的主要作用是提供细胞生命活动所必不可缺的各种无机元素，并对细胞内外的PH、氧化还原电位和渗透压起调节作用。

生长素是指细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等。氨基酸是蛋白质的组分；嘌呤和嘧啶是核酸和某些辅助酶或辅基的组分；维生素主要是起辅酶作用。 简述微生物发酵产酶过程中工艺条件的限制性。

答：微生物发酵产酶的过程中，必须根据需要和变化情况，适时进行PH、温度、溶解氧等发酵工艺条件的控制。 （1）PH的调节控制：培养基的PH与细胞的生长繁殖以及发酵产酶关系密切，不同的细胞，其生长繁殖的最适PH有所不同，细胞发酵产酶的最适PH与生长最适PH也往往有所不同，所以必须根据不同的细胞特性和发酵的不同阶段进行PH的控制。

有些细胞可以同时生产若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的PH，往往可以改变各种酶之间的产量比例。 随着细胞的生长繁殖和新陈代谢产物的积累，培养基的PH往往会发生变化。所以在发酵过程中，必须根据变化的情况对培养基的PH进行适当的控制和调节。

调节PH的方法可以通过改变培养基的组分或其比例；也可以使用缓冲液来稳定PH；或者在必要时通过流加适宜的酸、碱溶液的方法，调节培养基的PH，以满足细胞生长和产酶的要求。

（2）温度的调节控制：细胞的生长繁殖和发酵产酶需要一定的温度条件，不同的细胞有各自不同的最适生长温度。 有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长的最适温度有所不同，而且往往低于最适生长温度。要在不同的发酵阶段控制不同的温度。即在细胞生长阶段控制在细胞生长的最适温度范围，而在产酶阶段，控制在产酶最适温度。

在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新陈代谢作用，会不断放出热量，使培养基的温度升高，同时，由于热量的不断扩散，会使培养基的温度不断降低。两者综合结果，决定了培养基的温度。由于在细胞生长和产酶的不同阶段，细胞新陈代谢放出的热量有较大的差别，散失的热量又受到环境温度等因素的影响，使培养基的温度发生明显的变化。为此必须经常及时地对温度进行调节控制，使培养基的温度维持在适宜的范围内。

温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。为了及时地进行温度的调节控制，在发酵罐或者其他的生物反应器中，均应设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等，并且随时备有冷水和热水以满足温度调控的需要。

（3）溶解氧的调节控制：细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量，为零获得足够多的能量，细胞必须

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获得充足的氧气，使从培养基中获得的能源物质经过有氧降解而生成大量的ATP。

在培养基中培养的细胞一般只能吸收和利用溶解氧，由于氧是难溶于是的气体，在通常情况下，培养基中的溶解的氧并不多，在细胞培养过程中，培养基中原有的溶解氧很快就会被细胞利用完，为了满足细胞的生长繁殖和发酵产酶的需要，在发酵过程中必须不断供给氧，使培养基中的溶解氧保持在一定的水平。

溶解氧的调节控制，就是要根据细胞对溶解氧的需要量，连续不断地进行补充，使培养基中的溶解氧的量保持恒定。 溶解氧的供给，一般是将无菌空气通入发酵容器，再在一定的条件下，使空气中的氧溶解到培养液中，以供细胞生命活动之需。

培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速率，溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间，气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般来说，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长。气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。 随着发酵过程的进行，细胞耗氧速率发生改变时，必须相应地对溶氧速率进行调节。

调节溶解氧的方法主要有调节通气量，调节氧的分压，调节气液接触时间，调节接触面积，改变培养液的性质等，可以根据不同菌种，不同产物、不同的生物反应器、不同的工艺条件下的不同情况选择使用。以便根据发酵过程耗氧速率的变化而及时有效地调节溶氧速率。 4、固定化细胞发酵产酶有哪些特点？

答：固定化细胞发酵产酶与游离细胞发酵产酶相比，具有下列显著特点：

1）提高酶产率：细胞经过固定化后，在一定的空间范围内生长繁殖，细胞密度增大，因而使细胞反应加速，从而提高酶产率。例如，固定化枯草杆菌生产淀粉酶，在分批发酵时，其体积产酶率达到游离细胞的122%，在连续发酵时，产酶率更高。再如，转基因大肠杆菌细胞生产酰胺酶，经过固定化后的细胞比没有选择压力时游离细胞的产酶率提高10~20倍。 2）可以反复使用或连续使用较长时间：固定化细胞固定在载体上，不容易脱落流失，所以固定化细胞可以进行半连续发酵，反复使用多次；也可以在高稀释的条件下连续发酵较长时间。例如,固定化细胞进行酒精、乳酸等厌氧发酵，可以连续使用半年或者更长的时间；固定化细胞发酵产生淀粉酶等，也可以连续地使用30d以上。

3）基因工程菌的质粒稳定，不易丢失：基因工程菌经过固定化后，由于有载体的保护作用，质粒的结构稳定性和分裂稳定性都显著提高。

4）发酵稳定性好：细胞经过固定化后，由于受到载体的保护作用，使细胞对温度、PH的适应范围增宽；对蛋白酶和酶抑制剂等的耐受能力增强，所以能够比较稳定地进行发酵生产。这一特点使固定化细胞发酵的操作控制变得相对容易，并有利于发酵生产的自动化。

5）缩短发酵周期，提高设备利用率：固定化细胞，如果经过预培养，转入发酵培养基以后，很快就可以发酵产酶，而且能够较长时间维持产酶特性，所以可以缩短发酵周期，提高设备利用率。若不经预培养，第一批发酵时，周期与游离细胞基本相同，但是第二批以后，其发酵周期将明显缩短。例如，固定化黑曲霉细胞半连续发酵生产糖化酶，第一批发酵时，周期为120h，与游离细胞发酵周期相同，但是从第二批发酵开始，发酵周期缩短至60h。若采用连续发酵，则可以在高稀释的条件下连续稳定地产酶，这就更加提高设备利用率。

6）产品容易分离纯化：固定化细胞不溶于水，发酵完成后，容易与发酵液分离，而且发酵液中所含的游离细胞很少，这就有利于产品的分离纯化，从而提高产品的纯度和质量。

7）适用于胞外酶等胞外产物的生产：由于固定化细胞与载体结合在一起，所以固定化细胞一般只是用于胞外酶等胞外产物的生产。

5、固定化微生物原生质体发酵产酶有哪些特点？ 答：（1）变胞内产物为胞外产物：固定化原生质体由于解除了细胞壁的扩散障碍，可以使原本存在于细胞质中的胞内酶不断分泌到细胞外。变革了胞内酶的生产工艺。例如，笔者等人采用固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化酶，使细胞内葡萄糖氧化酶的90%以上分泌到细胞外。

（2）提高酶产率：由于出去了细胞壁，增加了细胞的通透性，有利于氧气和其他营养物质的传递与吸收，也有利于胞内物质的分泌，可以显著提高酶产率。例如，笔者等人的研究表明，固定化枯草杆菌原生质体发酵生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞间质中的碱性磷酸酶全部分泌到发酵液中，产酶率提高30%。

（3）稳定性好：固定化原生质体由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可以反复使用或者连续使用较长时间，利于连续生产。

（4）易于分离纯化：固定化原生质体易于和发酵液分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。 6、试述酵发酵动力学的主要内容。

答：发酵动力学的主要内容包括细胞生长动力学，产物生成动力学和基质消耗动力学。

细胞生长动力学主要研究发酵过程中细胞生长速率以及各种因素对细胞生长速率的影响规律；产物生成动力学主要研究发酵过程中产物生成速率以及各种因素对产物生成速率的影响规律；基质消耗动力学主要研究发酵过程中基质消耗速率以及各种因素对基质消耗速率的影响规律。

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六、综合分析题

1、在酵发酵生产过程中，为了提高酶的产率，可以采取哪些措施？

答：在酶的发酵生产过程中，要使酶的产率提高，必须采取一系列的措施，主要的有：

（1）使用优良的产酶细胞：通过筛选、诱变、原生质体融合、基因重组、定向进化等手段，获得生长快、产率高、稳定性好的产酶细胞。

（2）使用优良的发酵生产设备：通过精心设计或者选择使用高产、低耗的发酵罐等发酵生产设备。

（3）采用先进的分离纯化技术和设备：采用操作简便、收得率高的分离化技术设备，以达到高产丰收的效果。 （4）控制好工艺条件：在发酵过程中，要根据菌种特性，确定培养基和发酵工艺条件，进行工艺优化，并根据需要和变化的情况及时加以调节控制。

（5）此外还可以采取某些行之有效地措施，诸如添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂 等。 2、从如下实验方法和结果分析酶生物合成的调节作用。

实验方法：将大肠杆菌细胞接种于营养汤肉培养中，于37℃振荡培养，当OD550达到0.3左右时，将培养液分装到4个小三角瓶中，每瓶17mL培养液。于4个三个瓶中分别添加（A）3mL无菌水；（B）1mL乳糖溶液（0.1mol/L）和2mL无菌水；（C）1mL乳糖溶液（0.1mol/L）、1mL葡萄糖溶液（0.1mol/L）和1mL无菌水；（D）1mL乳糖溶液（0.1mol/L）、1mL葡萄糖溶液（0.1mol/L）和1mLcAMP钠盐溶液（0.1nmol/L）。然后在相同的条件下于于37℃振荡培养2h，分别取样测定B-半乳糖腺酶的活力。 实验结果：（A）瓶和（C）瓶样品的B-半乳糖腺酶活力为0，（B）瓶和（D）瓶 样品的B-半乳糖腺酶活力达到1000U/mL左右。

答：从实验方法和结果可以进行下列分析，并得出如下结论： （1）（A）号瓶为对照，只加入无菌水，结果没有半乳糖苷酶产生，表明半乳糖苷酶不是组成酶，而是诱导酶。 （2）（B）号瓶加入半乳糖，结果在2h内半乳糖苷酶大量合成，表明乳糖是半乳糖苷酶的诱导剂。 （3）（C）号瓶与（B）号瓶相比，在含有乳糖的基础上增加了葡萄糖，结果也没有半乳糖苷酶产生，表明半乳糖苷酶的合成受到葡萄糖的阻遏作用，由于葡萄糖是一种容易利用的碳源，其对半乳糖苷酶的阻遏作用属于分解代谢物阻遏作用。 （4）（D）号瓶与（C）号瓶相比，增加了cAMP结果半乳糖苷酶又大量合成，表明cAMP可以使分解代谢物阻遏作用解除。

第三章 动植物细胞培养产酶 一、名词解释

1、动物细胞培养产酶 2、植物细胞培养产酶 3、端粒酶 4、抗体酶 5、半抗原

6、超氧化物歧化酶 7、纤维酶原激活剂 二、填空题

1、植物细胞培养主要用于生产色素、香精、 药物、酶 、等次级代谢产物。

2、动物细胞培养主要用于生产疫苗、激素、单克隆抗体、多肽因子、酶等 功能性蛋白质 。 3、抗体酶的主要获得方法有修饰法、半抗原诱导法 、酶蛋白抗原诱导法。

4、植物细胞和微生物细胞的特性差异主要有细胞体积大，生长倍增时间长，营养要求较简单，大多数需要光照，对剪切力敏感 等显著特点。

5、动物细胞培养方法主要有悬浮培养，贴壁培养、固定化细胞培养 。 三、选择题

1、半抗原（ B ）

A、可以诱导抗体生成，但不能与抗体特异结合B、可以与抗体特异结合，但不能诱导抗体生成 C、可以诱导抗体产生，也可以与抗原特异结合D、不能与抗体特异结合，也不能与抗体特异结合 2、端粒酶是（ C

A、催化端粒水解的酶B、存在于端粒中的酶C、催化端粒生成和延长的酶D、催化RNA生成和延长的酶 3、抗体酶是（B）

A、具有催化活性的抗体分子B、具有催化活性的RNA分子C、催化抗体水解的酶D、催化抗体生成的酶 4、纤溶酶原激活剂是（D）

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A催化纤溶酶水解反应的酶 B催化纤维蛋白水解反应酶 C催化纤维蛋白原水解反应酶 D催化纤溶酶原水解反应的酶 四、简答题与计算题

1、什么是端粒酶？简述其催化过程。

答：端粒酶（Telomerase）是催化端粒合成和延长的酶。端粒酶的催化过程主要包括下列3个步骤： （1）结合：端粒酶分子的RNA重复序列与DNA端粒末端按照互补原则结合。

（2）延伸：以端粒酶分子的RNA为模板，通过反转录作用，使DNA分子上的端粒延伸。 （3）移位：端粒酶移动到延伸后的端粒末端。重复上述过程，反复进行，使端粒不断延。 2、何谓抗体酶？试述获得抗体酶的主要方法。

抗体酶（abzyme）又称为催化性抗体（catalytic antibody）,是一类具有生物催化功能的抗体分子。 抗体酶的制备方法主要有诱导法，修饰法等。

修饰法是对抗体进行分子修饰，在抗体与抗原的结合部位引进催化基因，而成为抗体酶的方法。 诱导法是利用特定的抗原诱导抗体酶合成的方法，根据所采用的抗原不同，诱导法有半抗原诱导法和酶蛋白抗原诱导法。 半抗原诱导法是以预先设计的过渡态类似物作为半抗原，与载体蛋白（如牛血清蛋白等）偶联制成抗原，然后免疫动物，再经过单克隆抗体制备技术制备、分离、筛选得到所需的抗体酶。

酶蛋白抗原诱导抗体酶的生成是以某种外源酶蛋白作为抗原诱导抗体酶产生的方法。首先选定一种酶蛋白作为抗原免疫动物，在酶蛋白抗原的诱导下，动物体内产生与酶分子特异结合的抗体，再将获得的酶抗体免疫动物，并采用单克隆抗体技术制备得到与酶抗体特异结合的抗抗体。那么，抗抗体结合部位的构象与用作抗原的酶分子的结合中心的构象相同，对抗抗体进行筛选，就有可能获得具有催化活性的抗体酶。 3、植物细胞培养有何特点？

答：植物细胞培养具有如下显著特点：

（1）提高产率：使用优良的植物细胞进行培养生产天然产物，可以明显提高天然产物的产率，例如，日本三井石油化学工业公司于1983年在世界上首次成功地采用紫草细胞培养23天。细胞中紫草宁的含量达到细胞干重的14%，比紫草根中紫草宁的含量高10倍，植物细胞培养生产紫草宁的比产率达到5.7mg/d*g细胞，比种植紫草宁比产率（0.0068mg/d*g植物）高830倍。

（2）缩短周期：植物细胞声场的倍增时间一般为12~60h，一般生产周期15~30d，这比起微生物来时相当长的时间，但是与完整植物的生长周期比较，却是大大地缩短生产周期。一般植物从发芽、生长到收获，短则几个月，长则数年甚至更长时间。例如，木瓜的生长周期一般为8个月，紫草为5年，野山参则更长。

（3）易于管理，减轻劳动强度：植物细胞培养在人工控制条件的生物反应器中进行生产，不受地理环境和气候条件等的影响，易于操作管理，大大减轻劳动强度，改善劳动条件。

（4）提高产品质量：植物细胞培养的主要产物的产率较高，杂质较少，在严格控制条件的生物反应器中生产，可以减少环境中的有害物质的污染和微生物、昆虫等的侵蚀，产物易于分离纯化，从而使产品质量提高。 （5）植物细胞对剪切力敏感 。 （6）植物细胞培养需要一定的光照。

4、举例说明植物细胞培养产酶的工艺流程。

答：植物细胞培养产酶的工艺过程一般包括愈伤组织的诱导，细胞悬浮培养和酶的分离纯化三个阶级，现以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例，说明其工艺过程。

（1）愈伤组织的诱导：选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，在4℃冰箱中放置3周，以打破休眠。去除外皮，先用70%乙醇消毒20秒，再用0.1%氯化汞消毒10min，成0.5cm3左右的小块，植入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L 6-BA的半固体MS培养基中，25℃、600lux\\12h/d光照的条件下培养18d,诱导得到愈伤组织，每18d继代一次。 （2）细胞悬浮培养：将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L 6-BA的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃、600lux、12h/d的光照条件下振荡培养10~12d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。然后再无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L2，4-D和1.2mg/L 6-BA的液体MS培养基中，25℃、600lux、2h/d光照的条件下培养18d。

（3）酶的分离纯化：细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎，用pH7.8的磷酸缓冲液提取、有机溶剂沉淀等，分离得到超氧化物歧化酶。

5、试述植物细胞培养产酶的工艺条件及其控制。

答：在植物细胞培养产酶的工艺条件及其控制主要包括培养基，温度，pH，溶解氧，光照等。

（1）培养基：植物细胞培养的培养基与微生物培养基有较大的差别，其主要不同点在于：植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐，除了P、S、N、K、Na、Ca、Mg等大量元素以外，还需要Mn、Zn、Co、Mo、Cu、B、I等微量元素；植物细胞需要多种维生素和植物生长激素，如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等；植物细胞要求的氮源一般为无机氮源，即植物细胞可以同化硝酸盐和铵盐；植物细胞一般以蔗糖为碳源。

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（2）温度：植物细胞培养的温度一般控制在室温范围（25℃左右）。温度高些，对植物细胞的生长有利，温度低些，则对次级代谢物的积累有利，但是通常不能低于20℃，也不要高于35℃。有些植物细胞的最适生长温度和最适产酶温度有所不同，要在不同的阶段控制不同的温度。

（3）pH：植物细胞的pH一般控制在微酸性范围，即pH 5~6。培养基配置时，pH一般控制在5.5~5.8范围，在植物细胞培养过程中，一般pH变化不大。

（4）溶解氧：植物细胞的生长和产酶需要吸收一定得溶解氧。溶解氧一般通过通风和搅拌来供给。适当的通风、搅拌还可以使植物细胞不至于凝集成较大的细胞团，以使细胞分散，分布均匀，有利于细胞的生长和新陈代谢。然而，由于植物细胞代谢较慢，需氧量不多，过量的氧反而会带来不良影响。假山植物细胞体积大、较脆弱、对剪切力敏感，所以通风和搅拌不能太强烈，以免破坏细胞。这在植物细胞反应器的设计和实际操作中，都要予以充分注意。 （5）光照：光照对植物细胞培养有重要影响，大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生长要求一定波长的光的照射，并对光照强度和光照时间有一定的要求，而有些植物次级代谢物的生物合成却受到光的抑制。例如，欧芹细胞在黑暗的条件下可以生长，但是只有在光照的条件下，才能形成类黄酮化合物；植物细胞中萘醌的生物合成受到光的抑制等。笔者等人的研究表明，光质对于玫瑰茄细胞培养生产花青素有显著影响，其中蓝光（波长420~530nm）可以显著促进花青素的生物合成。因此在植物细胞培养过程中，应当根据植物细胞的特性以及目标次级代谢物的种类不同，进行光照的调节控制。尤其是在植物细胞的大规模培养过程中，如何满足植物细胞对光照的要求，是反应器设计和实际操作中要认真考虑并有待研究解决的问题。

（6）前体的添加：前体是指出于目的代谢物代谢途径上游的物质。为了提高植物细胞培养生长次级代谢物的产量，在培养过程中添加目的代谢物的前体是一种有效的措施。例如，在辣椒细胞培养生产辣椒胺的过程中，添加苯丙氨酸作为前体，可以全部转变为辣椒胺，添加香草酸和异癸酸作为前体，亦可以显著提高辣椒胺的产量。

（7）刺激剂的应用：刺激剂可以促进植物细胞中的物质代谢朝着某些次级代谢物生成的方向进行，从而强化次级代谢物的生物合成，提高某些次级代谢物的产率。所以在植物细胞培养中添加适当的刺激剂即可以显著提高某些次级代谢物的产量。常用的刺激剂有微生物细胞壁碎片和果胶酶、纤维素酶等微生物胞外酶。例如，Rolfs等人用霉菌细胞壁碎片为刺激剂，使花生细胞中L-苯丙氨酸氨基裂合酶的含量增加4倍，同时使二丙乙烯合酶的量提高20倍；Funk等人采用酵母葡聚糖（酵母细胞壁的主要成分）作为刺激剂，可使细胞积累小蘖碱的量提高4倍；笔者等人在鼠尾草细胞悬浮培养中，添加0.5U/mL的果胶酶作为刺激剂，可使细胞中迷迭香酸的产量提高62%。 6、试述动物细胞培养的特点。 答：（1）动物细胞培养主要用于各种功能蛋白质的生产，如疫苗、激素、酶、单克隆抗体、多肽生长因子等。 （2）动物细胞的生长较慢，细胞倍增时间15~100h。

（3）为了防止微生物污染，在培养过程中，需要添加抗生素。加进的抗生素药能够防治细菌的污染，又不影响动物细胞的生长。现在一般采用青霉素（50~100U/mL）和链霉素（50~100 U/mL）联合作用。也可以添加一定浓度的两性霉素（fungizone）、制霉菌素（mycostatin）等。此外，为了防治支原体的污染，可以采用卡那霉素、金霉素、泰乐菌素等进行处理。

（4）动物细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感，所以在培养过程中，必须严格控制温度、pH、渗透压、通风搅拌等条件，以免破坏细胞。

（5）大多数动物细胞具有锚地依赖性，适宜采用贴壁培养；有部分细胞，例如来自血液、淋巴组织的细胞、肿瘤细胞和杂交瘤细胞等，可以采用悬浮培养。 （6）、动物细胞培养基成分较复杂，一般要添加血清或其它用品，产物的分离纯化过程较繁杂，成本较高，适用于高价值药物的生产。原代细胞继代培养50代后，即会退化死亡，需要重新分离细胞。 7、动物细胞培养过程中要注意控制哪些工艺条件？

答：在动物细胞培养中，要掌握好培养基，温度，pH，渗透压，溶解氧等各种工艺条件并根据具体情况进行适当的控制。 （1）、培养基

动物细胞培养基的组分较为复杂，包括氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、激素、生长因子等。

动物细胞培养液的组分复杂，有些组分的含量很低。所以应首先配制各类母液，如100倍浓度氨基酸母液，1000倍浓度维生素母液，100浓度葡萄糖母液（溶解于平衡盐溶液）等；在使用前，分别吸取一定体积的母液，混匀得到混合母液，膜过滤除菌后，冷冻备用；使用时，取一定体积的混合母液，用无菌的平衡盐溶液稀释至所需浓度。 （2）、温度的控制

温度对动物细胞的生长和代谢有密切关系。一般控制在36..5℃，允许温度波动范围在0.25℃之内。 温度的高低也会影响培养基的pH，因为在温度降低时，可以增加CO2的溶解度，而使Ph降低。 （3）、pH的控制

培养基的pH对动物细胞的生长和新陈代谢有显著影响。一般控制在pH7.0~7.6的微碱性范围内，通常动物细胞在pH7.4的条件下生长最好。

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在动物细胞培养基过程中，随着新陈代谢的进行，培养液的pH将发生变化。从而影响动物细胞的正常生长和代谢。为此，在培养过程中需要对培养基的pH进行检测和调节。

培养基中pH的调节，通常采用CO2和NaHCO3溶液。增加CO2的浓度，可使培养液的pH降低；添加碳酸氢钠溶液，可使pH升高。然后，通过改变CO2的浓度的方法来调节pH，会对培养液中的溶解氧产生影响。所以在pH控制系统的设计和操作过程中，应当同时考虑溶解氧控制。在细胞密度高时，由于产生的CO2和乳酸等物质的量增加，pH的变化较大，需要时可以采用流加酸液或局部pH的较大波动和渗透压的增加，会对细胞生长带来不利的影响。 为了避免培养过程中pH的快速变化，维持pH的稳定，通常在培养液中加入缓冲系统。例如，CO2和NaHCO3系统，柠檬酸与柠檬酸盐系统等。此外，另一个被广泛采用的缓冲系统是羟乙基呱嗪乙磺酸（HEPES）。HEPES的添加浓度一般为25mmol/L，则可能对某些细胞产生毒害作用。

检测动物细胞培养液中pH的变化，常用的指示剂为酚红。可以根据酚红颜色的变化确定pH。蓝红色为pH7.6，红色为pH7.4，橙色为pH7.0，黄色为pH6.5。

(4）渗透压的控制

动物细胞培养液中渗透压应当与细胞内的渗透压出于等渗状态。一般控制在700~850kPa范围内。在配制培养液或者改变培养基成分时，要特别注意。 （5）溶解氧的控制

溶解氧的供给对动物细胞培养至关重要。供氧不足时，细胞生长受到抑制，氧气过量时，也会对细胞产生毒害。 8、举例说明动物细胞培养产酶的工艺流程。

答：现以人黑色素瘤细胞培养产生组织纤维酶原活化剂为例。说明动物细胞培养产酶的工艺过程及其控制。 人黑色素瘤细胞培养采用Eagle培养基其工艺过程如下： （1）、将人黑色素瘤的种质细胞用胰蛋白酶消化处理，分散，用pH7.4的磷酸缓冲液洗涤，计数，稀释成细胞悬浮液； （2）、在消毒好的反应器中装进一定量的培养液，将上述细胞悬浮液接种至反应器中，接种浓度为（1~3）*1000个细胞\\mL，于37℃的CO2培养箱中，通入含5% CO2的无菌空气，培养至长成单层致密细胞； （3）、倾去培养液，用pH7.4的磷酸缓冲液洗涤细胞2~3次； （4）、换入一定量的无血清Eagle培养液，继续培养； （5）、每隔3~4d，取出培养液进行tPA的分离纯化； （6）、然后再向反应器中加入新鲜的无血清Eagle培养液，继续培养，以获得大量tPA； （7）、从上述获得的培养液中采用亲和层析等技术进行分离纯化，获得组织纤溶酶原活化剂。

第四章 酶的提取与分离纯化

一、名词解释

8、电泳 1、细胞破碎

9、萃取 2、酶的提取

10、双水相萃取 3、沉淀分离

11、超临界萃取 4、层析分离

12、过滤 5、凝胶层析

13、膜分离技术 6、亲和层析

14、结晶 7、离心分离

二、填空题

1、细胞破碎的主要方法有机械破碎，物理破碎，-化学破碎法，酶促破碎法 。

2、酶的提取方法主要有盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取， 有机溶剂提取 。

3、结晶的方法主要有 盐析结晶法 ，有机溶剂结晶法，透析平衡结晶法，等电点结晶法。 4、离心方法主要有差速离心，密度低度离心，等密梯度离心 。 5、加压膜分离可以分为微滤，超滤 ，反渗透。

6、常用的萃取方法有有机溶剂萃取，双水相萃取，超临界萃取，反胶束萃取。

7、按照凝胶的组成系统不同，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分为连续凝胶电泳，不连续凝胶电泳，浓度梯度凝胶电泳，SDS凝胶电泳 。

8、在CO2超临界萃取中，目标产物的分离方法主要有等压分离，等温分离，吸附分离。 三、选择题

1、酶的提取是（D ）的技术过程。

A、从含酶物料中分离获得所需酶B、从含酶溶液中分离获得所需酶

C、使胞内酶从含酶物料中充分溶解到溶剂或者溶液中D、使酶从含酶物料中充分溶解到溶剂或者溶液中

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2、在凝胶层析的洗脱过程中，（A ）

A、分子质量最大的分子最先流出B、分子质量最小的分子最先流出C、蛋白质分子最先流出D、盐分子最先流出 3、超临界流体能够用于物质分离的主要原因在于（C ）

A、超临界流体的密度接近于液体B、超临界流体的黏度接近于液体

C、在超临界流体中不同物质的溶解度不同D、超临界流体的扩散系数接近于气体，是通常液体的近百倍 4、在等电点聚集电泳系统中，形成pH梯度的主要原因是（B ）

A、系统中有pH梯度支持介质B、系统中有两性电解质载体C、系统中有不同等电点的蛋白质D、系统中阳极槽装酸液，阴极槽装碱液 四、简答题

1、简述酶沉淀分离的主要方法及其原理。

答：沉淀分离的方法主要有盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等。 （1）、盐析沉淀法：盐析沉淀法简称盐析法，是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐。使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。

蛋白质在水中的溶解度收到溶液中盐浓度的影响。在盐浓度达到到一定浓度后，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。在某一浓度的盐浓度中，不同蛋白质的溶解度各不相同，由此可达到彼此分离的目的。

盐之所以会改变蛋白质的溶解度，是由于盐在溶液中离解为正离子和负离子。由于反离子作用，使蛋白质分子表面的电荷改变，同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改变。 （2）、等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有 不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀法。

在溶液的pH等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。 （3）、有机溶剂沉淀法：利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法。

有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶剂的介电常数降低。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与谁互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。 （4）、复合沉淀法：在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方法称为复合沉淀法。

复合沉淀法可以与酶分子形成复合物，复合物的溶解度降低，从而使沉淀析出， （5）、选择性变性沉淀法：选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，这种分离方法称为选择性变性沉淀。

选择性变性沉淀法是选择某个适宜的条件某些杂质而沉淀析出，而又对酶没有明显影响，所以可以达到分离的目的。 2、何谓膜分离技术？在酶的生产中有何应用？ 答：借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。 在酶的生产中，可以利用微滤技术除去粗酶液中的微生物细胞，利用超滤技术除去相对分子质量不同的蛋白质等杂质，进行酶的分离纯化，同时还达到酶液浓缩的目的，特别适用于液体酶制剂的生产。 3、简述双水相萃取的概念与特点。

答：双水相萃取是利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离的萃取技术。

双水相萃取由于两相都是水溶液，可以避免酶的变性失活，但是双水相系统中水的含量高，分离后的酶浓度低，需经过浓缩等以提高浓度，双水相系统中含有高分子聚合物或盐类，在分离后需要进一步进行分离纯化，以除去高分子聚合物和盐类等杂质。

4、简述超临界萃取的概念与特点。

答：超临界萃取又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术，

超临界萃取以超临界流体作为萃取剂，超临界流体的物理特性和传质特性通产介于液体和气体之间，适于作为萃取溶剂；超临界流体的密度比气体密度大得多，接近于液体密度，因此其溶解能力与液体相似；接近气体的黏度，有利于物质的扩散，其扩散系数接近于气体，是通常液体的近百倍，因此超临界流体具有很高的萃取速度；超临界流体对物质的溶解度能力随着温度和压力的变化而变化，萃取后易于分离；不同的物质在超临界流体中的溶解度不同，溶解度大的物质溶解在超临界流体中，与不溶解解或溶解度小的杂质分离，然后通过升高温度、降低压力或者通过吸附剂的作用，从含有目标物质的超临界流体中得到所需的物质。

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目前在超临界萃取中最常用的超临界流体是CO2。 CO2超临界点的温度为31.1℃,超临界压力为7.3MPa，超临界密度为0.47g/mL。特别适用于生物活性物质的提取分离。 5、试述凝胶层析的原理与操作要点。

答：凝胶层析是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。 （1）、凝胶层析的基本原理：凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，各组分在层析柱内同时进行两种不同的运动，一种是随着溶液流动而进行垂直向下的移动，另一种是无定向的分子扩散运动（布朗运动）。大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。在凝胶层析中，相对分子质量也并不是唯一的分离依据，有些物质的相对分子质量相同，但由于分子的形状不同，再加上各种物质与凝胶之间存在着非特异性的吸附作用，故仍然可以分离。 （2）、凝胶层析操作要点：凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、洗脱等过程。

装柱时首先选择好粗细均匀，一定直径和一定高度的层析柱，在柱的底部放置一层玻璃纤维或者棉花，柱内先充满洗脱剂（一般是水货缓冲液做洗脱剂），然后一边搅拌一边缓慢而连续地加入浓稠的凝胶悬浮液，让其自然沉降，直至达到所需的高度，要注意凝胶分布均匀，不能有气泡或裂纹存在。柱装好以后，不管使用与否，都应有洗脱液浸过凝胶表面，以免黁如空气而影响分离效果。

上柱是将欲分离的混合溶液加入凝胶层析柱的过程。要在洗脱液的液面恰好与凝胶床的表面相平时加入混合液，使组分能够均匀地进入凝胶床。上柱的混合液体积不能过大，通常为凝胶床体积的10%左右，最大不能超过30%。混合液的浓度可以高些，但是黏度宜低。

上柱完毕后，加进洗脱液进行洗脱。洗脱液应于干燥凝胶溶胀时及装柱平衡时所使用的液体完全一致，否则会影响分离效果。所使用的洗脱液体积一般为凝胶床体积的120%左右，洗脱流出液分部收集。

洗脱完毕后，凝胶柱已经恢复酶液上柱前的状态，不用经过再生处理，就可以重复用于下一批酶液的分离纯化。 6、简述凝胶电泳的分类及其操作要点。 答：聚丙烯酰胺凝胶电泳按其凝胶组成系统的不同，可以分为连续凝胶电泳、不连续凝胶电泳、浓度梯度凝胶电泳和SDS凝胶电泳等4种。 （1）、连续凝胶电泳：采用均一的凝胶作为支持的电泳称为连续凝胶电泳。此法配制凝胶时较为简便，但是分离效果稍差，一般用于组分较少的样品的分离。 （2）、不连续凝胶电泳：采用2层或3层性质不同的凝胶（样品胶、浓缩胶和分离胶）为支持体的电泳称为不连续凝胶电泳。采用两种不同的PH地缓冲液，能使浓度较低的各种组分在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨率。 （3）、梯度凝胶电泳：采用由上而下浓度逐渐升高、孔径逐渐减少的梯度凝胶为支持体的电泳称为梯度凝胶电泳。梯度凝胶用梯度混合装置制成，主要用于测定球蛋白类组分的相对分子质量。 （4）、SDS-凝胶电泳：采用SDS-凝胶为支持体的电泳称为SDS-凝胶电泳，主要用于蛋白质相对分子质量的测定。 7、简述不连续凝胶电泳的原理

答：不连续凝胶电泳的凝胶由样品胶、浓缩胶和分离胶三层组成，其中样品胶处于凝胶系统最上层的大孔径凝胶，在PH6.7~6.8的Tris-HCl缓冲液中聚合而成，含有欲分离的样品，有时可以不用这层样品胶，而直接将样品与10%的甘油或5%~20%的蔗糖混合后，加到浓缩胶的表面。浓缩胶在PH6.7~6.8的Tris-HCl缓冲液中聚合而成的大孔凝胶，除了不含样品外，其他与样品胶相同，样品中的各组分就在浓缩胶中浓缩，按照迁移率的不同，在浓缩胶和分离胶的界面上压缩成层。分离胶在pH8.8~8.9的Tris-HCl缓冲液聚合而成的小孔径凝胶，凝胶的孔径根据欲分离组分的大小通过丙烯酰胺的浓度进行调节，样品中各组分在分离胶中进行分离。

在酶或其他蛋白质、核酸等进行不连续凝胶电泳时，采用阴离子电泳系统（采用pH8~9的电极缓冲液，组分带负电荷）。将制备好的多层凝胶置于电泳系统中，用pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液作为电极缓冲液进行电泳，样品中各组分在浓缩胶中浓缩成狭窄的高浓度样品层。这是由于在各层凝胶中都含有HCl，HCl的离解度大，几乎全部成为Cl-，Cl-在电场中移动速度最快，称为快离子；在电泳槽中含有甘氨酸，在样品胶和浓缩胶中pH为6.7~6.8，甘氨酸只有0.1%~1%离解为负离子，在电场中移动速度最慢，称为慢离子；而蛋白质或核酸的移动速度介乎快离子和慢离子之间。接通电源电泳开始后，Cl-快速移动，走在最前面，在其后面形成一个离子浓度较低的低电导区，低电导产生较高的电位梯度，这种电位梯度促使蛋白质等组分和慢离子在快离子后面加速移动，致使蛋白质等组分在快、慢离子之间浓缩成一狭窄的中间层。 当这一浓缩层的样品层进入分离胶的时候，由于分离胶的pH为9.5（配制分离胶时，pH为8.8~8.9，在电泳过程中，实测结果为9.5），使甘氨酸的解离度增加，泳动速度加快，很快超过所有的蛋白质等组分，高电位梯度消失，使蛋白质等组分在均一的电位梯度下进行电泳分离，加上分离胶的孔径较小，各组分因分子大小和形状不同受到分子筛效应，使某些静电荷相同的组分也可以得到分离。

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8、为什么SDS-凝胶电泳会不受蛋白质分子所带电荷及分子形状的影响？

答：SDS-凝胶电泳不受蛋白质分子所带电荷及分子形状的影响，其原因在于蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质分子的氢键、疏水键打开，并与蛋白质分子结合，形成蛋白质-SDS复合物。在一定的条件下，1.4gSDS与1g蛋白质结合，由于SDS带负电荷，使各种蛋白质-SDS复合物带上相同密度的负电荷，而掩盖了不同蛋白质之间原来电荷的差别。此外SDS与蛋白质结合后，引起蛋白质构象的变化，在水溶液中都变成长椭圆形，椭圆的短轴长度均为18?左右，长轴的长度则与蛋白质的相对分子质量成正比。为此，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷及分子形状的影响，而只决定于蛋白质的相对分子质量。

第六章 酶、细胞、原生质体固定化

名词解释 1、固定化酶 2、固定化细胞 3、固定化原生质体 4、吸附法 5、包埋法 6、结合法 7、交联法 二、填空题

1、固定化酶是固定在载体上并在一定的空间范围内进行的催化反应 酶。

2、固定化细胞是固定在载体上并在一定的空间范围内进行的 生命活动 细胞。

3、固定化原生质体是固定在载体上并在一定的空间范围内进行的新陈代谢原生质体。

4、用带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH高，用带正电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH低 ，用不带电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH与游离酶的最适pH相同 。

5、酶催化反应的产物为酸性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适pH高 ，产物为碱性时，固定化酶的最适pH比游离酶的最适pH低 ，产物为中性时，最适pH不改变。

6、酶电极是由固定化酶 与各种电极 密切结合的传感装置。 三、选择题

1、用带负电荷的载体制备的固定化酶后，酶的最适pH（A）。 A、向碱性一侧移动 B、向酸性一侧移动C、不改变D、不确定 2、氨基酰化酶可以催化（C）。

A、D，L-氨基酸生成D-氨基酸和L-氨基酸B、D,L-乙酰氨基酸水解生成D,L-氨基酸 C、L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸D、D-乙酰氨基酸水解生成D-氨基酸 3、酶催化反应的产物为碱性时，固定化酶的最适pH（B）

A、比游离酶的最适pH高一些B、比游离酶的最适pH低一些C、与游离酶的最适pH相同D、随机变化 4、制备酵母原生质体时主要采用（D）

A、溶菌酶B、果胶酶C、B-1，4葡聚糖酶D、B-1，3葡聚糖酶 四、判断题

（V）1、包埋法可以用于酶、细胞和原生质体的固定化。

（X）2、固定化原生质体由于细胞内的结构完整，可以保持细胞原有的生命活动能力。 （V）3、延胡索酸是催化延胡索酸水合反应的酶。

（X）4、采用共价结合法制备得到的固定化细胞具有很好的稳定性。 五、简答题

1、简述常用的固定方法及其应用范围。

1、答：固定化方法主要有吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等。 （1） 吸附法

利用各种固体吸附剂将酶或细胞吸附在其表面上，而使酶或者细胞固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。 吸附法常用的固定吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。

吸附法具有操作简便，条件温和，载体廉价易得，而且可以反复使用，但由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶或与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。

吸附法可以用于制备固定化酶或固定化细胞。 （2）、包埋法

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将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，制备固定化酶、固定化细胞或者固定化原生质体的方法称为包埋法。 包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。

?凝胶包埋法：凝胶包埋法是将酶、细胞或原生质体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶、固定化细胞或固定化原生质体的方法。

常用的凝胶由琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。天然凝胶在包埋时条件温和，操作简便，对酶、细胞或原生质体的影响甚少，但强度较差。而合成凝胶的强度高，对温度，pH变化的耐受性强，但需要在一定的条件下进行聚合反应，才能把酶、细胞或原生质体包埋起来，在聚合反应过程中应严格控制好条件。

?半透膜包埋法：半透膜包埋法是将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶的方法。

常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。半透膜的孔径为几埃至几十埃，比一般酶分子的直径小些，固定化酶不会从小球中漏出来，但只有小于半透膜孔径的小分子底物和小分子产物可以自由通过半透膜，而大于半透膜孔径的大分子底物或大分子产物却无法进出，故此，半透膜包埋法适用于底物和产物都是小分子物质的酶的固定化。

包埋法可以用于制备固定化酶、固定化细胞和固定化原生质体。 （3）结合法

选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。 根据酶与载体结合的化学键不同，结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。

?离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。

用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便，只需在一定的pH、温度和离子强度等条件下，将酶液与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱就可使酶结合在离子交换剂上，制备得到固定化酶。

?共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。

共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。

要使载体与酶形成共价键必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。

用共价键结合法制备的固定化酶，结合很牢固，酶不会脱落，可以连续使用较长时间，但载体活化的操作复杂比较麻烦，同时由于共价结合时可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。现在已有活化载体的商品出售，如溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B，活化羧基琼脂糖凝胶4B等，在实际应用时可免去载体活化的步骤而很简单地制备固定化酶。

结合法只适用于固定化酶（包括固定化菌体）的制备。 （4）交联法

借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。 交联法常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。

交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用，但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体颗粒较小，给使用带来不便。

交联法只适用于固定化酶（包括固定化菌体）的制备。 （5）、热处理法

将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化含酶菌体。

热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活，热处理也可与交联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。

热处理法只适用于固定化含酶菌体的制备。

2、何谓固定化酶？固定化酶的特性与游离酶的比较有哪些改变？

2、答：固定化酶是指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。

固定化酶既保持了酶的催化功能，又克服了游离酶的不足之处，具有提高酶的催化效率，增强稳定性，可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著优点。

固定化酶与游离酶比较，其催化特性主要有下列变化：

（1）固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好，主要表现在：对热稳定性提高，可以耐受较高的温度；保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长时间；对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解；对变性剂耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂 的作用下，仍可保留较高的酶活力等。

（2）固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大，但也有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有较明显的变化。

（3）酶经过固定化后，其作用的最适pH往往会发生一些变化。

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（4）固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。对于那些作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显改变。而对于那些可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶而言，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。 3、举例说明固定化酶在工业生产上的应用。

答：固定化酶已在工业化生产中广泛应用，例如，氨基酰化酶是世界上第一种用于工业生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。 4、何为固定化细胞？固定化细胞有何特点及应用？

4、答：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。

固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以又称为固定化细胞或固定化增殖细胞。 微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成固定化细胞。 （1）固定化微生物细胞具有下列显著特点：

①固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好。

②固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系、辅酶系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制。

③发酵稳定性好，可以反复使用或者连续是使用较长的一段时间。例如，用海藻酸钙凝胶包埋法制备的黑曲霉细胞，用于生产糖化酶可以连续使用一个月。

④固定化微生物细胞密度提高，可以提高产率。如海藻酸钙凝胶固定化黑曲霉细胞生产糖化酶，产率提高30%以上。用中空纤维固定化大肠杆菌生产β-酰胺酶。，产率提高20倍。 ⑤提高工程菌的质粒稳定性。 （2）、固定化微生物细胞主要用于发酵生产各种胞外产物和制造微生物电极，现简介如下：①利用固定化微生物生产各种产物：固定化微生物细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以利用固定化细胞可以如同游离细胞那样发酵生产酒精酒类、氨基酸、有机酸、酶、辅酶、有机酸和抗生素各种代谢物。

②利用固定化微生物细胞制造为生物传感器：微生物传感器是由固定化微生物细胞与各种能量转换器密切结合而成的传感装置。

微生物传感器已成功地用于测定可发酵性糖、葡萄糖、甲酸、乙酸、头孢霉素、谷氨酸、氨、硝酸盐、生化需氧量（BOD）、细胞数量等。

5、简述固定化原生质体的制备方法与特点。

答：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体称为固定化原生质体。 （1）固定化原生质体的制备

包括原生质体的制备和原生质体固定化两个阶段。

①原生质体的制备：一般来说，原生质体的制备过程是首先将对数生长期的细胞收集起来，悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中；然后加入适宜的细胞壁水解酶，在一定的条件下作用一段时间，使细胞壁破坏；分离除去细胞壁碎片、未破坏的细胞以及细胞壁水解酶，而得到球状原生质体。

②原生质体固定化：原生质体固定化：原生质体制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用凝胶包埋法制成固定化原生质体。

（2）、固定化原生质体具有下列显著特点：

①由于没有细胞壁，细胞结构不完整，失去增殖能力，但是由于细胞膜内的结构完整，保持了细胞原有的新陈代谢特性。

②固定化原生质体由于解除了细胞壁这一扩散屏障，可增加细胞膜的通透性，有利于氧气和营养物质的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可显著提高产率。

③固定化原生质体由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用和连续使用较长时间，利于连续化生产，在4?C保存较长时间后仍能保持其生产能力。

④固定化原生质体易于何发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。

⑤固定化原生质体发酵的培养基中需要添加渗透压稳定剂，以保存原生质体的稳定性。这些渗透压稳定剂在发酵结束后，可用层析或膜分离技术等方法与产物分离。 六、综合分析题

1、试分析固定化酶与固定原生质体有哪些异同点？ 1、答：固定化酶与固定化细胞有下列相同点：

（1）固定化酶与固定化细胞由载体固定在一定的空间范围内。

（2）固定化酶与固定化细胞都可以通过包埋法和吸附法进行固定化。

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（3）固定化酶与固定化细胞都由于有载体的保护作用，稳定性显著提高。 （4）固定化酶与固定化细胞都可以反复使用或连续使用一段很长的时间。 固定化酶与固定化细胞有下列不同之处：

(一) 目的不同：固定化酶用于催化各种生物化学反应，而固定化细胞用于胞外酶等胞外产物的生产。

(二) 固定化方法有所差别：固定化酶可以采用结合法和交联法进行固定化，而固定化细胞不能采用结合法和交联法进行

固定化。

(三) 变化情况不同：固定化细胞可以在一定条件下生长繁殖，细胞越来越多，而固定化酶却随着时间的延长，逐步失活，

酶活力越来越低。

2、答：固定化细胞与固定化原生质体有下列相同点：

（1）固定化细胞与固定化原生质体由载体固定在一定的空间范围内。 （2）固定化细胞与固定化原生质体都可以通过包埋法进行固定化。

（3）固定化酶与固定化细胞都由于有载体的保护作用，稳定性显著提高。

（4）固定化细胞与固定化原生质体都可以反复使用或连续使用一段较长的时间。 固定化酶与固定化细胞有下列不同之处：

1）固定化细胞可以进行正常的生长繁殖和新陈代谢，而固定化原生质体不能增殖，但可以进行正常的新陈代谢。 2）固定化细胞用于胞外酶等保外产物的生产，而固定化原生质体用于胞内酶等保内物质的生产。

3）变化情况不同：固定化原生质体只能采用包埋法进行固定化，而固定化细胞除了包埋法，还可采用吸附法进行固定化。 4）固定化原生质体由于没有细胞壁，培养基中需要添加渗透压稳定剂，而固定化细胞不用添加。

5）固定化原生质体在发酵过程中共，需要添加青霉素等物质以抑制细胞壁的再生，而固定化细胞不用添加。

第七章 酶非水相催化

名词解释 酶非水相催化

有机介质中的酶催化 微水介质体系 水活度

对映体选择性 手性化合物 二、填空题

1、与在水介质中相比，酶在有机介质中的稳定性提高，催化活性降低。

2、非水介质主要包括有机介质，气相介质，超临界流体介质，离子液介质 。 3、有机溶剂的极性系数lgP越小，表明其极性越强 ，对酶活性的影响越大。 4、化学组成相同，立体结构互为对映体的两种异构体化合物称为手性化合物 。 5、脂肪酶可以催化油脂与甲醇进行 转脂 反应，生成生物柴油。 三、选择题

1、必需水是指（D ）

A、维持酶催化反应速度所必需的水量B、酶催化反应速度达到最大时所需的水量 C、与酶分子紧密结合的水量D、维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量 2、有机介质中酶催化的最适水含量是（C）

A、酶溶解度达到最大时的含水量B、底物溶解度最大时的含水量 C、酶催化反应速度达到最大时的含水量D、酶活力到最大时的含水量 3、有机溶剂极性的强弱可以用极性系数lgP表示，极性系数越大，（D）。

A、表明其极性越强，对酶活性的影响就越大B、表明其极性越强，对酶活性的影响就越小 C、表明其极性越弱，对酶活性的影响就越大D、表明其极性越弱，对酶活性的影响就越小 4、天苯肽是由（A）缩合而成。

A、L-天冬氨酸的a-羧基与L-苯丙氨酸甲酯的氨基B、L-天冬氨酸的B-羧基与L-苯丙氨酸甲酯的氨基 C、L-天冬氨酸的氨基与L-苯丙氨酸的a-羧基 D、L-天冬氨酸的a-羧基与L-苯丙氨酸的氨基 四、判断题

（V ）1、有机溶剂的极性系数是指某种溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数 （X）2、在有机介质反应体系中，水活度越大，酶催化反应速度也越大。

（V）3、酶在水溶液中催化的立体选择性通常比在有机介质中催化的立体选择性强。 （X）4、酶在有机介质中催化的最适pH与在水溶液中催化的最适pH有较大差别。 五、简答题

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1、酶在非水相中有哪些特点？

答：酶在非水介质中催化与在水相中催化相比，具有下列显著特点： （1）酶的热稳定性提高。 （2）酶的催化活性有所降低。

（3）水解酶可以在非水介质中催化水解反应的逆反应。 （4）非极性底物或者产物的溶解度增加。 （5）酶的底物特异性和选择性有所改变

2、酶在有机介质中与在水溶液中的特性有何改变？

答：酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别；对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而影响酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、间选择性和热稳定性等，而显示出与水相介质中不同的催化特性。

（1）底物专一性：在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。

（2）对映体选择性：酶在有机介质中催化，与在溶液中催化比较，由于介质的特性发生改变，而引起酶的对映体选择性也发生改变。

一般来说，酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中，酶的立体选择性较差。

（3）区域选择性：酶在进行催化反应时具有区域选择性，即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。 一般说来，酶在水溶液中的区域选择性比在有机介质中的区域选择性较强，在不同的有机介质中酶的区域选择性也有所不同。

（4）键选择性：酶在有机介质中进行催化时具有键选择性。即在同一个底物分子中有2种以上的化学键都可以与酶反应时，酶对其中一种化学键优先进行反应。

键选择性与酶的来源和有机介质的种类有关。在不同的有机介质中，酶的也有所不同。 （5）热稳定性：许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好。 3、什么是必需水和水活度？它们对非水相中酶的催化有何影响？

答：维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水。必须水势维持酶分子结构中氢键、盐键等副键所必需的，氢键和盐键是酶空间结构的主要稳定因素，酶分子一旦失去必需水，就必将使其空间构象破坏而失去其催化功能。

水活度（water activity, Aw）是指体系中水的逸度与纯水逸度之比。通常可以用体系中水的蒸汽分压（P）与相同条件下纯水的蒸汽压（Po）之比表示。 A w=P/ Po

在体系的水活度较低的条件下，酶的催化反应速度随水含量的增加而升高，在体系的水含量达到某一点时，催化反应速度达到最大，此时的水含量称为最适水含量；超过最适水含量，催化反应速度又降低。 5、简述有机介质中酶催化反应的影响因素及其控制。

答：酶在有机介质中的各种催化反应受到各种因素的影响。主要的有：酶的种类和浓度、底物的种类和浓度、有机溶剂的极性与含量、水含量、温度、pH和离子强度等。为了提高酶在有机介质中的催化效率和选择性，必须控制好各种条件并根据情况变化加以要的调节控制。

（1）酶的种类与浓度：要进行酶在有机介质中的催化反应，首先要选择好所使用的酶。不同的酶具有不同的结构和特性，同一种酶，由于来源的不同和处理方法（如纯度、冻干条件、固定化载体和固定化方法、修饰方法和修饰剂等）的不同，其特性也有所差别，所以要根据需要通过实验进行选择。

在酶催化反应时，通常酶催化反应速度随着酶浓度的升高而升高，但是所用的酶浓度升高意味着成本的增加，故此，酶浓度必须控制在适宜的范围。

在有机介质中进行催化反应，对酶的选择不但要看催化反应的速度的大小，还要特别注意酶的稳定性、底物专一性、对映体选择性、区域选择性、键选择性等。

（2）底物的种类和浓度：由于酶在有机介质中的底物专一性与在水溶液中的专一性有些差别，所以要根据酶在所使用的有机介质中的专一性选择适宜的底物。

底物的浓度对酶催化反应速度有显著影响，一般说来，在底物浓度较低的情况下，酶催化反应速度随底物浓度的升高而增大，在使用时，底物浓度必须控制在较高的浓度范围，以提高酶的反应速度。

酶在有机介质中进行催化：要考虑底物在有机溶剂和必需水层中的分配情况。疏水性强的底物虽然在有机溶剂中的溶解度大，浓度高，但难于从有机溶剂中进入必需水层，与酶分子活性中心结合的底物浓度较低，而降低酶的催化速度；如果底物亲水性强，在有机溶剂中的溶解度低，也使催化速度减慢。所以应该根据底物的极性，结合有机溶剂的选择，控制好底物的浓度。

有些底物在高浓度时，会对反应产生不利影响，即产生高浓度底物对酶反应的抑制作用，要采用适宜的方法，使底物浓度持续维持在一定的浓度范围内。

（3）有机溶剂的极性和含量：不同的有机溶剂由于极性不同，对酶分子的结构以及底物和产物的分配有不同的影响，从而影响酶催化反应速度，同时还会影响的底物专一性、对映体选择性、区域选择性和键选择性等。

有机溶剂的极性选择要适当，极性过强（lgP<2）的溶剂，会夺取较多的酶分子表面结合水，影响酶分子的结构，并使疏水性底物的溶解度降低，从而降低酶反应速度，在一般情况下不选用；极性过弱（lgP≥5）的溶剂，虽然对酶分子必需水的夺取较少，疏水性底物在有机溶剂总的溶解度也较高，但是底物难于进入酶分子的必需水层，催化反应速度也不高，所以通常选用2≤lgP≤5的溶剂作为催化反应介质。

在与水混溶的有机介质中，有机溶剂的含量对酶的催化作用也有显著影响，必须控制好有机溶剂的含量。

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（4）水含量：有机介质中，水的含量对酶分子的空间构象和酶催化反应速度有显著影响。在酶、有机溶剂和其他反应条件不变的情况下，水含量低时，反应速度达到最适水含量时，酶催化反应速度达到最大；超过最适水含量，反应速度又降低。

最适水含量与溶剂的极性有关，通常随溶剂极性的增大，最适水含量也增大。

（5）温度：在微水有机介质中，由于水含量低，酶的热稳定性增强，所以其最适温度高于在水溶液中催化的最适温度。但是温度过高，同样会使酶的催化活性降低，甚至引起酶的变性失活。

要注意的是酶与其他非酶催化剂一样，温度升高时，其立体选择性降低，这一点在有机介质的酶催化过程中显得特别重要，因为手性化合物的拆分是有机介质酶催化的主要应用领域。必须通过试验，控制适宜的反应温度，使酶催化反应在较高的反应速度以及较强的立体选择性条件下进行。

（6）pH：在水介质中，缓冲液的pH决定了酶分子活性中心基团的解离状态和底物分子的解离状态，从而影响酶与底物的结合和催化反应。而在有机介质反应中，酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH相同。当酶分子从水溶液转移到有机介质时，酶分子保留了原有的pH印记，原有的解离状态保持不变。 6、举例说明酶非水催化的应用。

答：酶在非水介质中可以催化多种反应，通过酶的催化作用，可以生成一些具有特殊性质与功能的产物，在医药、食品化工、功能材料、环境保护等领域具有重要的应用价值，显示出广阔的应用前景。

（1）手性药物的拆分：有机介质中酶催化反应在手性药物拆分的研究、开发具有广阔的前景，例如，用猪胰脂肪酶（PPL）等在有机介质体系中对2,3-环氧丙醇丁酸酯进行拆分，得到单一的对映体。可以用于合成β-受体阻断剂、艾滋病毒（HIV）蛋白酶抑制剂、抗病毒药物等多种手性药物，用脂肪酶在有机介质体系中进行布洛芬、酮基布洛芬、萘普生等消旋体的拆分，可以得到S-构型的活性成分。

（2）手性高分子聚合物的制备：利用脂肪酶等水解酶在有机介质中的催化作用，可以合成多种具有手性的聚合物，用作可生物降解的高分子材料、手性物质吸附剂等，例如，猪胰脂肪酶在甲苯介质中，催化己二酸氯乙酯与2,4-戊二醇反应，聚合生成可生物降解的聚酯和糖酯等。

（3）酚树脂的合成：辣根过氧化物酶在二氧六环与水混溶的均一介质体系中，可以催化苯酚等酚类物质聚合，生成酚类聚合物。

（4）导电有机聚合物的合成：辣根过氧化物酶可以在与水混溶的有机介质中（如，丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催化苯胺聚合生成具有导电性能的聚苯胺。

（5）发光有机聚合物的合成：辣根过氧化物酶在有机介质中可以催化对苯基苯酚合成聚对苯基苯酚，将这种聚合物制成二极管，可以发出蓝光，是一种具有良好前景的蓝光发射材料。

（6）食品添加剂的生产：利用酶在有机介质中的催化作用，可以获得人们所需的食品添加剂，例如，利用脂肪酶的作用，将甘油三酯水解生成甘油二酯和甘油单酯，其中甘油单酯是一种广泛应用的食品乳化剂；通过嗜热菌蛋白酶在有机介质中催化L-天冬氨酸与L-苯丙丙氨酸甲酯反应生成一种用途广泛的食品甜味剂-----天苯肽；利用芳香醛脱氢酶生产香兰素等。

（7）生物柴油的生产：在有机介质中，脂肪酶可以催化油脂与甲醇的酯交换反应，生成生物柴油。

（8）多肽的合成：蛋白酶、脂肪酶等在有机介质中可以合成各种多肽，例如，利用α-胰蛋白酶催化N-酰色氨酸与亮氨酸合成二肽；利用嗜热菌蛋白酶合成天苯肽、天苯二肽；利用脂肪酶合成青霉素前体肽等。

（9甾体转化：5β-羟基化酶，11β-羟基化酶,17羟基化酶等在由有机溶剂和水组成的两项系统中，可以催化甾体转化，并可大大提高甾体转化率。

第八章 酶定向进化

名词解释 定向进化 酶定向进化 易错PCR技术 DNA重排技术 基因家族重排技术 酶突变基因的定向选择 噬菌体表面展示技术 细胞表面展示技术 二、填空题

1、定向进化按照进化对象的不同，可以分为分子定向进化，细胞定向进化 。

2、酶定向进化是在体外进行酶基因的 人工随机突变 ，然后在人工控制条件的特殊环境下进行定向选择，而得到具有优良催化特性的酶的突变体。

3、易错PCR技术是从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行的聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现剪辑配对错误，而引起基因突变的技术过程。

4、DNA重排技术将2种以上同源基因中的正突变结合在一起，通过DNA的碱基序列的重新排布，形成新的突变基因，属于有性进化。

5、要从突变基因文库中筛选得到人们所需的正突变基因，筛选工作量很大，必需采用各种高通量筛选技术 。

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6、插入B-半乳糖苷酶基因片段的噬菌体DNA，转染大肠杆菌细胞后，在含有诱导酶异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和底物X-gal的平板培养基上可以形成蓝色 细菌斑。 三、选择题

1、在获得酶的单一基因以后，可以采用（A）技术获得两种以上同源正突变基因。 A、易错PCR B、交错延伸PCR C、DNA重排D、基因组重排 2、在进行易错PCR时，提高镁离子浓度的作用是（B。

A、稳定互补的碱基对B、稳定非互补的碱基对C、增强酶的稳定性D、减弱酶的稳定性 3、在进行易错PCR时，添加一定浓度的锰离子，其作用是（A）。

A、降低DNA聚合酶对模板的特异性B、提高DNA聚合酶对模板的特异性C、增强DNA聚合酶的稳定性D、提高DNA聚合酶的活力

4、采用核糖体表面展示技术，由于（C），可以形成目的蛋白-核糖体m-RNA三聚体展示在核糖体表面。 A、目的蛋白基因在体外进行转录和翻译B、核糖体表面有目的蛋白的结合位点

C、转录得到的mRNA的3’末端缺失终止密码子D、核糖体可以识别mRNA和目的蛋白 四、判断题

(X)1、外源蛋白基因可以与噬菌体的外膜结构蛋白基因形成融合蛋白基因，在噬菌体表面展示 （V）2、重组质粒载体可以通过细胞转化方法将重组DNA转入受体细胞

（X）3、通过DNA重排技术进行酶基因的体外随机突变，可以获得大量的正突变基因。

（V）4、基因家族重排技术需要经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变。 五、简答题

1、何谓酶定向进化？有何特点？

答：酶定向进化又称为酶分子定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。 酶定向进化具有适应面广，目的性强和效果显著等特点。

（1）适应面广：而酶定向进化不需要事先了解酶的结构、催化作用机制等有关信息，就可以通过易错PCR、DNA重排、基因家族重排等技术，在体外人为地进行基因的随机突变，短时间内可以获得大量不同的突变基因，建立突变基因文库，然后通过各种高通量筛选技术从突变基因文库中筛选得到人们所需的突变基因，从而获得具有新催化特性的酶突变体。所以酶定向进化技术可以广泛应用于各种蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）的改性。

（2）目的性强：酶定向进化是根据应用过程中酶呈现出的酶催化效率较低，稳定性较差等弱点，经过基因体外随机突变，在人工控制条件的特殊环境下进行定向选择而获得所需的进化酶，进化方向明确，具有很强的目的性。

（3）效果显著：通过酶定向进化，可以在几年、几个月甚至更短的时间内完成自然界需要几万年、几十万年甚至几百万年才能完成的进化历程，效果非常显著。

2、简述易错PCR技术与常规PCR技术的异同点。

答：易错PCR技术是从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链反应（PCR），使扩增得到的基因出现碱基配对错误，而引起基因突变的技术过程。

易错PCR技术与常规PCR技术有很多相同之处，都是用DNA聚合酶为催化剂，使用四种脱氧核苷三磷酸为底物，都要添加镁离子，其操作过程也相同，都经过双链DNA的变性、引物与单链DNA退火结合、引物延伸三个步骤。 （1）双链DNA的变性（解链）：将待扩增的模板DNA升温至85~95℃，使DNA双链之间的氢键断开，解离为单链DNA。

（2）引物与单链DNA退火结合：单链DNA在温度逐步降低至50~70℃时，会与其碱基互补的引物结合形成双链，引物是经过设计后人工合成的与模板DNA某一片段互补的寡核苷酸链，长度为15~30个碱基。

（3）引物延伸：引物结合后，将温度升高至70~75℃，在DNA聚合酶的作用下，以引物为起点，以四种脱氧核苷三磷酸为底物，以目标DNA链为模板，按照碱基配对原则，由5′-端向3′-端的方向延伸，而进行DNA复制。以上三个步骤反复进行，一般经过30次循环，即可使目的基因扩增几百万倍。

易错PCR技术与常规PCR技术的主要不同点在于反应条件有所不同。

（1）在易错PCR中镁离子浓度较高：常规PCR扩增时，镁离子浓度为0.5~2.5mmol/L，进行易错PCR时，在原有基础上提高镁离子的浓度，以稳定非互补的碱基对。

（2）在易错PCR中可以添加一定浓度的锰离子，以降低聚合酶对模板的特异性，而常规PCR不用添加锰离子。 （3）在易错PCR中四种底物（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）的浓度比改版，即采用浓度不平衡的各种底物，是DNA聚合酶在催化基因扩增时，碱基配对错误的出现频率增加，而容易引起基因突变。 3、什么叫DNA重排技术？其主要过程包括哪些步骤？

答：DNA重排技术又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重排排布而引起基因突变的技术过程。 DNA重排技术的主要过程如下：

（1）将两条或多条正突变基因通过DNa-sel等酶的作用，随机切割成若干DNA片段。 （2）将这些随机片段在不加引物的条件下经过多次PCR循环，使这些DNA随机片段互为模板和引物进行扩增、延伸，获得众多的突变基因。加入适宜的引物进行PCR反应，使上述突变基因进行扩增，以便进行突变基因的定向选择。

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4、什么是基因家族重排技术？它与DNA重排技术有何异同？

答：基因家族重排又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源基因出发，用酶（DNasel）切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。

基因家族重排技术与DNA重排技术的基本过程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物PCR等步骤以获得突变基因，然后经过构建突变基因文库，采用高通量筛选技术筛选获得正突变基因。

基因家族重排技术与DNA重排技术的主要不同点在于前者从基因家族的若干同源基因出发进行DNA序列的重新排布，而后者采用易错PCR等技术获得的两个以上的正突变基因出发进行DNA序列的重新排布。 5、简述突变基因定向选择的基本过程。 答：突变基因的定向选择的基本过程如下：

（1）通过DNA重组技术将随机突变获得的各种突变基因与适宜的载体进行重组，获得重组载体。

（2）通过细胞转化等方法将重组载体转入适宜的细胞或进行体外包装成为有感染活性的重组γ-噬菌体，形成突变基因文库。

（3）采用各种高通量的筛选技术，在人工控制条件的特定环境中对突变基因进行筛选，从突变基因文库中筛选得到所需的突变基因。

6、突变基因的高通量筛选技术主要有哪些？各有何特点？

答：从突变基因文库中筛选目的基因的高通量是筛选技术有多种，常用的有平板筛选法、荧光筛选法、噬菌体表面展示法、核糖体表面展示法等。

平板筛选是将含有随机突变基因的重组细胞，涂布在平板培养基上，在一定条件下培养，依据重组菌细胞的表型检定出有效突变基因的筛选方法。平板筛选具有简便、快速、直观、容易控制和调整环境条件等特点。

荧光筛选法是通过荧光产生与否以及荧光的强度情况进行突变基因筛选的方法。荧光筛选法具有直观、明确、容易判断等特点，但是需要利用具有荧光激发特性物质的基因作为报告基因。

噬菌体表面展示技术是利用丝状噬菌体的外膜结构蛋白与某些特定的外源蛋白或多肽分子形成稳定的复合物，使目标外源蛋白质或多肽富集在噬菌体表面的一种分子展示技术。噬菌体表面展示技术通量大，效率高，有效基因通过噬菌体表面展示进行富集，需要构建外源基因与噬菌体外膜蛋白基因的融合基因。

细胞表面展示法是通过可以锚在细胞表面的特定蛋白质与外源蛋白质形成融合蛋白，使外源蛋白质富集在细胞表面的一种分子展示技术。细胞表面展示法主要包括酵母细胞表面展示法和细菌细胞表面展示法等。细胞表面展示法通量大，效率高，有效基因通过细胞表面展示进行富集，需要构建外源基因与凝集素蛋白，絮凝素蛋白或者外膜蛋白基因的融合基因。

核糖体表面展示法是一种在体外筛选和展示功能蛋白的方法。

核糖体表面展示法具有通量大，筛选效率高，目的蛋白基因在体外进行转录和翻译，有效基因通过核糖体表面展示进行富集等特点。但需要对目的基因进行加工与修饰，使其体外翻译时能够形成目的蛋白-核糖体-mRNA三聚体。 7、举例说明酶定向进化技术的应用。

答：酶定向进化技术主要用于提高酶的催化效率、增强酶的稳定性、改变酶的底物特异性等方面。

通过酶定向进化可以显著提高酶的催化效率。1993年，陈（Chen, KQ）等人通过易错PCR技术进行定向进化研究，使枯草杆菌蛋白酶在60%的N,N-二甲基甲酰胺进行非水相催化的催化效率提高157倍。显著提高了该酶对有机溶剂的耐受性，大大提高该酶在非水相介质中的催化能力。

通过酶定向进化可以显著增加酶的稳定性。例如，上述枯草杆菌蛋白酶E通过定向进化，明显提高其热稳定性，其最适作用温度提高17℃，在65℃的半衰期延长50~200倍。

通过酶定向进行可以改变酶催化作用的底物特异性，使酶对某种底物热异性提高或者降低，甚至呈现出另一种酶的催化活性。例如，2004年，阿哈若尼（Aharoni A）等人用基因家族重排技术进行定向进化，使大肠杆菌磷酸酶对有机磷酸酯的特异性提高2000倍。

第九章 酶反应器

名词解释 酶反应器

搅拌罐式反应器 填充床式反应器 流化床式反应器 鼓泡式反应器 膜反应器 喷射式反应器 二、填空题

1、搅拌罐式反应器主要由反应罐，搅拌器 和温度调节装置组成。 2、填充床式反应器是通过底物溶液的流动，实现物质的传递和混合。 3、鼓泡式反应器是有气体参与的酶催化反应中常用的一种反应器。

4、膜反应器是将酶的催化反应 与半透膜的分离作用 组合在一起而成的反应器。

喷射式反应器是利用高压蒸汽 的喷射作用，实现酶与底物的混合，进行高温短时 催化反应的一种反应器。

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三、选择题 1、流化床反应器（D）。A、适用于游离酶进行间歇催化反应B、适用于固定化酶进行间歇催化反应 C、适用于游离酶进行连续催化反应D、适用于固定化酶进行连续催化反应 2、膜反应器是（A）的酶反应器

A、将酶催化反应与膜分离组合在一起B、利用酶膜进行反应C、利用半透膜进行底物与产物分离D、利用半透膜进行酶与产物分离

3、对于有产物抑制作用的酶，最好选用（C）反应器A、搅拌罐式B、喷射式C、膜反应器D、鼓泡式 4、对于有气体参与反应的酶，通常采用（C）反应器A、填充床式B、流化床C、鼓泡式D、搅拌罐式 四、判断题

（X）1、填充床式在任何一个横截面上的流体流动速度都相同，在同一个横截面上底物浓度与产物浓度也一致，又称为活塞流反应器。

（X）2、需要小分子物质作为辅酶的酶催化反应，通常采用膜反应器。 （V）3、鼓泡式固定化酶反应器又称为三相流化床式反应器。

（V）4、采用膜反应器进行酶催化反应，可以明显降低小分子产物对酶的反馈抑制作用。 五、简答题

1、简述酶反应器的主要类型和特点。

答：酶反应器多种多样，依据其结构的不同，有搅拌罐式反应器、填充床反应器、流化床反应器、鼓泡式反应器、膜反应器、喷射式反应器等。

搅拌罐式反应器是带有搅拌装置的一种罐式反应器，由反应罐，搅拌器和保温装置组成。搅拌式反应器结构简单、操作简便、反应条件的调节、控制较容易，底物与固定化酶接触较好、传质阻力较低、反应器的利用效率较高，是一种常用的固定化酶反应器。

填充床反应器中的固定化酶堆叠在一起，固定不动，底物溶液按照以定的方向以一定的速度流过反应床，通过底物溶液的流动，实现物质的传递和混合。填充床反应器的特点是设备简单，操作方便单位体积反应床的固定化酶密度大，可以提高酶催化反应的速度，在工业生产中普遍使用。

流化床反应器是一种使用于固定化酶进行连续催化反应的反应器，固定化酶颗粒置于反应容器内，底物溶液以一定速度连续地由下而上流过反应器，同时反应液连续地排出，固定化酶颗粒不断地悬浮翻动状态下进行催化反应。流化床反应器具有混合均匀，传质和传热效果好，温度和pH的调节控制比较容易，不易堵塞，对黏度较大反应液也可以进行催化反应等特点。

鼓泡式反应器是利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到提供反应底物和混合两种作用的一类反应器。鼓泡式反应器的结构简单，操作简单，剪切力小，物质与热量催化反应中常用的一种反应器。

膜反应器是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器，可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。膜反应器结构紧凑，集反应与分离于一体，利于连续化生产，但是经过较长时间使用，酶或其他杂质会被吸附在膜上，造成膜的透过性降低，而且清洗比较困难。

喷射式反应器是利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应的一种反应器。喷射式反应器结构简单、体积小，混合均匀，由于温度高，催化反应速度快，催化效率高，可在短时间内完成催化反应。适用于某些耐高温酶的反应。

2、选择酶反应器的主要依据有哪些？

答：酶反应器的选择是在了解酶反应器的各种类型和特点的基础上，主要依据酶的应个形式、酶的反应动力学性质、底物和产物的理化性质等几个方面进行。

（1）依据酶的应用形式选择反应器：酶的应用形式主要有游离酶和固定化酶，酶应用形式不同，其所使用的反应器亦不同。在应用游离酶进行催化反应时，酶与底物均溶解在反应溶液中，通过互相作用，进行催化反应，可以选用搅拌罐式反应器、鼓泡式反应器、喷射式反应器、膜反应器等。固定化酶具有稳定性较好，可以反复或连续使用的特点，应用固定化酶进行催化反应，可以选择填充床式反应器、流化床式反应器、鼓泡式反应器、膜反应器、搅拌器式反应器等。 （2）依据酶反应动力学性质选择反应器：在考虑酶反应动力学性质对反应器选择的影响方面，主要因素有酶与底物的混合程度、底物浓度对酶反应速度的影响、反应产物对酶的反馈抑制作用以及酶催化作用的温度条件等。

（3）依据底物或产物的理化性质选择反应器：酶的催化反应是在酶的催化作用下，将底物转化为产物的过程。在催化过程中，底物和产物的理化性质直接影响酶催化反应的速率，底物或产物的相对分子质量、溶解性、黏度等性质也对反应器的选择有重要影响。

3、简述酶反应器设计的主要内容。

答：酶反应器的设计主要包括反应器类型的确定，反应器制造材料的确定、热量衡算、物料衡算等内容。

（1）确定酶反应器的类型：酶反应器的设计，首先要根据酶、底物和产物的性质，按照酶反应器的选择原则，选择并确定反应器的类型。

（2）确定反应器的制造材料：由于酶催化反应具有条件温和的热点，通常都是在常温、常压、pH近乎中型的环境中进行反应，所以酶反应器的设计对制造材料没有什么特别要求，一般采用不锈钢制造反应容器即可。

（3）进行热量衡算：酶催化反应一般在30~70℃的常温条件下进行，热量衡算并不复杂，温度的调节控制也较为简单，

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通常采用一定温度的热水通过夹套（或列管）加热或冷却方式，进行温度的调节控制，热量衡算是根据热水的温度和使用量计算。

（4）进行物料衡算：物料衡算是酶反应器设计的重要任务，主要内容包括：

①酶反应动力学参数的确定：酶反应动力学参数是反应器设计的主要依据。在反应器设计之前，就应当根据酶反应动力学特性，确定反应所需的底物浓度、酶浓度、最适温度、最适pH、激活剂浓度等参数。

②计算底物用量：酶的催化作用是在酶的作用下，将底物转化为产物的过程，所以酶反应器的设计首先要根据产品产量的要求、产物转化率和收得率，计算所需的底物用量。

③计算反应液总体积：根据所需的底物用量和底物浓度，就可以计算得到反应液的总体积。 ④计算酶用量：根据催化反应所需的酶浓度和反应液体积，就可以计算所需的酶量。

⑤计算反应器数目：根据生产规模、生产条件等确定反应器的有效体积（Vo）和反应器的数目。 4、简述酶反应器的操作条件及其控制的主要内容。

答：酶反应器的操作条件及其控制主要包括温度、pH、底物浓度、酶浓度、反应液的混合与流动速度等的控制，并根据变化情况进行合理的调节。

（1）反应温度的确定与调节控制：在酶反应器的操作过程中，要根据酶的动力学特性，确定酶催化反应的最适温度，并将反应温度控制在适宜的温度范围内，在温度发生变化时，要及时进行调节。

（2）pH的确定与调节控制：在酶催化反应过程中，要根据酶的动力学特性确定酶催化反应最适pH，并将反应液的pH维持在适宜的pH范围内。

（3）底物浓度的确定与调节控制：底物浓度是决定酶催化反应速度的主要因素，在反应过程中要确定一个适宜的底物浓度，通常底物浓度应达到5~10Km。

（4）酶浓度的确定与调节控制：必须综合考虑反应速度和成本，确定一个适宜的酶浓度。

（5）搅拌速度的确定与调节控制：在搅拌罐式反应器和游离酶膜式反应器中，都设计安装有搅拌装置，通过适当的搅拌实现均匀的混合。要在实验的基础上确定适宜的搅拌速度，并根据情况的变化进行搅拌速度的调节。

（6）流动速度的确定与调节控制：在连续式酶反应器中，底物溶液连续地进入反应器，同时反应液连续地排出，通过溶液的流动实现酶于底物的混合和催化，在操作过程中必须确定适宜的流动速度和流动状态，并根据变化的情况进行适当的调节控制。

5、在酶反应器的操作过程中要注意哪些问题？

答：在酶反应器的操作过程中药特别注意控制好各种操作条件，同时注意保持酶反应器的操作稳定性，防止酶的变性失活和防止微生物的污染等。

（1）控制好各种操作条件：酶反应器的操作的首要任务是按照设计要求控制好温度、pH、底物浓度、酶浓度、反应液的混合于流动速度等操作条件，并根据变化情况进行合理的调节。

（2）保持酶反应器的操作稳定性：在酶反应器的操作过程中，应尽量保持操作的稳定性，以避免反应条件的激烈波动。以保持反应器恒定的生产能力。

①防止酶的变性失活：在酶反应器的操作过程，要特别注意温度、pH、重金属离子以及剪切力等因素引起酶的变性失活。 ②防止微生物的污染：酶反应器的操作必须符合必要的卫生条件，尤其是在生产药用或食用产品时，卫生条件要求较高，应尽量避免微生物的污染。

六、综合分析题。根据设计任务书的要求进行酶反应器的选型和物料衡算。

设计任务书，项目名称：年产一万吨葡萄糖车间糖化酶反应器的设计。设计要求： 产品质量：葡萄糖一万吨/年 产品质量：达到国家有关标准

原料：可溶性淀粉（淀粉经过a-淀粉酶液化而成） 淀粉葡萄糖转化率：95% 葡萄糖收得率：98% 糖化周期：48h 答：（1）工艺条件的确定：根据任务要求和糖化酶的反应动力学常数确定下列工艺条件：淀粉液浓度35%，糖化温度60℃，反应pH5.0，糖化时间48H。

（2）反应器的选型：由于底物相对分子质量较大，糖化酶的价格较低，所以本设计采用游离糖化酶为催化剂，选用分批搅拌罐式反应器。 （3）物料衡算

①原料用量：年产葡萄糖一万吨，每年生产天数为300天，即每天生产葡萄糖10000 /300=33.3吨。

根据设计要求，淀粉葡萄糖转化率95%，葡萄糖收得率98%，即每天需要淀粉33.3/(0.95*0.98)=35.8吨。 ②反应液体积：每天需要淀粉35.8吨，反应液中的淀粉浓度为35%，即每天所需反应液总体积为35.8/0.35=102m3=102000L。

③糖化酶用量：设定糖化酶与淀粉比例为0.01%，每天需要淀粉35.8吨，即每天需要糖化酶0.00358吨=3.58kg ④反应器数目：反应液体积为102m3，选用每个反应器的体积为20m3，反应器有效体积为80%，糖化时间为48小时，即需要反应器的数目为：N=102/(20*0.8)*48/24=12.75

取整数为13个，加上一个备用罐，选定反应器数目为14个。

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