动物生物化学实验教程正式

实验一 血清蛋白质含量测定

牛血清蛋白：BSA。

血浆：指血液的液体成分，淡黄色（因含胆红素）。含白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原。血液经抗凝处理、离心沉淀后，获得的液体部分。

血清：血液凝固后，释出的液体。不含纤维蛋白原及游离钙离子。

蛋白质定量分析是动物生物化学和其他生命科学研究中经常用到的实验项目。蛋白质是生物体内最为重要的生物大分子之一，其种类繁多、结构多样、功能各异，而且分子量相差很大，所以很难建立一个理想而通用的蛋白质定量分析方法。目前测定蛋白质含量的方法很多，常用的测定方法有Folin—酚法（Lowry法）、紫外吸收法、凯氏定氮法、考马斯亮蓝染料结合法等，每种方法在实践中都有其优点和局限性。本实验采用考马斯亮蓝染料结合法（Bradford法）。(灵敏度最高)

一、实验目的

1．掌握分光光度法测定的原理，分光光度计的结构和基本操作要点

（光源-单色器-样品室-检测器-显示器）

2．掌握考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量的原理和操作方法 3．掌握微量移液器的使用方法

4．了解蛋白质含量测定中标准曲线的制作方法

二、实验原理

染料考马斯亮蓝G-250（R250，结合后可以解离）在游离状态下呈红色，最大吸收峰为465 nm。它能与蛋白质的疏水微区结合，形成蓝色复合物，该复合物的最大吸收峰为595 nm，在一定浓度范围内（为什么在一定范围内），其吸光度值与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质含量的测定。

三、实验操作步骤

取两只干净的试管，按表1-1编号，并加入试剂，混匀。为什么空白管为0.9%NaCl？

表1-1 考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量

试管号

稀释的血清样品（mL） 0.9% NaCl 溶液（mL） 考马斯亮蓝G-250溶液（mL）

空白管

- 0.1 5

样品管 0.1 - 5

室温静置5 min，于波长595 nm处，以空白管调“0”，测定样品管的吸光度值，

查标准曲线，吸光度测定值所对应的蛋白质浓度就是稀释样品的蛋白质含量，然后乘以血清的稀释倍数（10倍），可得血清中蛋白质的含量。

四、实验试剂

1．考马斯亮蓝G-250溶液（0.01 %）：称取考马斯亮蓝G-250 100 mg，溶于50 mL 95 %乙醇中，再加入100 mL 85 % (W/V) 浓磷酸，然后用蒸馏水定容至1000 mL，置棕色瓶过夜（如有不容物，可用二层滤纸过滤）。

2．0.9 % NaCl 溶液：称取NaCl 9 g，加水溶解，定容至1000 mL。 3．稀释血清：用0.9 % NaCl 溶液，将新鲜血清稀释10倍。 4．考马斯亮蓝结合法测定蛋白质含量的标准曲线绘制

蛋白质标准液（1 mg/mL）：小牛血清白蛋白100 mg加生理盐水至100 mL。 取11支干净试管编号，按表1-2加入试剂，混匀，室温静置3 min，于波长595 nm处，以0号管调“0”，测定样品管的吸光度值。

表1-2 考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量的标准曲线绘制

编号 0

标准蛋白质溶液（μL） 0 0.9% NaCl 溶液（μL） 100 考马斯亮蓝G-250溶液（mL） 5

1 10 90 5

2 20 80 5

3 30 70 5

4 40 60 5

5 50 50 5

6 60 40 5

7 70 30 5

8 80 20 5

9 90 10 5

10 100 0 5

以各管的蛋白质浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。（表1-3）

表1-3 不同浓度标准蛋白质溶液对应的光密度值

管号 0 标准蛋白质溶液浓度（μg/mL） 0 光密度值

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

五、实验器材

分光光度计、试管、吸管、20-200 μL 量程微量移液器。

六、实验过程中应注意的问题

本法待测液 0.1 mL中含蛋白质10~80 μg为宜，如果样品蛋白质浓度过高，可用生理盐水适当稀释后再测。

七、实验的考察点

分光光度法的原理，分光光度计的构造、工作原理、一般操作方法及注意事项，考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量的原理，实验测定数据的读数、纪录和处理，蛋白质含量测定标准曲线的制作，利用标准曲线测定蛋白质含量，移液管的正确使用，微量移液器的正确使用。

观察和分析实验结果，通过推理得出合理的实验结论，实验报告撰写的格式。

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实验二 唾液淀粉酶活性影响因素的观察

酶具有催化效率高、专一性强、反应条件温和等优点，目前在科学研究、食品加工、饲料生产、医疗卫生等领域具有广泛的应用。但是酶的活性很容易受到环境条件的影响，例如温度、pH值、激活剂、抑制剂等，因此在实际应用之前，必须首先考虑酶的动力学性质，以及影响酶活性的各种因素。本实验以唾液淀粉酶为对象观察影响酶酶活性的各种因素，是酶学研究和应用的基本实验。

一、实验目的

1．通过实验了解酶的基本性质及影响酶活性的各种因素 2．学习测定酶的最适温度、最适pH值的方法

二、实验原理

唾液淀粉酶能将淀粉水解为糊精、极限糊精、麦芽糖等，这些产物与碘反应产生不同的颜色，因此可以根据显色的差异，判断化学反应速度的大小，从而确定酶活性的高低。本实验通过改变影响唾液淀粉酶活性的一种因素，控制酶促反应体系中的其他因素，使其保持一致，观测酶促反应速度，以分析单个因素对唾液淀粉酶活性的影响。

三、实验操作步骤

（一）唾液淀粉酶的制备：每人用自来水漱口3次，然后取20 mL蒸馏水含于口中，做咀嚼动作，3 min分钟后，吐入烧杯中，纱布过滤，取滤液10 mL，稀释至20 mL，获得稀释唾液。

（二）酶活性影响因素的观察 1．温度对酶活性的影响

（1）取3支试管，编号后按表2-1加入试剂，混匀，置于相应温度下反应。

表2-1 温度对酶活性的影响

试管号 1 2 3

0.5 %的淀粉溶液

（mL） 3 3 3

pH6.8的缓冲液

（mL） 0.5 0.5 0.5

稀释唾液（mL） 1 1 1

温度 ℃ 0 37 100

（2）取碘液2滴于白色比色板的各反应孔中，自试管放入水浴箱后，每隔1 min

2

从2号管中取反应液1滴，与其中一个反应孔内的碘液混合，观察颜色变化。

（3）待2号管中的反应液遇碘液不发生颜色变化（即呈碘色）时，向各管中加入碘液2滴，摇匀，观察并记录各管颜色（注意：第三管需自来水冷却，否则不显蓝色），根据观察结果分析温度对酶活性的影响，并确定唾液淀粉酶的最适温度。

2．pH对酶活性的影响

（1）取3支试管，编号后按表2-2加入试剂：

表2-2 pH对酶活性的影响

试管号 1

2 3

0.5 %的淀粉溶液

（mL） 2 2 2

pH5.0缓冲液（mL） 2 0 0

pH6.8缓冲液（mL） 0 2 0

pH8.0缓冲液（mL） 0 0 2

稀释唾液（mL） 1 1 1

（2）摇匀，置于37℃ 水浴箱保温。取碘液2滴于白色比色板的各反应孔中，自试管放入水浴后，每隔1 min，从2号管中取反应液1滴，与其中一个反应孔内的碘液混合，观察颜色变化，直至呈碘色。

（3）取出3个试管，立即各自加入碘液2滴，充分摇匀，观察各管呈现的颜色，判断不同pH值中淀粉水解的程度，并确定最适pH。

3．酶的激活剂及抑制剂对酶活性的影响 （1）取3支试管，编号后按表2-3加入试剂：

表2-3 激活剂及抑制剂对酶活性的影响

试管号 1

2 3

0.5%的淀粉溶液

（mL） 2 2 2

0.5%NaCl（mL） 0 1 0

蒸馏水（mL） 0 0 1

1%CuSO4（mL） 1 0 0

稀释唾液（mL） 1 1 1

（2）将3支试管混匀，放入37℃水浴中，并在白色比色盘上用碘液检查2号管，待碘液不变色时，向各管加碘液1滴，观察水解情况，记录并解释结果。

4．酶专一性观察

（1）取2支试管，编号后按表2-4加入试剂：

表2-4 酶作用专一性观察

试管号 1 2

0.5%淀粉溶液（mL） 2 -

0.5%蔗糖液（mL）

- 2

3

pH6.8缓冲液（mL） 0.5 0.5

稀释唾液（mL） 1 1

（2）将2支试管混匀，37 ℃保温，10 min。

（3）取出试管，分别加入斑氏试剂2 mL，混匀，于沸水中加热3 min，观察各管颜色，记录实验结果，确定酶的底物，分析酶作用的专一性。

四、实验试剂

1．0.5 g/L淀粉液：称取0.5 g可溶性淀粉，加少量的蒸馏水，在研钵中调成糊状，再徐徐倒入90 mL沸水，同时不断搅拌，冷却后用蒸馏水定容至100 mL。

2．1 % NaCl：称取氯化钠1 g，加少量蒸馏水将之溶解后，定容至100 mL。 3．1 % CuSO4：称取氯化钠1g，加少量蒸馏水将之溶解后，定容至100 mL。 4．0.2 mol/L pH5-8缓冲液：分别配制下列二液，再按下表混合。

（1）A液—0.2 mol/L Na2HPO4溶液：称取Na2HPO4·12H2O 35.62 g，加少量蒸馏水将之溶解后，定容至1000 mL。

（2）B液—0.1 mol/L柠檬酸溶液：称取无水柠檬酸19.212 g，加少量蒸馏水将之溶解后，定容至1000 mL。

不同pH缓冲液配置按表2-5加入试剂

表2-5 不同pH缓冲液配置

pH 5

6.8

8

0.2mol/L Na2HPO4溶液

（mL） 10.30 14.55 19.45

0.1mol/L柠檬酸溶液

（mL） 9.70 5.45 0.55

5．稀碘液：碘化钾1 g 加少许水溶解后，再加碘0.5 g，溶解后加水至100 mL，混匀。用时加水稀释10倍。

6．0.5 %蔗糖液：称取蔗糖0.5 g，加少量蒸馏水将之溶解后，定容至100 mL 。 7．斑氏试剂：柠檬酸钠173 g 和碳酸钠100 g 溶于约700 mL 水中，另将硫酸铜17.3 g溶于100mL水中，分别加热助溶，冷却后将两液混合，再加水至1000mL混匀。

8．冰块1 kg

五、实验器材

按每组计：试管6支，10 mL量筒个，小漏斗1个，脱脂纱布1块，1 mL、2 mL、5 mL吸管各2支，37 ℃恒温水浴箱、100 ℃恒温水浴箱各1个，盆1个，白瓷板2个，40 mL试剂瓶8个，100 mL烧杯2个，试管架1个，吸耳球2个，滴管2个，吸管架1个。

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六、实验过程中应注意的问题

该实验最关键的环节是酶促反应终点的判断，既不能过早又不能过晚；温度对酶活性影响实验中，试管从沸水中取出后，先用流动水冷却，再滴加碘液；加碘液时，应逐滴加，直到三管颜色不同为止。

七、本实验的考察点

实验原理；影响酶活性的因素及其作用规律，唾液淀粉酶稀释液的制备，最适温度、最适pH的测定方法，移液管的使用，酶动力学实验设计的方法（包括温度梯度、pH梯度的制作），连续取样法观测酶促反应进程，确定反应终点，观察和分析实验结果，通过推理得出合理的实验结论，实验报告撰写的格式。

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实验三 血液葡萄糖测定——福林—吴宪法

血液中所含的葡萄糖，称为血糖。它是糖在体内的运输形式。目前国内临床上多采用葡萄糖氧化酶法和邻甲苯胺法测定血糖。前者特异性强、价廉、方法简单；后者具有操作简单，特异性较高的优点，试剂成本也较低，但该方法一般需要在浓酸高温条件下发生反应, 因此在做血糖测定时必需多加注意。本实验采用福林—吴宪法测定血液中的葡萄糖。

一、实验目的

1．掌握福林-吴宪法测定血液葡萄糖含量的原理 2．掌握无蛋白滤液的制备方法

二、实验原理

血清中的葡萄糖和碱性铜在加热条件下反应，生成氧化亚铜，氧化亚铜与磷钼酸试剂反应生成蓝色物质，其溶液在420 nm波长处的光密度值与血糖浓度成正比，据此可以测定血液中葡萄糖的含量。

三、实验操作步骤

1．制备1∶10全血无蛋白滤液：取1份抗凝血，加入8份1/24 mol/L硫酸溶液，此时血细胞迅速破裂，颜色变黑，再加入10 %钨酸钠1份，摇匀，3000转/min 离心10 min，取上清液，过滤，得到无色澄清无蛋白滤液。

2． 取3支血糖管按表3-1加入试剂：

表3-1 福林-吴宪法测定血糖

试管号 蒸馏水（mL）

空白管 1.0

标准管 — 1.0 — 2.0

测定管 — — 1.0 2.0

标准葡萄糖应用液（mL） — 无蛋白滤液（mL） 碱性同试剂（mL）

— 2.0

混匀，置沸水浴中煮8分钟，取出，用流动自来水冷却三分钟（且勿摇动血糖管） 磷钼酸试剂（mL）

2.0

2.0

2.0

混匀后放置2分钟（使CO2气体逸出）

1∶4磷钼酸加至（mL）

12.5

12.5

12.5

1∶4磷钼酸溶液加至12.5 mL后，用橡皮赛塞紧管口，颠倒混匀，用空白管调0

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点在420nm波长处比色，读取各管光密度值，按下列公式计算100 mL血液中血糖的浓度：

葡萄糖（mg）测定管的光密度值100

??0.1?100mL标准管的光密度值0.1四、实验试剂

1．1/24 mol/L硫酸溶液：取浓硫酸（密度1.84）4.62 mL，加入到约500mL蒸馏水中，再定容至1000 mL。用0.lmol/LNaOH标定，调整至1/12 mol/L。

2．10 %（W/V）钨酸钠溶液：将钨酸钠（Na2WO4·2H2O）l0 g溶于蒸馏水，使全量至100 mL（此液呈弱碱性，取l0mL用0.l mol/L HCl溶液滴定，达中和时需0.l mol/L HCl 0.4 mL）。

3．碱性硫酸铜试剂： 取无水碳酸钠40 g溶于约400 mL蒸馏水中；酒石酸7.5 g溶于约300 mL蒸馏水中，结晶硫酸铜4.5 g溶于200 mL 水中，均加热助溶。冷却后，将酒石酸溶液倾入碳酸钠溶液中，混匀，移入1000 mL 容量瓶中，再将硫酸铜溶液倾入并加入蒸馏水至刻度。混匀，贮存于棕色瓶中。

4．磷钼酸试剂： 取钼酸（HMoO4）70 g和钨酸钠10 g，加入10 % NaOH溶液400 mL及蒸馏水400 mL，混合后煮沸20~40min，以除去钼酸中存在的氨（直至无氨味为止），冷却后加入浓磷酸（80 %）250 mL，混匀，最后以蒸馏水稀释至1000mL。

5．0.25% 苯甲酸溶液： 称取苯甲酸2.5 g，加入1000mL蒸馏水中，煮沸使溶解，冷却后补加蒸馏水至1000mL，贮于瓶中，可长期保存。

6．葡萄糖贮存标准液 （l0 mg/mL）： 将少量无水葡萄糖 (A.R或C.P)置于硫酸干燥器内过夜。精确称取此葡萄糖1.000 g，以0.25 %苯甲酸溶液溶解并转入100 mL容量瓶内，再以0.25 %苯甲酸溶液稀释至100 mL刻度，置冰箱中可长期保存。

7．葡萄糖应用标准液（0.l mg/mL）： 准确吸取葡萄糖贮存标准液1.0 mL，置100 mL容量瓶内，以0.25 %苯甲酸溶液稀释至100mL刻度。

8．1:4磷钼酸稀释液： 取磷钼酸试剂1份，加蒸馏水4份，混匀即可。 9．抗凝血：称取EDTANa2 16 mg于干净烧杯中，采集20 mL新鲜血液，摇匀，置于4℃冰箱备用。

五、实验器材

分光光度计，恒温水浴箱，刻度吸管，玻璃漏斗，血糖管，试管

六、实验过程中应注意的问题：

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一定要等水沸后再放入血糖管进行水浴加热；水浴箱中水面应高于血糖管中溶液的液面；加热时间必须准确；流动水冷却时切勿摇动试管；加入钼酸试剂后应及时放气。

七、本实验的考察点

福林——吴宪法进行血糖测定的原理，抗凝血制备，无蛋白滤液的制备，离心机的使用，血糖管的使用，实验测定数据的读数、纪录、处理，公式法计算血糖含量。

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实验四 血清总脂测定——香草醛法

血清总脂指血清中各种脂类的总和。测定血清总脂的方法有称量法、比色法、染色法等。其中称量法比较准确，可作为参考标准。比色法简单易行，为常用的测定方法，本实验采用香草醛法。

一、实验目的

1．学习总脂测定的原理和方法。 2．掌握微量吸管的正确使用方法。

二、实验原理

不饱和脂类物质在加热条件下，与浓硫酸发生反应，产生正碳粒子，正碳粒子与磷酸香草醛反应生成紫色物质，其溶液在525 nm处的吸光值，与脂的浓度成正比。

三、实验操作步骤

取3支洁净试管，按下表4-1操作。

表 4-1 香草醛法测定血清总脂

试管号 血清（mL）

空白管 —

标准管 — 0.02 1.0

测定管 0.02 — 1.0

标准液（mL） — 浓硫酸（mL） 1.0

充分混匀。放置沸水浴中加热10 min，使脂类水解，冷水冷却。 显色剂（mL） 4.0

4.0

4.0

用玻璃棒充分混匀，静置20 min（或37℃保温15 min）后，以空白管调“0点”， 在525 nm波长处，分别读取各管光密度。

实验结果计算：

血清总脂（mg）测定管的光密度值100测定管的光密度值??0.12???600

100mL标准管的光密度值0.02标准管的光密度值四、实验试剂

1．胆固醇标准液（6 mg/mL）：精确称取胆固醇600 mg，溶解于无水乙醇并定容至100 mL。

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2．显色剂：先配置0.6 %的香草醛水溶液200 mL，再加入浓磷酸800 mL。贮存于棕色瓶中可保存6个月。

3．浓硫酸（分析纯，含量95 %以上）。 4．浓磷酸（分析纯，含量85 %以上）。

五、实验器材

分光光度计，恒温水浴箱，刻度吸管，微量移液器，试管

六、实验过程中应注意的问题：

实验过程中切勿将试剂洒落实验台、粘附于器皿外或衣物上；试管应干燥；尽量将试剂加入到试管底部。

七、实验考察点

混合成分含量测定的原理和方法，香草醛法测定血脂的操作流程，胆固醇作为标准的理由及其对实验结果的解释，胆固醇标准液的配制、用移液管移取黏度较大的液体，微量液体的使用，水浴锅的使用。

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实验五 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳

电泳技术是蛋白质和核酸研究中最常用的生物化学技术。电泳是指带电粒子在电场中的定向移动，不同的带电粒子由于电荷的差异，在电场中的迁移率不同，所以在相同时间内，它们迁移的距离不同，据此可以将其分开。蛋白质是两性电解质，在不同的缓冲液中所带电荷的极性与数量会有所不同，因而在电场中的行为也相应地会有所不同，因此可以采用电泳的方法将其分离。

一、目的

1．学习电泳的一般原理和方法。

2．掌握醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质的技术。

二、实验原理

带电粒子在电场中的定向移动称为电泳。醋酸纤维薄膜电泳是用用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，有强渗透性，对分子移动无阻力。

蛋白质是两性电解质，在pH

血清中主要含有白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白，在pH8.6的缓冲溶液中，此5种蛋白质都带负电，在电场中都向正极移动，但由于这5种蛋白质的相对分子量、等电点及形状等不同，它们在电场中的移动速度不同，故采用电泳的方法可以将其分离。

三、实验操作步骤

（一）仪器和薄膜的准备 1．醋酸纤维薄膜的润湿和选择

将薄膜裁成（2×8cm）条状，使其漂在缓冲液液面上，如果迅速湿润，而且整条薄膜颜色一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀（实验中应选择质地均匀的薄膜）。然后再用竹夹轻轻将薄膜完全浸入缓冲液中，待薄膜完全浸透后使用。

2．制作电桥

将电泳电极缓冲液倒入电泳槽两边的缓冲液池中，并用虹吸管平衡两侧的液面。

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根据电泳槽的纵向尺寸，于两电极槽各放入四层纱布，一端浸入缓冲液中，另一端贴附在电泳槽支架上。它们的作用是联系薄膜与两端电极缓冲液之间的中间“桥梁”。

（二）点样

取出浸透的薄膜，平放在滤纸上（无光泽面朝上），轻轻吸去多余的缓冲液。取血清0.1 mL放于洁净载玻片上，再加上0.5 mL 0.03 %溴酚蓝，混匀。用点样器蘸一下（约2-3 mL），再“印”在薄膜的点样区。注意，应使血清均匀的分布在点样区内，这是获得清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。

点样区

3mm 2cm

（三）电泳

将点好样的薄膜（无光泽面朝下）两端紧贴在支架的纱布上。平衡十分钟，接通电源（负极靠点样端），调节电流为0.4-0.6 mA（薄膜每厘米宽），电压为每厘米长10-12 V（总电压60~70 V），电泳45-60 min。

（四）染色

电泳完毕，关闭电源，立即取出薄膜，直接浸入染色液中5 min。然后用漂洗液漂洗，每隔10 min左右换一次漂洗液，连续两次，使背景颜色脱去，夹在滤纸中吸干。

（五）结果判断

一般经漂洗后，薄膜上可呈现清晰的5条区带，由正极端起，依次为清蛋白、α1

球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、和г球蛋白。

（六）透明

将用滤纸吸干的薄膜，浸入透明液甲液中，2 min后立即取出，并进入透明液的乙液中，1 min（要准确）后迅速取出，紧贴在载物片上，赶走气泡。约2-3 min内薄膜完全透明，待干后置于切片盒中，可长期保存。

正极

负极

清蛋白 α1 α2 β г 原点 12

四、实验试剂

1．新鲜血清

2．巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.06）：称取巴比妥钠12.76 g，巴比妥1.66 g，加蒸馏水加热溶解，稀释至1000 mL。

3．氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B 0.5 g，甲醇50 mL，冰醋酸l0 mL，加水至100mL。

4．漂洗液：95 ％乙醇45 mL、冰醋酸5 mL和蒸馏水50 mL，混匀。

5．透明液：

甲液：冰醋酸15 mL和无水乙醇85 mL混匀。 乙液：冰醋酸25 mL和无水乙醇75 mL混匀。

五、实验器材

醋酸纤维薄膜（2×8cm）、电泳仪、薄膜电泳槽、点样器（盖玻片）、培养皿、粗滤纸、玻璃板（载玻片）、镊子

六、实验过程中应注意的问题：

点样式关键，要少、轻、直、匀；不要将薄膜吸得过干；漂洗时不要用镊子来回拉动；节约漂洗液，要注意电流强度。

七、实验的考察点

电泳的一般原理和操作步骤，SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量的原理，醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的原理和操作步骤。

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实验六 碱性磷酸酯酶的分离与制备

酶是一种蛋白质，具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等优点，目前在科学研究、食品加工、饲料生产、医疗卫生等方面具有广泛的应用。无论是在基础研究中，还是在实际生产中，必须对酶进行分离和纯化，因此，酶的分离纯化是酶学研究和应用，乃至蛋白质科学研究和生命科学研究的基础。

碱性磷酸酯酶（ALP或AKP）是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向外排出的一种酶。碱性磷酸酯酶主要功能是催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。碱性磷酸酯酶是分子生物技术常用的工具酶之一，也是免疫诊断试剂产品最常用的标记酶，临床上，碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。

有机溶剂分级沉淀法是分离蛋白质的常用方法之一，有机溶剂能使很多溶于水的生物大分子发生时沉淀，不同的蛋白质在不同浓度的不同有机溶中的溶解度不同。。本实验依据碱性磷酸酯酶的性质，采用有机溶剂分级沉淀法提取分离碱性磷酸酯酶。

一、实验目的：

1．通过实验了解蛋白质分离提取的一般流程和方法

2．学习使用有机溶剂分级沉淀法分离蛋白质的原理和一般方法

3. 掌握有机溶剂分级沉淀法从肝组织中提取分离碱性磷酸酯酶的原理和方法。

二、实验原理

有机溶剂沉淀蛋白质的原理是降低水溶液的介电常数和通过氢键破坏蛋白质表面的水化膜，从而使蛋白质凝聚成团，最后沉淀出来。因此，可以通过逐步改变样品溶液中有机溶剂的浓度和比例，使不同的蛋白质依次沉淀出来，利用这种方法分离蛋白质的方法，称为有机溶剂分级沉淀法。

本实验依据碱性磷酸酯酶溶解于33 %丙酮溶液或30 %乙醇溶液，而在50 %丙酮溶液或60 %乙醇溶液中沉淀，采用有机溶剂分级沉淀法分离碱性磷酸酯酶。

三、实验操作

以下操作均在4—10 ℃进行 （1）材料预处理和匀浆

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称取新鲜兔肝2 g，剪碎后，置于玻璃匀浆器中，加入2.0 mL 0.01 mol/L醋酸镁-0.01 mol/L醋酸钠溶液，充分磨成匀浆后，将匀浆转移至离心管中，用上述溶液4.0mL分2次冲洗匀浆管，幷倒入离心管中，混匀，此为A液。 （2）抽提和过滤

加2.0 mL正丁醇于上述剩余的匀浆液中，口对底上下颠倒充分混匀2 min。然后在室温放置20 min，滤纸过滤，滤液置于离心管中。

（3）丙酮沉淀浓缩

取4 mL的抽提液（A液）于离心管中，加入等体积（4 mL）冷丙酮，立即混匀后离心5 min（2000r/min），弃上清液，向沉淀中加入4.0 mL 0.5 mol/L醋酸镁溶液，震荡使其充分溶解，为B液。

（4）乙醇分级沉淀

取4 mL B液于离心管中，加入95 %冷乙醇1.84 mL，使乙醇浓度为30 %，混匀，立即离心5 min（2000r/min），将上清液倒入另一只离心管中，弃去沉淀，取上清液4 mL于新离心管中，加入95 %冷乙醇3.435 mL，使乙醇浓度达60 %，混匀后立即离心5 min（2500r/min），弃上清液。向沉淀中加入4.0 mL 0.01 mol/L醋酸镁—0.01 mol/L醋酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解，为C液。

（6）丙酮分级沉淀

取4 mLC液于离心管中，加入冷丙酮1.97 mL，使丙酮浓度为33%，混匀，立即离心5 min（2000r/min），将上清液倒入另一只离心管中，弃去沉淀，取上清液4 mL于新离心管中，加入冷丙酮1.36mL，使丙酮浓度为50%，混匀后立即离心15 min（3800 r/min）,弃上清液。所得沉淀即为初步纯化的碱性磷酸酶。

（7）提取产物的鉴定

给沉淀中加入1 mLTris-HCl缓冲液（pH8.8）充分震荡摇匀，使酶溶解，再加入1 mL底物液，37℃水浴15 min，加入NaOH溶液1mL，4-氨基安替比林1 mL，铁氰化钾溶液2 mL，37℃水浴10 min，观察溶液颜色，如果颜色变红，提取物即为碱性磷酸酶，颜色越深，酶活力越高。

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肝脏碱性磷酸酯酶分离实验技术路线

四、实验试剂

1．新鲜肝脏

2．0.5 mol/L醋酸镁溶液：称取107.25 g醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000 mL，再徐徐倒入90 mL沸水，同时不断搅拌，最后用蒸馏水定容至100 mL。

3．0.1 mol/L 醋酸钠溶液：称取8.2 g醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000 mL。 4．0.01mol/L 醋酸镁-0.01mol/L醋酸钠溶液：准确吸取20 mL 0.5 mol/L醋酸镁溶液及100 mL 0.1 mol/L醋酸钠溶液，混匀后定容至1000 mL。

5．Tris-HCl pH8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1 g，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL，即为0.1 mol/L Tris溶液。取100 mL 0.1mol/L Tris溶液，加蒸馏水约780 mL，再加0.1 mol/L醋酸镁100 mL，混匀后用1%冰醋酸调 PH为8.8，用蒸馏水定容至1000 mL。

6．40 mmol/L底物液：称取磷酸苯二钠11.56 g，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解，定容至1000mL。

7．0.5 mol/LNaOH溶液：称取NaOH34.5 g，溶于1000 mL的蒸馏水中。 8．0.3 %（W/V）4-氨基安替比林溶液：称取0.3 g 4-氨基安替比林及4.2 g硫酸氢钠，用蒸馏水溶解至100 mL。

9. 0.5 %（W/V）铁氰化钾溶液：称取0.5 g铁氰化钾和15 g硼酸，各溶于400 mL蒸馏水中，溶解后两溶液混合，再用蒸馏水定容至1000 mL。

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10. 正丁醇，丙酮，95 %乙醇均为分析纯试剂。

五、实验器材

移液管水吸耳球水量筒，玻璃匀浆器浆剪刀，离心机心离心管心水浴锅，新华定性滤纸

六、实验过程中应注意的问题：

离心时一定要平衡，正确选择离心力，正确判断取上清夜还是沉淀，准确计算加入有机溶剂的量，有机溶剂一定要预冷。

七、实验考察点

玻璃匀浆器的正确使用、离心机、有机溶剂分级沉淀分离蛋白质的原理、肝脏碱性磷酸酯酶分离的实验原理和操作流程，碱性磷酸酯酶的鉴定方法。

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实验七 琥珀酸脱氢酶竞争性抑制观察

无论在生物体内，还是在科研和生产中，影响酶的活性的因素很多，其中研究酶的抑制作用具有重要的意义。在酶的抑制作用中，竞争性抑制是酶可逆抑制的重要方式。研究酶的竞争性抑制的规律，对于研究酶在体内的调节方式、药物开发，以及科研和生产等酶的各种应用领域具有重要的意义

琥珀酸脱氢酶为呼吸链中的复合体II，在呼吸作用较强的组织（心肌、骨骼肌、肝脏等）细胞中含量丰富，其以琥珀酸为底物，产生还原氢。丙二酸为琥珀酸的类似物，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。

本实验先从心肌组织中抽提细胞匀浆液，获得琥珀酸脱氢酶，利用琥珀酸的类似物丙二酸为竞争性抑制剂，观察琥珀脱氢酶的竞争性抑制现象。

一、实验目的：

1. 掌握心肌细胞匀浆液的制备方法。

2. 观察无氧条件下琥珀酸脱氢酶竞争性抑制作用。

二、实验原理

存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氢酶，能使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，同时产生还原氢，还原氢可使甲烯蓝褪色，还原为甲稀白。草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争的和琥珀酸脱氢酸的活性中心结合而产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中的浓度和相对比例。本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝褪色的程度，从而探索丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制的规律性。反应如下： COOHCH2COOHCH2CH2COOH琥珀酸COOHCHCHCOOH延胡索酸FADH 2MB甲烯兰琥珀酸脱氢酶FADMBH2甲烯白O2COOH丙二酸 18

三、实验操作步骤

（1）猪心肌组织匀浆液的制备:

称取新鲜猪心肌组织1.5-2 g放置研钵中剪碎加入等体积的石英沙和pH7.4的0.10 mol/L磷酸盐缓冲液3-4 mL匀浆（在研钵中充分研磨），研磨成匀浆后加入上述的缓冲液6-7 mL。

（2）猪心肌组织细胞基质抽提液的制备：

将匀浆液置于离心管中静置20 min（放置过程中要上下颠倒轻摇数次），2000 r/min离心10min,得上清液。

（3）琥珀酸竞争性抑制的观察

取五支试管分别编号，按下表配制反应体系：

表7-1 琥珀酸竞争性抑制的观察

试管号 1 2 3 4

0.093mol/L琥珀酸钠

（滴） 5 5

5 20

0.10mol/L丙二酸钠

（滴） — —

5 5

蒸馏水（滴） 25 25 15 —

心肌匀浆液（滴） 5 5（煮沸）

10 10

0.02%甲烯蓝（滴） 2 2

2 2

摇匀，给每个试管溶液上部加5滴石蜡油，37 ℃水浴30 min，其间每隔10 min观察溶液颜色，并记录实验结果。

（4）最后振荡1号试管，观察颜色变化，记录并解释这种现象。

四、实验试剂

1. 新鲜动物心脏

2. 1.5 %（w/v）琥珀酸钠溶液（0.093 mol/L）：称取1.5 g琥珀酸钠，用蒸馏

水溶解并稀释到100 mL。（若无琥珀酸钠，则可以用琥珀酸配成水溶液后，再用NaOH溶液中和至pH7-8）。

3. 3 .1 %（w/v）丙二酸钠溶液（0.10 mol/L）：称取丙二酸钠1g，用蒸馏水溶

解并稀释到100mL。 4. 0.02 %（w/v）甲烯蓝溶液。

5. 1/15 mol/L Na2HPO4溶液：称取Na2HPO4·2H2O 11.8 g，用蒸馏水溶解并稀

释到1000 mL。 6. 液体石蜡油。

五、实验器材

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移液管，吸耳球，量筒，研钵，手术剪，剪刀，离心机，离心管，水浴锅

六、实验过程中应注意的问题：

心肌组织尽可能研磨成匀浆，加入石蜡油后，切勿摇动试管。

七、实验考察点

心肌组织匀浆抽提掖的制备方法，琥珀酸脱氢酶竞争性抑制的原理，琥珀酸脱氢酶竞争性抑制的观察方法的原理和操作。

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实验八 阳离子交换树脂纯化细胞色素c

层析技术具有操作简单、分离效率高、成本低等优点，被广泛应用于分离纯化技术领域，特别是在蛋白质分离纯化中，发挥着重要的作用。

层析是依据待分离混合物各组分的理化性质（表面电荷、溶解度、表面疏水性、分子大小，以及与固定相的选择结合性）的差异所建立的分离和分析技术。当待分离混合物通过由固定相和流动相组成的系统时，各组分与两相相互作用（溶解、吸附和结合），由于各组分的理化性质不同，在两相之间的分配存在差异。随着流动相的移动，各组份不断地在两相之间连续进行分配和再分配，与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快；反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢，在相同的时间里移动的距离不同，这样就可以达到分离的目的，分离效果较好的层析系统，可得到样品中所含的各单一组份。

本实验依据采用阳离子交换树脂纯化细胞色素c，学习和掌握层析法分离纯化蛋白质的原理和一般操作流程。

一、实验目的：

1．学习层析技术的原理和一般操作过程。

2．学习阳离子交换树脂纯化细胞色素c的原理和操作方法。

二、实验原理

离子交换层析是利用离子交换剂与待分离的带电粒子之间亲和力（静电引力）的差异进行分离的层析技术。离子交换层析的固定相是离子交换剂，流动相是具有一定pH和一定离子强度的电解质溶液。离子交换剂由三部分构成：不溶性高分子化合物、荷电基团和反离子。离子交换剂根据反离子可以分为：阳离子交换剂和阴离子交换剂。

Amberlite IRC-50为羧酸型阳离子交换树脂R-COOH。它以树脂为母体，引入羧基形成的弱酸型阳离子交换剂，使用前应先将交换剂转变为NH4+型，其荷电基团是羧基，反离子为氨离子。

细胞色素c是线粒体内呼吸链的组成成分之一，分子量较小（12000），等电点为10.7，pH为7时，带正电荷，因此用弱阳离子交换剂可以将其纯化。

Amberlite IRC-50纯化细胞色素c的原理如下：

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pCOONH4-+NaCOONH4+-+++p+COONap+-COOH-+COONH4-+

在pH7条件下树脂通过静电引力吸附细胞色素c，用蒸馏水洗掉不吸附的杂蛋白，然后增加洗脱液的离子强度，以0.06 mol/L Na2HPO4-0.4 mol/L NaCl洗脱，Na+交换细胞色素c，将其洗脱下来，达到分离纯化的目的。

三、实验操作步骤

（1）Amberlite IRC-50离子交换剂的预处理：

Amberlite IRC—50（H）树脂处理：取一定量的Amberlite IRC—50（H）（数量根据柱体积而定），用蒸馏水浸泡过夜，倾倒去水，加入2倍体积的2 mol/L HCl溶液，60 ℃恒温条件下电磁搅拌约1 h，倾倒去盐酸溶液，用无离子水洗涤至中性；加入2倍体积的2 mol/L NH4OH溶液，60℃恒温条件下搅拌l h，倾倒去氨溶液，再用无离子水洗至中性。

（2）离子交换纯化细胞色素c

装柱：将1×20 cm的层析柱垂直固定在铁架台上，关紧层析柱下端的出液口阀，用胶头滴管向层析柱中加入3 mL蒸馏水，然后吸取处理好的Amberlite IRC-50（NH4+）树脂溶浆，缓慢加入到层析柱中，使胶粒自由沉降，直至柱床高度为10 cm为止。（如果蒸馏水过多，打开层析柱下端的出液口阀，适当放出）

平衡：打开层析柱下端的出液口阀，用试管接收流出液，连续给层析柱缓慢加蒸馏水约10 mL，冲洗离子交换柱，至流出液的pH为7～8。（注意：柱床以上的蒸馏水高度不低于3 cm）

上样：关闭下端出液口阀，用胶头滴管吸去柱床面层以上的水，取1 mL细胞色素c样品液，缓缓加于柱床表面，打开层析柱下端的出液口阀，控制流速，使样品缓慢进入离子交换柱，关紧层析住下端出液口。（注意：让样品尽可能吸附在柱的上部，越集中越好，洗脱时样品易于集中，减少洗脱液体积。）

冲洗：上样完成后，在柱床面上先缓缓加入一层蒸馏水，打开层析柱下端出液口，用蒸馏水继续冲洗离子交换柱5～6 min，流速为1 mL/min（10滴/min），洗去不吸附的杂质。

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洗脱：冲洗完成后，关闭下端出液口阀，用胶头滴管吸去柱床面层以上的水，改用0.06 mol/ L Na2HPO4 ～0.4 mol/LNaCl溶液洗脱。先在柱床面上缓缓加入一层洗脱液，打开下端出液口阀，控制流速为1 mL/min（10 滴/min），用干净的试管接收洗出液，每10滴一管并按照次序编号。继续给层析柱中加洗脱液，始终保持接近满溢状态，直到，洗脱液为无色为止。

（3）细胞色素c含量的测定

观察各管颜色深浅，按照次序记录各管溶液体积。将相邻两管溶液合并，测定合并后各管溶液的细胞色素c浓度。细胞色素c浓度测定方法如下：

取于试管若干，编号，按照表8-1进行操作：

表8-1 细胞色素C含量的测定

0.06mol/lNa2HPO4—0.4mol/lNaCl缓冲液 适当稀释得细胞色素c溶液 0.01mol/l铁氰化钾溶液

空白 2.9 0 0.1

样品1 1.4 1.5 0.1

样品2 1.4 1.5 0.1

… … … …

混匀，以空白管为0，在550nm波长测定光密度值（OD）,按下列公式计算含量：

y(mg)?OD3?M?t??V(ml)?稀释倍数E1.5

其中，E为摩尔消光系数（2.77×104 /mol/cm）； 1.5为细胞色素C溶液得体积；Mωt为细胞色素c分子量（124000）； 3为比色时溶液的体积；V为制备所得细胞色素c溶液体积。

以各管累积体积为横轴，细胞色素c浓度为纵轴，画曲线。最后计算洗脱峰内各管的总体积和细胞色素c的总量。

累积体积的计算：

Vi??vn vn?0.2?xn

n?1n?iVi为第 I 管的累积体积；vn为第 n 管的体积，其中（1≤n≤i）；xn为第 n 管

的合并管数。

细胞色素c总量的计算：

m?NW(mg)??vcm?1mm

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W为细胞色素 c 的总量；N为总样品管数；vm为第 m管样品的体积；cm为为第m 管样品中细胞色素c的浓度。

（4）Amberlite IRC-50离子交换剂的再生

用过的AmberliteIRC—50(H)先用无离子水洗，再用2 mol/LNH4OH洗涤，倾倒碱水，用无离子水洗至近中性。加2 mol/L HCl溶液在60℃条件下搅拌20 min，倾去酸溶液。用无离子水洗至中性。再用2 mol/L NH4OH溶液浸泡，然后用无离子水洗至中性后即可使用。如长期不用，可用布氏漏斗抽干备用。

四、实验试剂

1. 细胞色素c样品液

2. 0.06 mol/LNa2HPO4-0.4 mol/LNaCl：称取21.5 g Na2HPO4·12H2O和23.4 g NaCl，加蒸馏水使之溶解，定容至1000 mL。

3. 0.01 mol/L铁氰化钾溶液：称取铁氰化钾3.2925 g，加蒸馏水使之溶解，定容至1000 mL 。

4. 2 mol/L 氨水：取浓盐酸140 mL，用水稀释定容至1000 mL。 5. 2 mol/L 盐酸：取浓盐酸168 mL，用水稀释定容至1000 mL

五、实验器材

移液管，吸耳球，量筒，层析住，铁架台，层析柱夹，分光光度计，比色杯。

六、实验过程中应注意的问题：

装柱要均匀，上样量不宜过大；流速控制准确，稳定，计时（数滴）要准确。

七、实验考察点

层析方法的一般原理和操作步骤，离子交换层系的原理，阳离子交换树脂纯化细胞色素c的原理和操作步骤，细胞色素c含量的测定方法。蛋白质分离纯化的实验设计。

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实验九 血清IgG 的分离与制备

免疫球蛋白是人类及动物受到抗原刺激后在机体内产生的能与抗原特异性结合的一类球蛋白，又称为抗体。根据其免疫性质的不同，分为IgG、IgA、IgE、IgM和IgD等五类。其中IgG是免疫球蛋白的主要成分之一，在血清中的含量较高。

盐析法是对蛋白质初级分离的重要方法之一。盐析法就是通过控制中性盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步沉淀出来，达到分离蛋白质的目的。本实验采用饱和硫酸铵溶液分级沉淀方法，初步分离血清中的IgG。

一、实验目的

1．学习盐析方法分级沉淀分离蛋白质的原理和方法。 2．掌握从血清分离IgG的原理和操作方法。

二、实验原理

蛋白质是亲水胶体，带有一些正电荷和负电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水化膜，这些因素维持蛋白质水溶液的溶胶状态。当加入少量盐时，增大了蛋白质在水中的溶解度，出现盐溶现象。但当盐浓度增加到一定浓度时，蛋白质发生沉淀，出现盐析现象。（蛋白质溶解度，取决于其水合度）

- +-（氨基酸有酸性氨基酸和碱性氨基酸，-COO和 –NH3，所以带正电、负电。-COO与H2O的H+形成+2-氢键，–NH3与H2O的O形成氢键，故而形成水化膜。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。增大盐浓度，一方面中和蛋白表面极性基团，一方面盐粒子竞争结合水分子而破坏水化膜）

IgG不溶于35 %饱和度的硫酸铵溶液，据此，首先在50 %饱和度的硫酸铵条件下沉淀球蛋白，溶解后，再采用35 %饱和度的硫酸铵沉淀IgG，达到逐步出去杂蛋白和浓缩IgG的目的。

三、实验操作步骤

1．在1支10 mL离心管中加入2 mL血清和2 mL 0.01 mol/L（pH7.0）磷酸盐缓冲液，混匀。取4 mL饱和硫酸铵溶液，用胶头滴管加入血清溶液中，边滴加边搅拌，使溶液的最终饱和度为50 %，然后4 ℃静置15 min，充分盐析。

2．3000 r/min离心10 min，沉淀为球蛋白。弃去上清液。

3．将沉淀溶于2 mL 0.01mol/L（pH7.0）磷酸盐缓冲液中，滴加饱和硫酸铵溶液1 mL，使溶液的饱和度达35%，4℃静置20 min，充分盐析。

4．3000 r/min离心15 min，沉淀即为IgG的粗品。

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四、实验试剂

1．饱和硫酸铵溶液：称取(NH4)2SO4 800 g，加蒸馏水1000 mL，不断搅拌下加热至50~60℃，并保持数分钟，趁热过滤，滤液在室温中过夜，有结晶析出，即达到100 %饱和度。使用时用浓NH4OH调至pH7.0。

2．0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）：取0.2 mol/L Na2HPO4溶液61.0 mL， 0.2 mol/L NaH2PO4溶液39.0 mL，混合，用酸度计检查pH应为7.0。取该混合液50 mL，加入7.5 g NaCl，用蒸馏水加至1000 mL。

五、实验器材

离心管，电冰箱，离心机，胶头滴管，刻度吸管

六、实验过程中应注意的问题：

用滴管边加边搅拌，是为防止饱和硫酸铵一次性加入或搅拌不均匀造成局部过饱和的现象，使盐析达不到预期的饱和度，得不到目的蛋白质；搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。

七、实验考察点

盐析法分级沉淀蛋白质的概念、原理和方法。饱和硫酸铵溶液盐析沉淀法分离血清IgG的原理和操作方法。

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实验十 化学法测定DNA的含量

核酸含量测定在分子生物学研究和生物化学研究中经常会用到。核酸含量测定方法较多，例如紫外分光光度法、定磷法和定戊糖法等，本实验采用二苯胺法测定DNA的含量。

一、实验目的

1．掌握化学法——二苯胺法测定DNA含量的原理和操作方法。

二、实验原理

DNA 在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱和脱氧核糖，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖，该化合物能与二苯胺试剂反应，生成蓝色化合物，此物质在595 nm 波长处有最大吸收。当DNA 在40-400 μg 范围内时，蓝色溶液的吸光值与DNA的浓度成正比，依次可以测定DNA的含量。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。

三、实验操作步骤

取两支干净试管，按表10-1编号并加入试剂，混匀。

表10-1 化学法测定DNA的含量

0.01 mol/L NaOH溶液 DNA样品液 二苯胺试剂

空白 1 0 4

样品 0 1 4

置于60℃水浴中保温1h，冷却后，以空白管调零，于595nm 波长处测定样品管的光密度（OD595nm），查标准曲线，可得样品中DNA的含量。

DNA纯度计算：

DNA纯度?DNA测定值DNA测定值

%?%DNA样品值200DNA含量紫外分光光度法测定：

DNA浓度(?g/mL)?DNA纯度紫外分光光度法测定：

OD260 0.02 27

R?OD260 OD260一般RNA的R值大于2；DNA的R值在1.9左右；当蛋白质含量较高时R值下降。变性DNA的R值大于2.0。

比较两个方法测定DNA量差异，试说明原因。

四、实验试剂

1．DNA标准溶液：准确称取小牛胸腺的DNA 钠盐，以0.01 mol/L NaOH 溶液配成200 μg/mL 的溶液。

2．测定样品溶液：准确称取干燥的DNA 制品，以0.01 mol/L NaOH 溶液配

成100-150 μg/mL 的溶液。若要测定RNA 制品中的DNA 含量，样品中至少要含有DNA 20 μg/mL 才能进行测定。

3．二苯胺试剂：称取1 g 二苯胺， 溶于100 mL 的分析纯的冰乙酸中，再加

入60 %以上的过氯酸10 mL，混匀待用。临用前加入1mL 的1.6 %乙醛，配好的试剂应为无色。

五、实验器材

分光光度计，恒温水浴箱，刻度吸管，微量移液器，试管 六、实验过程中应注意的问题：

二苯胺试剂有毒，注意安全；本实验所得测定值偏高。

七、实验考察点

DNA标准业的配制，化学法测定DNA含量的原理和操作方法，DNA纯度的测定方法，微量移液器的正确使用，分光光度计的正确使用，标准曲线的制作，标准曲线法测定物质含量的原理和操作方法。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/5unw.html