植物生理学实验指导

植物生理学 实验指导

目 录

植物材料的采集、处理与保存 .................................................................................................................................. 3 实验一 拟南芥种植和形态观察 .............................................................................................................................. 7 实验二 植物细胞的活体染色和死活的鉴定 .......................................................................................................... 9 实验三 植物细胞渗透势的测定（质壁分离法） ................................................................................................ 11 实验四 植物组织水势的测定（小液流法） ........................................................................................................ 13 实验五 植物根系活力的测定（TTC法） ............................................................................................................. 15 实验六 根系总吸收面积和活跃吸收面积的测定 ................................................................................................ 17 实验七 离体叶绿体的制备以及完整度的测定 .................................................................................................... 19 实验八 叶绿体色素的提取、分离和理化性质 .................................................................................................... 23 实验九 植物叶片光合速率的测定（改良半叶法） ............................................................................................ 26 实验十 小篮子法（广口瓶法）测定植物的呼吸速率 ........................................................................................ 28 实验十一 谷物淀粉含量的测定（旋光法） ........................................................................................................ 29 实验十二 类似生长素对种子萌发的影响 ............................................................................................................ 31 实验十三 赤霉素对α-淀粉酶的诱导形成 ........................................................................................................... 32 实验十四 植物光周期现象的观察 ........................................................................................................................ 34 实验十五 植物抗逆性的测定（电导仪法） ........................................................................................................ 35 实验十六 脯氨酸含量的测定 ................................................................................................................................ 36 试验十七 植物原生质体的分离和融合 ................................................................................................................ 38 主要参考文献 ........................................................................................................................................................... 40

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植物材料的采集、处理与保存

植物生理实验使用的材料非常广泛，根据来源可划分为天然的植物材料（如植物幼苗、根、茎、叶、花等器官或组织等）和人工培养、选育的植物材料（如杂交种、诱导突变种、植物组织培养突变型细胞、愈伤组织、酵母等）两大类；按其水分状况、生理状态可划分为新鲜植物材料（如苹果、梨、桃果肉，蔬菜叶片，绿豆、豌豆芽下胚轴，麦芽、谷芽，鳞茎、花椰菜等）和干材料（小麦面粉，玉米粉，大豆粉，根、茎、叶干粉，干酵母等）两大类，因实验目的和条件不同，而加以选择。

植物材料的采集和处理，是植物生理研究测定中的重要环节。在实际工作中，往往容易把注意力集中在具体的仪器测定上，而对于如何正确地采集和处理样品却不够注意，结果导致了较大的实验误差，甚至造成整个测定结果的失败。因此，必须对样品的采集、处理与保存给予足够的重视。

一、 原始样品及平均样品的采取、处理

植物生理研究测定结果的可靠性（或准确性），首先取决于试材对总体的代表性，如果采样缺乏代表性，那么测定所得数据再精确也没有意义。所以，样品的采集除必须遵循田间试验抽样技术的一般原则外，还要根据不同测定项目的具体要求，正确采集所需试材。目前，随着研究技术的不断发展，应该不断提高采样技术的水平。

在作物苗期的许多生理测定项目中都需要采集整株的试材样品，在作物中后期的一些生理测定项目中，如作物群体物质生产的研究，也需要采集整株的试材样品，有时虽然是测定植株的部分器官，但为了维持器官的正常生理状态，也需要进行整株采样。

除研究作物群体物质生产外，对于作物生理过程的研究来说，许多生理指标测定中的整株采样，也只是对地上部分的采样，没有必要连根采样，当然对根系的研究测定例外。采样时间因研究目的而不同，如按生育时期或某一特殊需要的时间进行。除逆境生理研究等特殊需要外，所取植株应是能代表试验小区正常生育无损伤的健康植株。

为了保证植物材料的代表性，必须运用科学方法采取材料。从大田或实验地、实验器皿中采取的植物材料，称为“原始样品”，再按原始样品的种类（如植物的根、茎、叶、花、果实、种子等）分别选出“平均样品”，然后根据分析的目的、要求和样品种类的特征，采用适当的方法，从“平均样品”中选出供分析用的“分析样品”。

（一）原始样品的取样法

1. 随机取样

在试验区（或大田）中选择有代表性的取样点，取样点的数目视田块的大小而定。选好点后，随机采取一定数量的样株，或在每一个取样点上按规定的面积从中采取样株。

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2. 对角线取样

在试验区（或大田）可按对角线选定五个取样点，然后在每个点上随机取一定数量的样株，或在每个取样点上按规定的面积从中采取样株。

（二）平均样品的取样法

1. 混合取样法

一般颗粒状（如种子等）或已碾磨成粉末状的样品可以采取混合取样法进行。具体的做法为：将供采取样品的材料铺在木板（或玻璃板、牛皮纸）上成为均匀的一层，按照对角线划分为四等分。取对角的两份为进一步取样的材料，而将其余的对角两份淘汰。再将已取中的两份样品充分混合后重复上述方法取样。反复操作，每次均淘汰 50 ％的样品，直至所取样品达到所要求的数量为止。这种取样的方法叫做“四分法”。

一般禾谷类、豆类及油料作物的种子均可采用这个方法采取平均样品，但注意样品中不要混有不成熟的种子及其他混杂物。

2. 按比例取样法

有些作物、果品等材料，在生长不均等的情况下，应将原始样品按不同类型的比例选取平均样品。例如对甘薯、甜菜、马铃薯等块根、块茎材料选取平均样品时，应按大、中、小不同类型的样品的比例取样，然后再将每一单个样品纵切剖开，每个切取 1/4 、 1/8 或 1/16 ，混在一起组成平均样品。

在采取果实的平均样品时，如桃、梨、苹果、柑橘等果实，即使是从同一株果树上取样，也应考虑到果枝在树冠上的各个不同方位和部位以及果实体积的大、中、小和成熟度上的差异，按各自相关的比例取样，再混合成平均样品。

（三）取样注意事项

1. 取样的地点，一般在距田埂或地边一定距离的株行取样，或在特定的取样区内取样。取样点的四周不应该有缺株的现象。

2. 取样后，按分析的目的分成各部分（如根、茎、叶、果等），然后捆齐，并附上标签，装入纸袋。有些多汁果实取样时，应用锋利的不锈钢刀剖切，并注意勿使果汁流失。

3. 对于多汁的瓜、果、蔬菜及幼嫩器官等样品，因含水分较多，容易变质或霉烂，可以在冰箱中冷藏，或进行灭菌处理或烘干以供分析之用。

4. 选取平均样品的数量应当不少于供分析用样品的两倍。

5. 为了动态地了解供试验用的植物在不同生育期的生理状况，常按植物不同的生育期采取样品进行分析。取样方法系在植物的不同生育时期先调查植株的生育状况并区分为若干类型，计算出各种类型植株所占的百分比，再按此比例采取相应数目的样株作为平均样品。

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二、分析样品的处理和保存

1 ．从田间采取的植株样品，或是从植株上采取的器官组织样品，在正式测定之前的一段时间里，如何正确妥善的保存和处理是很重要的，它也关系到测定结果的准确性。

一般测定中，所取植株样品应该是生育正常无损伤的健康材料。取下的植株样品或器官组织样品，必须放入事先准备好的保湿容器中，以维持试样的水分状况和未取下之前基本一致。否则，由于取样后的失水，特别是在田间取样带回室内的过程中，由于强烈失水，使离体材料的许多生理过程发生明显的变化，用这样的试材进行测定，就不可能得到正确可靠的结果。为了保持正常的水分状况，在剪取植株样品后，应立即插入有水的桶中，对于枝条，还应该立即在水中进行第二次剪切，即将第一次切口上方的一段在水中剪去，以防输导组织中水柱被拉断，影响正常的水分运输。对于器官组织样品，如叶片或叶组织，在取样后就应立即放入已铺有湿纱布带盖的瓷盘中，或铺有湿滤纸的培养皿中。对于干旱研究的有关试材，应尽可能维持其原来的水分状况。

采回的新鲜样品（平均样品）在做分析之前，一般先要经过净化、杀青、烘干（或风干）等一系列处理。 （ 1 ） 净化：新鲜样品从田间或试验地取回时，常沾有泥土等杂质，应用柔软湿布擦净，不应用水冲洗。

（ 2 ）杀青：为了保持样品化学成分不发生转变和损耗，应将样品置于 105 ℃的烘箱中烘 15min 以终止样品中酶的活动。

（ 3 ）烘干：样品经过杀青之后，应立即降低烘箱的温度，维持在 70 ～ 80 ℃，直到烘至恒重。烘干所需的时间因样品数量和含水量、烘箱的容积和通风性能而定。在无烘箱的条件下，也可将样品置蒸笼中以蒸汽杀青，而后于阴凉通风处风干。但在蒸汽杀青过程中，常有可溶性物质的外渗损失，因此，此法仅可作为测量大量样品干重时的变通方法，在进行成分分析时应尽量避免。烘干时应注意温度不可过高，否则会把样品烤焦，特别是含糖较多的样品，在高温下更易焦化。为了更精密地分析，避免某些成分的损失（如蛋白质、维生素、糖等），在条件许可的情况下最好采用真空干燥法。

此外，在测定植物材料中酶的活性或某些成分（如维生素 C 、 DNA 、 RNA 等）的含量时，需要用新鲜样品。取样时注意保鲜，取样后应立即进行待测组分提取；也可采用液氮中冷冻保存或冰冻真空干燥法得到干燥的制品。放在 0 ～ 4 ℃冰箱中保存即可。在鲜样已进行了匀浆，尚未完成提取、纯化，不能进行分析测定等特殊情况下，也可加入防腐剂（甲苯、苯甲酸），以液态保存在缓冲液中，置于 0 ～ 4 ℃冰箱即可。但保存时间不宜过长。

2 ．已经烘干（或风干）的样品，可根据样品的种类、特点进行以下处理：

（ 1 ） 种子样品的处理：一般种子（如禾谷类种子）的平均样品清除杂质后要进行磨碎，在磨碎样品前后都应彻底清除磨粉机（或其他碾磨用具）内部的残留物，以免不同样品之间的机械混杂，也可将最初磨出的少量样品弃去，然后正式磨碎，最后使样品全部无损地通过 1 mm 筛孔的筛子，混合均匀作为分析样品贮存于具有磨口玻塞的广口瓶中，贴上标签，注明样品的采取地点、试验处理、采样日期和采样人姓名等。

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长期保存的样品，贮存瓶上的标签还需要涂蜡。为防止样品在贮存期间生虫，可在瓶中放置一点樟脑或对位二氯甲苯。

对于油料作物种子（如芝麻、亚麻、花生、蓖麻等）需要测定其含油量时，不应当用磨粉机磨碎，否则样品中所含的油分会吸附在磨粉机上将明显地影响分析的准确性。所以，对于油料种子应将少量样品放在研钵内研碎或用切片机切成薄片作为分析样品。

（ 2 ）茎秆样品的处理：烘干（或风干）的茎秆样品，均要进行磨碎，磨茎秆用的电磨与磨种子的磨粉机结构不同，不宜用磨种子的电磨来磨碎茎秆。如果茎秆样品的含水量偏高而不利于磨碎时，应进一步烘干后再进行磨碎。

（ 3 ）多汁样品的处理：柔嫩多汁样品（如浆果、瓜、菜、块根、块茎、球茎等）的成分（如蛋白质、可溶性糖、维生素、色素等）很容易发生代谢变化和损失，因此常用其新鲜样品直接进行各项测定及分析。一般应将新鲜的平均样品切成小块，置于电动捣碎机的玻璃缸内进行捣碎。若样品含水量不够（如甜菜、甘薯等）可以根据样品重加入 0.1 ～ 1 倍的蒸馏水。充分捣碎后的样品应成浆状，从中取出混合均匀的样品进行分析。如果不能及时分析，最好不要急于将其捣碎，以免其中化学成分发生变化而难以准确测定。

有些蔬菜（如含水分不太多的叶菜类、豆类、干菜等）的平均样品可以经过干燥磨碎，也可以直接用新鲜样品进行分析。若采用新鲜样品，可采用上述方法在电动捣碎机内捣碎，也可用研钵（必要时加少许干净的石英砂）充分研磨成匀浆，再进行分析。

在进行新鲜材料的活性成分（如酶活性）测定时，样品的匀浆、研磨一定要在冰浴上或低温室内操作。新鲜样品采后来不及测定的，可放入液氮中速冻，再放入﹣70 ℃冰箱中保存。

供试样品一般应该在暗处保存，但是，对于供光合、蒸腾、气孔阻力等的测定样品，在光下保存更为合理。一般可将这些供试样品保存在室内光强下，但从测定前的 0.5 ～ 1.0 小时开始，应对这些材料进行测定前的光照预处理，也叫光照前处理。这不仅是为了使气孔能正常开放，也是为了使一些光合酶类能预先被激活，以便在测定时能获得正常水平的值，而且还能缩短测定时间。光照前处理的光强，一般应和测定时的光照条件一致。

测定材料在取样后，一般应在当天测定使用，不应该过夜保存。需要过夜时，也应在较低温度下保存，但在测定前应使材料温度恢复到测定条件的温度。

对于采集的籽粒样品，在剔除杂质和破损籽粒后，一般可用风干法进行干燥。但有时根据研究的要求，也可立即烘干。对叶片等组织样品，在取样后则应立即烘干。为了加速烘干，对于茎秆、果穗等器官组织应事先切成细条或碎块。

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实验一 拟南芥种植和形态观察

一、实验原理

拟南芥属(Arabidopsis thaliana）十字花科，被子植物门，双子叶植物纲。 二年生草本，高7～40厘米。基生叶有柄呈莲座状，叶片倒卵形或匙形；茎生叶无柄，披针形或线形。总状花序顶生，花瓣4片，白色，匙形。长角果线形，长1～1.5厘米。花期3～5月。我国内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有发现。拟南芥的优点是植株小（1个茶杯可种植好几棵）、每代时间短（从发芽到开花不超过6周）、结子多（每棵植物可产很多粒种子）、生活力强（用普通培养基就可作人工培养）。拟南芥的基因组是目前已知植物基因组的1/80，这就使克隆它的的有关基因相对说来比较容易。拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。例如用含杀草剂的培养基来筛选，一般获得抗杀草剂的突变率是1/100000。由于上述这些优点，所以，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料：拟南芥种子

（二）试剂： PNS营养液（1L）

母液 母液1 母液2 母液3 母液4 母液5 母液6 PNS营养液母液配方 母液1：1M KNO3 101.1g

母液2：1M Ca(NO3)2˙4H2O 236.15 g 母液3：1M MgSO4˙7H2O，246.48 g 母液4：20mM Fe.EDTA： FeSO4 5.57g EDTA 7.45g

注意先各自配成溶液，再混合。 母液5：1M磷酸缓冲液（pH5.5）： 磷酸二氢钾 130.4g 磷酸氢二钾 9.12g 母液6：MS 微量元素

毫升 5 2 2 2.5 2.5 1 7

硼酸 0.434g 硫酸锰（MnSO4 H2O） 1.7626g CuSO4˙H2O 0.0798g ZnSO4˙7H2O 0.172g NaMoO4˙2H2O 0.0432g NaCl 0.585g CoCl˙6H2O 0.00129g

以上母液均配至1L，配制时使用灭菌的双蒸水。配制后4℃冰箱中保存备用。 人工土：3份蛭石，1份珍珠岩和1份黑土混合。

（三）仪器设备：培养皿，镊子，托盘，保鲜膜，花盆，人工气候箱。 三、实验步骤

1. 将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，并用保鲜膜罩上。两天后光照，三天后揭膜。

2. 人工培养室条件：相对湿度80%，恒温20-24C，光照强度80-200umol/M/S，光照周期为8 h黑暗﹑16 h光照培养。 四、实验结果

每隔三天观察生长情况，并适时浇水。按照下表记录拟南芥的生长情况。 第1天 第4天 第7天 第10天 第13天 第16天 第19天 第22天 第25天 第28天 第31天 第34天 第37天 第40天 第43天 第47天 第50天 第53天 第56天 第60天 五、思考题

1.绘制拟南芥的株高的生长曲线。 2.为什么说拟南芥是模式植物？ 3.拟南芥的特点？

株高（cm） 叶片 花 果荚 收获 0

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实验二 植物细胞的活体染色和死活的鉴定

一、原理

用某种对植物无害的染料稀溶液对活细胞进行染色称活体染色。中性红（2-甲基-3-氨基-6-二甲氨基二氮杂蒽盐酸盐, 3-氨基-6-二甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐，Neutral red,Neutral red chloride, Toluylene red, Aminodimethylaminotoluaminozine, 3-Amino-6-dimethylamino-2-methylphenazine hydrochloride。分子式：C15H17ClN4；分子量：288.78。）是常用的活体染料之一。深绿色、棕色或浅黑色结晶粉末。溶解度为水4.0％，无水乙醇1.8％，乙二醇乙醚3.75％，乙二醇3.0％。几乎不溶于二甲苯，其水溶液或乙醇溶液呈红色。中性红是一种弱碱性染色剂，变色范围在pH6.4～8.0之间（由红变成黄）。在中性或微碱性环境下，植物的活细胞原生质能大量吸收中性红并向液泡排泄，液泡一般呈酸性，中性红解离出大量阳离子而呈樱桃红色，而原生质及壁不染色；死细胞的液泡已消失因而不产生液泡着色现象，中性红阳离子却与带一定负电荷的原生质及细胞核结合而使原生质及细胞核染色。

成长的细胞是一个渗透系统，活的原生质具有选择透性，原生质内部包含着一个大液泡，具有一定的溶质势。当细胞与外界低水势溶液接触时，细胞内的水分外渗，原生质随着液泡一起收缩而发生质壁分离；其后，当与清水（或高水势溶液）接触，细胞又因液泡的吸水膨胀而发生质壁分离复原。死细胞因其原生质的选择透性已遭破坏，故与低水势溶液接触时不产生质壁分离。 二、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：洋葱；

2. 仪器设备：不锈钢单面刀片；镊子；吸水纸；酒精灯；载玻片；盖玻片；胶头滴管；显微镜； 3. 试剂：0.8mol · L 蔗糖液；0.1％中性红溶液母液。 三、实验步骤 1. 制片染色

选择一片比较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧割划成0.5cm2左右的小块，用用尖头镊子轻轻地撕取洋葱（玉葱）鳞片内表皮薄片，浸到0.03％中性红溶液中10～15min进行染色。 2. 观察

2.1 将染色后的植物材料放到载玻片上，用弱碱性水略加清洗后，盖好盖玻片，在盖玻片的一侧滴加无离子水（或pH略高于7.0的自来水），然后在显微镜下观察，可以看出液泡染成樱桃红色；原生质层（细胞质和细胞）则无色透明紧贴细胞壁（注意：在细胞的角隅上可以看见）。

2.2 在第1项观察后，接着从盖玻片的一边滴2滴0.8mol·L蔗糖液, 在盖玻片的另一边用吸水纸吸盖玻片下的水，将蔗糖液引入盖玻片下浸渍植物材料，并立即镜检，可以看到细胞很快发生质壁分离。先是凹形质壁分离，而后变为凸形质壁分离。

2.3 在第2项观察后，接着在盖玻片的一边加入2～3滴去离子水，在另一边用吸水纸吸去糖液，将去离子水引入盖玻片底，立即镜检可以看到带有液泡的原生质体重新吸水膨大，最后充满整个细胞腔，即质壁分离复原（复原缓慢进行时，细胞仍可正常存活；如果进行很快，则会因原生质机械破坏而死亡，注意观察机械损伤的细胞的特点）。

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2.4 将一片经中性红染色的植物材料放在载玻片上，加一滴无离子水后加盖玻片，在酒精灯火焰上微微加热，然后在显微镜下观察，可以看到细胞质凝结成不均匀的凝胶状，与细胞核一起染成红色。然后按(2.2)法加0.8mol·L蔗糖液也不发生质壁分离。 四、实验结果 收集照片。

五、思考题 1.活体细胞观察应该注意什么？2.机械损伤后的细胞有什么特点？

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实验三 植物细胞渗透势的测定（质壁分离法）

一、原理

植物细胞的渗透势主要取决于液泡的溶质浓度，因此又称溶质势。渗透势与植物水分代谢、生长及抗逆性等有密切关系。已知在干旱、盐渍等条件下，一些植物常在细胞内主动积累溶质，以降低其渗透势，增加吸水能力，而在一定程度上维持细胞膨压，保障细胞的生长和气孔的开放，这种现象叫做渗透调节作用。渗透调节能力的大小可以用逆境条件下细胞的渗透势的降低值来表示，在水分生理与抗逆性生理研究中经常需要测定植物细胞的渗透势。

将植物组织放入一系列不同浓度的蔗糖溶液中，经过一段时间，植物细胞与蔗糖溶液间将达到渗透平衡状态。如果在某一溶液中细胞脱水达到平衡时刚好处于临界质壁分离状态，则细胞的压力势（ Ψ p ） 将下降为零。此时细胞液的渗透势（ Ψ s ） 等于外液的渗透势 Ψ s 0 。此溶液称为该组织的等渗溶液，其浓度称为该组织的等渗浓度，即可计算出细胞液的渗透势（ Ψ s ）。实际测定时，因为临界质壁分离状态难以在显微镜下直接观察到，所以一般均以初始质壁分离作为判断等渗浓度的标准。处于初始质壁分离状态的细胞体积，比吸水饱和时略小，故细胞液浓缩而渗透势略低于吸水饱和状态时的渗透势称基态渗透势。 二、实验材料、试剂与仪器设备

（一）实验材料 紫皮洋葱鳞茎 （二）试剂

1 ． 1 mol/kg 蔗糖水溶液：称取预先在 60 ～ 80 ℃下烘干的蔗糖 34.2 g 溶于 100 g 蒸馏水中，即为 1 质量摩尔浓度的蔗糖溶液。

2 ． 0.03 ％中性红溶液。

3 ．蔗糖系列标准液：取干燥洁净的小试剂瓶7支编号，用 1 mol/kg 蔗糖水溶液依据 C1 V1 =C 2 V2 公式配制0.35 mol/kg 、 0.40 mol/kg 、 0.45 mol/kg 、 0.50 mol/kg 、 0.55 mol/kg 、 0.60 mol/kg 、 0.65 mol/kg 等一系列不同浓度的蔗糖水溶液（具体范围可根据材料不同而加以调整），贮于试剂瓶中，瓶口加塞以防蒸发浓缩。 取不同浓度的蔗糖溶液个10ml称重，计算其密度。

（三）仪器设备

显微镜，载玻片，盖玻片，温度计，尖头镊子，刀片，直径 6 cm小培养皿，试剂瓶若干，烧杯，容量瓶，量筒，吸管，吸水纸适量。 三、实验步骤

1 ．取干燥、洁净的培养皿 7 套编号，将配制好的不同浓度的蔗糖溶液约5ml按顺序加入各培养皿，使之成一薄层，盖好皿盖备用。

2 ．用镊子撕取（或用刀片刮取）供试材料的表皮，大小约 0.5 cm 2 ，迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，每一浓度 4～5 片。同时记录室温。为了便于观察，可先将切片于0.03% 中性红内染色 5 min 左右，吸去水分，再浸入蔗糖溶液中，但如不染色即能区别质壁分离时，仍以不染色为宜。

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3 ． 5～10 min 后，取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的制片作同样观察，并记录质壁分离的相对程度。如果在两个相邻浓度的切片中，一个没有发生质壁分离或质壁分离的细胞不足50%，另一个发生质壁分离的细胞数超过50%，则可粗略地将这两个浓度的平均值作为其等渗浓度，也可用插值法更准确地确定等渗浓度。每一制片观察的细胞不应少于 100 个。检查时可先从中间浓度开始。

在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直至有把握确定为止。在此条件下，细胞的渗透势与两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等。

4．也可用CaCl2或NaCl代替蔗糖，但须改变式中等渗系数。CaCl2的i值可用2.6，NaCl一般为1.8 。 将结果记录于下表中。

植物细胞渗透势测定记载表

实验人 日期 材料名称 实验室温度

蔗糖浓度（ mol/kg ） 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 四、结果计算

由所得到的等渗浓度和测定的室温，用下式计算供试溶液的渗透势（ Ψ s 0 ），即为细胞的渗透势（ Ψ s ）。

Ψ s （ MPa ） = Ψ s 0 = - iCRT

式中， Ψ s 0 ——供试溶液的渗透势， MPa 。

i ——解离系数，蔗糖 =1 。

C ——供试溶液的浓度， mol/L （以水作溶剂）。

R ——气体常数， 0.008314[L · MPa ／（ mol · K ） ] 。 T ——绝对温度，（ 273 + t ℃）， K 。

五、思考题

1、某种植物叶片吸水饱和时的渗透势经测定为﹣0.8MPa ，现用质壁分离法测出其渗透势为﹣0.9MPa ，请计算质壁分离状态的细胞液体积相当于饱和时的百分数。

2、试问不同植物材料得渗透势是否相同？

渗透势（ Mpa ） 质壁分离细胞数/总细胞数*100% 12

实验四 植物组织水势的测定（小液流法）

一、 原理

水势（water potential）表示水分的化学势,象电流之由高电位处流向低电位处一样，水从水势高处流向低处(代表水的能量水平)。植物体组织之间，细胞之间以及植物体及环境间的水分移动方向都由水势差决定。当植物细胞或组织放在溶液中时，如果植物的水势小于溶液的渗透势(溶质势)，则组织吸水而使溶液浓度变大；反之,则植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小；若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，外部溶液浓度不变，此溶液的渗透势即等于所测植物的水势。可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液浓度的变化。然后根据公式计算其渗透势。因溶液的浓度是已知的，可以根据公式算出其渗透压，取其负值，为溶液的渗透势（ψπ），即代表植物的水势（ψw）。

ψw＝ψπ＝－P＝－iCRT（大气压）

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：小白菜叶片

（二）仪器设备：具塞小瓶12个、带有橡皮管的注射针头、镊子、打孔器培养皿。 （三）试剂： 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mol/L蔗糖溶液；甲烯蓝粉末。 三、实验步骤

（一）取干燥洁净的具塞小瓶6个为甲组，各瓶中分别加入0.05～0.30mol/L蔗糖溶液约4ml（约为小瓶的2／3处），另取6个干燥洁净的小瓶为乙组，各瓶中分别加入0.05～0.30mol/L蔗糖溶液1ml和微量甲烯蓝粉末着色，上述各瓶加标签注明浓度。（二）取待测样品的功能叶数片，用打孔器打取小圆片约50片，放至培养皿中，混合均匀。用镊子分别夹入5～8个小圆片到盛有不同浓度的甲烯蓝蔗糖溶液的小瓶中（乙组）。盖上瓶塞，并使叶圆片全部浸没于溶液中。放置约30～60min，为加速水分平衡，应经常摇动小瓶。（三）经一定时间后，用注射针头吸取乙组各瓶蓝色糖液少许，将针头插入对应浓度甲组小瓶溶液中部，小心地放出少量液流，观察蓝色液流的升降动向。（每次测定均要用待测浓度的甲烯蓝蔗糖溶液清洗几次注射针头）。如此方法检查各瓶中液流的升降动向。若液流上升，说明浸过小圆片的蔗糖溶液浓度变小（即植物组织失水）；表明叶片组织的水势高于该浓度糖溶液的渗透势；如果蓝色液流下降则说明叶片组织的水势低于该糖溶液的渗透势，若蓝色液流静止不动，则说明叶片组织的水势等于该糖溶液的渗透势，此糖溶液的浓度即为叶片组织的等渗浓度。 四、结果计算

将求得的等渗浓度值代入如下公式：

ψw＝ψπ＝－iCRT

式中：ψw＝植物组织的水势（单位：Mpa）；ψπ＝溶液的渗透势；C＝等渗浓度（mol/L）；R＝气体常数（0.008314MPa/L/mol/K）；T＝绝对温度；i＝解离系数（蔗糖＝1，CaCl2＝2.60） 五、思考题

1、 测定同一植物上部及下部叶片的水势有何差别？

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2、 用小液流法测定植物组织水势与用质壁分离法测定植物细胞渗透势都是以外界溶液的浓度算出的

溶质势为根据，它们之间的区别何在？

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实验五 植物根系活力的测定（TTC法）

植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量水平。本实验练习测定根系活力的方法，为植物营养研究提供依据。 一、 原理

氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲瓒，生成的三苯甲瓒比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。

(TTC) (TTF)

二、材料、设备仪器及试剂

（一）材料：水培小麦根系。

（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 分析天平（感量0.1mg）；3. 电子顶载天平（感量0.1g）；4. 温箱；5. 研钵；6. 三角瓶50ml；7. 漏斗；8. 量筒100ml；9. 吸量管10ml；10. 刻度试管10ml；11. 试管架；12. 容量瓶10ml；13. 药勺；14. 石英砂适量；15. 烧杯10ml、1000ml。

（三）试剂：

1、 乙酸乙酯（分析纯）。

2、次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末。

3、1％TTC溶液 准确称取TTC1.0g，溶于少量水中，定容到100ml。用时稀释至各需要的浓度。 4、磷酸缓冲液（1／15mol/L，pH7）。

5、1mol/L硫酸 用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml。

6、0.4mol/L琥珀酸 称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。 三、实验步骤

1. 定性测定

（ 1 ）配制反应液 把 1 ％ TTC 溶液、 0.4 mol ／ L 的琥珀酸和磷酸缓冲液按 1:5:4 比例混合。 （ 2 ）把根仔细洗净，把地上部分从茎基部切除。将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置 37 ℃左右暗处放 1 ～ 3 h ，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。

2. 定量测定

CNNNN+HNNCl+2HCNN+HCl 15

（1）TTC标准曲线的制作 取0.4％TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲攒。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲攒25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

（2）称取根尖样品0.5g，放入10ml烧杯中，加入0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸与根样品，10分钟以后再加其他药品，操作同上）。

（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲攒。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。 四、结果计算

四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/h）＝四氮唑还原量（mg）/[根重（g）×时间(h)] 五、思考题

1、为什么要测定根系活力 ? 植物的根与地上部分有何关系 ? 2、植物根系活力的测定为什么要以杀死根系作为空白对照

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实验六 根系总吸收面积和活跃吸收面积的测定

植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量水平。本实验学习测定根系吸收面积和活力的方法。 一、原理

根据植物矿质吸收的理论，植物对溶质的最初吸收具有吸附的特性，并假定这时在根系表面均匀地覆盖了一层被吸附物质的单分子层，因此可以根据根系对某种物质的吸附量来测定根的吸收面积。常用甲烯蓝作为被吸附物质，它的被吸附量可以根据供试液浓度的变化用比色法准确地测出。已知1mg甲烯蓝成单分子层时所占面积为1.1m2，据此即可求出根系的总吸收面积。当根系在甲烯蓝溶液中已达到吸附饱和而仍留在溶液中时，根系的活跃部分能把原来吸附的物质吸收到细胞中去，因而继续吸附甲烯蓝。从后一吸附量求出活跃吸收面积，可作为根系活力指标。 二、仪器与试剂

分光光度计1台、50ml烧杯3只、20或50ml量筒1个（依根系大小而定）、移液管1ml 1支，10ml 1支、试管（15×150mm）10支、容量瓶1000ml 1个、100ml 1个、吸水纸适量、试管架1个。

0.0002mol/L甲烯蓝溶液：精确称取74.8mg甲烯蓝（C16H18N3SCl·3H2O），加水溶解，定容至1000ml。此溶液每ml含甲烯蓝0.0748mg。

0.010mg/ml的甲烯蓝溶液：用刻度吸管吸取0.0002mol/L甲烯蓝13.37ml定容至100ml，摇匀即成。 三、方法

1．植物材料的准备 本实验最好采用水培玉米，以获得完整而无损伤的根系。玉米根系发达，是较好的材料。田间栽培的材料因不可能无损地挖出全部根系，最好避免在正式试验中使用。

2．甲烯蓝溶液标准曲线的制作 取试管7支编号，按表14-1次序加入各溶液，即成甲烯蓝系列标准液。

表1 各试剂加入顺序

试 管 号

0.01mg/ml甲烯蓝溶液(ml) 蒸馏水(ml) 甲烯蓝浓度mg/ml

以第1管（水）为参比在分光光度计下比色，取波长660nm，读出光密度，以甲烯蓝浓度为横坐标，光密度为纵坐标绘成标准曲线。

3．取待测植物根系用滤纸将水吸干再用排水法在量杯或量筒中测定其根系体积。把0.0002mol/L甲烯蓝溶液分别倒在三个编号的小烧杯里，每杯中溶液量约10倍于根的体积，准确记下每杯的溶液用量。

4．取根系，用吸水纸小心吸干数次，慎勿伤根，然后顺次浸入盛有甲烯蓝溶液的烧杯中，每杯中浸1.5min。注意每次取出时都要使甲烯蓝溶液能从根上流回到原烧杯中。

测定根系吸收面积记载表 1 0 10 0

2 1 9 0.001

3 2 8 0.002

4 4 6 0.004

5 6 4 0.006

6 8 2 0.008

7 10 0 0.01

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植物名称 杯中甲烯蓝溶液量(ml) 开始时甲烯蓝浓度(mg/ml) 浸根后 溶液浓度 (mg/ml) 被吸收的 甲烯蓝量 (mg) 根体积(ml) 总的 根吸收 面积m2 活跃的 活跃/总的(%) 总的 活跃的 烧杯1 烧杯2 烧杯3 烧杯1 烧杯2 烧杯1＋2 烧杯3 比表面

5．从三个烧杯中各取1ml溶液加入试管，均稀释10倍，测得其光密度，查标准曲线，求出每杯浸入根系后溶液中剩下的甲烯蓝毫克数。 四、结果计算

把结果记入上表，并以下式求出根的吸收面积：

总吸收面积（m2）= [(C1－C1ˊ)×V1] ＋ [(C2－C2ˊ)×V2]×1.1 活跃吸收面积（m2）= [(C3－C3ˊ)×V3]×1.1 活跃吸收面积（%）=活跃吸收面积/总吸收面积×100 比表面＝根的总吸收面积/根的体积 式中 C—溶液原来的浓度mg/ml； Cˊ—浸提后的浓度mg/ml； 1,2,3—烧杯编号

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实验七 离体叶绿体的制备以及完整度的测定

一、实验原理

叶绿体是植物进行光合作用的细胞器，分布在叶肉细胞内（组成气孔的保卫细胞也含有叶绿体）。叶绿体是由被膜、间质和类囊体三部分组成。依据分离所得叶绿体的结构完整程度，大致将叶绿体分成两类：一类为被膜已破碎的叶绿体，称之为破碎叶绿体，它具有光合电子传递、光合放氧和光合磷酸化的功能；另一类为被膜完整的叶绿体，它具有同化二氧化碳的完全的光合作用功能。分离和制备有活性的离题叶绿体是研究叶绿体的结构功能、光合作用原理及遗传控制机理的前提。要分离有活性、较纯的完整叶绿体相当困难，有些植物叶片细胞的细胞比较厚，叶绿体不易从细胞中分离出来；有些植物叶绿体外膜极易破损，有些植物叶片细胞中含有某些内源性抑制物质。例如：水解酶、氧化酶等，在制备过程中极易释放出来，破坏叶绿体的结构和活性。因此，不是所有的高等植物都适合用来分离和制备叶绿体，最常用的植物材料有菠菜、豌豆、玉米、甜菜、大麦等。此外，低等植物如衣藻、小球藻等也是常用的材料。 叶绿体遗传转化技术作为一项新技术近年来为植物基因工程提供了一条新途径。但叶绿体一旦离体，其翻译活性在15～30min 后就可能完全丧失。叶绿体是绿色植物细胞中典型的细胞器，可通过研磨叶片并匀浆后，根据其颗粒大小经过滤、差速离心加以分离。分离叶绿体应在等渗溶液中制备，以减少渗透压对叶绿体的伤害。整个分离过程应在0~4℃下进行，所有提取物、溶液和材料，也应保存在该温度下备用。叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，分离工作应尽可能在短时间内完成。下面分别介绍这两类叶绿体的制备以及被膜完整度的测定。

分离和制备叶绿体的方法很多，目前最常用且较方便的是分步差速离心的方法。一般叶绿体的直径约为几个微米，因此细胞破碎后在一定的离心力范围内即能分离获得叶绿体。 二、实验材料、试剂与仪器设备

1.器材与试剂 (1) 器材

普通离心机(最好带有水平离心头)、研钵或电动捣碎器、分光光度计、冰箱、扭力天平、 pH计、量筒、移液管、离心管、脱脂纱布等。 (2) 试剂

①提取液 O.4 mol/L蔗糖，O.O5 mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，0.01mol/L NaCl(简称STN溶液，STN液(蔗糖0.4mol·L-1，Tricine 20mmol·LpH 7.8， NaCl 10mmol·L)。将137g 蔗糖、3.58g Tricine(三羟甲基甘氨酸)、0.58g NaCl溶于800ml左右水中，用NaOH溶液调至pH 7.8，加水至1000ml。STN液置0-4℃冰箱中备用。) ②80%的丙酮 三、实验步骤

(1)叶绿体制备

取菠菜、豌豆或小麦苗等新鲜叶片，洗净后去除中脉，置于研钵或捣碎器中，加人冰冷的提取液，每10g叶片约加20m1冰冷的STN溶液。用手工研磨或用电动捣碎器捣碎，使叶片捣碎至碎米粒样大小，经过4层纱布

-1

-1

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过滤，滤液先以200×g离心1min，4℃，去除粗粒沉淀，上层液再以1000×g离心3min，4℃，倒掉上层液，沉淀为叶绿体。用少量STN溶液悬浮叶绿体，悬浮时可用棉球分散沉淀，并通过棉球吸取，以过滤叶绿体结块，叶绿体悬浮液置于冰浴中备用。 (2)叶绿素浓度测定

取叶绿体悬浮液0.1m1，加4.9 m1 80%的丙酮，摇匀后于1000×g离心2min，上清液置于l cm光径的比色杯，在波长为652nm处的分光光度计上比色。再按下列公式计算：652nm光密度读数(OD值)×50/34.5＝叶绿素mg/ml叶绿体悬浮液。 注意事项

(1)提取叶绿体操作都在低温下进行，所用器皿都需预冷。

(2)叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，操作尽可能迅速，分离工作尽可能在短时间内完成。

(3)破碎的叶绿体制剂储存在液氮中，其Hill反应活性可保持较长时间，储存时叶绿体的浓度宜浓些(约3～4mg叶绿素/m1)，并加25%体积的甘油。 完整叶绿体的制备

分离方法一般有两种，一是酶消化方法，把叶片表皮撕去后，用纤维素酶和果胶酶消化细胞壁，得到原生质体，再把原生质体通过尼龙网小孔(孔径20μm)，使原生质体破裂而释放出完整叶绿体，但此方法分离得到的叶绿体数量有限。另一种是用机械方法，先用捣碎机破碎叶片，再分步离心，可以大量制备叶绿体。这里主要介绍离心法分离完整叶绿体。 1.器材与试剂 (1)器材

普通离心机(需带有水平离心头)，或低温离心机、电动捣碎器、照光装置、氧电极测氧装置等。 (2)试剂

①提取液：含0.33mol/L山梨醇，0.05 mol/L MES (pH 6.1)，0.01 mol/L NaCl，2mmol/L MgC12，2 mmol/L EDTA-Na2，0.5 mmol/L KH2P04，2 mmol/L抗坏血酸钠(抗坏血酸钠宜在使用前现配现加)

②涨破叶绿体的Hill反应速率测定液：0.05 mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L NaCl，10 mmol/L K3Fe(CN)6。10 mmol/L NH4C1 ③0.66 mol/L山梨醇

④Percoll(一种具有高密度和低渗透势的二氧化硅溶胶) percoll本身是低渗透压的，要用高渗透压溶液配成生理等渗透压溶液，然后使用，不然，细胞容易破裂。一般是先用9份Percoll与1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。即取Percoll原液与10倍浓缩的PBS以9：1的比例混合，此时溶液 为100％ Percoll，比重是1.127，毫克分子渗透压浓度为290mOsmol/kg Percoll浓70 60 50 40 30 20 20

实验十六 脯氨酸含量的测定

脯氨酸（proline，Pro）为α-氨基酸之一。L化合物为明胶、麸蛋白（麦醇溶蛋白）、玉米醇溶蛋白、鲱精蛋白、鲑精蛋白、酪蛋白等多种蛋白的组成成分，特别是明胶中最多（约占20％）。脯氨酸是唯一的醇性氨基酸，易溶于水。在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 一、原理

磺基水杨酸为白色结晶或结晶性粉末，能溶于乙醚，易溶于水和乙醇，高温时则分解，若带有微量铁离子时为粉红色结晶体。用磺基水杨酸溶液提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。 二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。

（二）仪器设备： 722型分光光度计、研钵、 100ml小烧杯、容量瓶、 大试管、普通试管、移液管、注射器、水浴锅、漏斗、漏斗架、滤纸、剪刀。

（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。 三、实验步骤

1. 标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。

2. 样品的测定（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，

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静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。 四、结果计算

根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（Xμg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：

脯氨酸含量（μg/g）＝[X×5/2]/样重（g）。

五、思考题

比较不同逆境条件下植物体内的脯氨酸含量，测定脯氨酸含量有何意义？

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试验十七 植物原生质体的分离和融合

一、实验目的：

1、掌握原生质体分离的方法；

2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。 二、实验原理：

植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远源杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远源基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。1954年，植物单细胞培养才获得成功。Mllir培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；1960年，Jone等建立了微室培养法。童年，Cocking应用酶法分离原生质获得成功，从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。随着多种适用原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，现在常用的原生质体培养方法有：液体浅层培养法、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等。

植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。由于原生质体内 部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液 的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质 体的影响。测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双 醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。 一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生 具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原 生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力 的原生质体不能分解FAD无荧光产生。许多化学、物理学和生物学方法可诱导原生质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高钙高pH法和电融合法；聚乙二醇（PEG）作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高钙高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。聚乙二醇（PEG）诱导如何的机理：聚乙二醇（PEG）由于含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当聚乙二醇（PEG）分子足够长时，可作为临近原生质表面之间的分子桥而使之粘连、聚乙二醇（PEG）也能连接钙等阳离子，钙可在一些负极化基团和聚乙二醇（PEG）之间形成桥，因而促进粘连。从而引起原生质体融合：高钙高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时渗透压冲击也可能起作用。原生质体分离纯化后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法时原生质体培养中 最基础也是最关键的环节。PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接

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触点处质膜的脂 类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用， 从而使细胞发生融合。该方法的优点是： 用法简单，容易获得融合体，融合效果好。 三、实验材料、试剂与仪器设备： （一）实验材料： （1）韭菜或大蒜叶； （2） 红辣椒 （二）试剂： （1）20%蔗糖； （2）13%CPW洗液：

27.2mg/L 磷酸二氢钾（KH2PO4） 101.0mg/L 硝酸钾（KNO3）

1480.0mg/L 两个结晶水的氯化钙（CaCl22H2O） 246.0mg/L 硫酸镁（MgSO4） 0.16mg/L 碘化钾（KI） 0.025mg/L 硫酸铜（CuSO4） 13%W/V 甘露醇 pH6.0 （3）酶液： 1% 纤维素酶 1% 果胶酶 0.7M 甘露醇

0.7mM 磷酸二氢钾（KH2PO4）

10mM 两个结晶水的氯化钙（CaCl22H2O） pH6.8-7.0 （4）40% PEG液：

40% PEG液（MW 1500-6000） 0.3M 葡萄糖

3.5mM 两个结晶水的氯化钙（CaCl22H2O） 0.7mM 磷酸二氢钾（KH2PO4）。

（三）仪器设备：350目网，离心机，试管，离心管，吸管，显微镜，恒温水浴锅。 四、实验步骤：

植物原生质体的分离与纯化

1、将撕去表皮的植物叶片或花瓣置于酶液（pH 6.9,去表皮面接触酶液），在25℃黑暗条件下，酶解1～2小时。

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2、用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。

3、在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。 红辣椒800转/分离心5分钟。加入3～4ml13%CPW洗液，相同条件下离心 ，弃上清液。加1ml13%CPW洗液悬浮。

4、蔗糖漂浮法去除碎片。 蔗糖漂浮方法：

（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界面).

(2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处，

(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心（镜检决定是否需要离心），离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。 细胞融合

1.不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min； 2.融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。 五、实验结果：

用光学显微镜或倒置显微镜(高倍) 观察2-3个细胞靠近或融合的过程。（ 观察时注意不同程度的融合现象。通常分为五个阶段。①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。） 六、思考题

1.绘制原生质体融合的基本过程； 2.简述细胞融合的原理

3.做细胞融合实验时，应注意哪些问题？

主要参考文献

《现代植物生理学实验指南》 中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会编，科学出版社 1999年

《生物生产力和光合作用测定技术》科学出版社1986年

《植物生理生化实验原理和技术》 李合生主编 高等出版社 2000年

40

度(％) 比重g／ml 2.操作方法

(1)采摘新鲜菠菜或豌豆叶片

菠菜要选择嫩而厚，无显著皱纹的叶片，最好在早晨摘取，以免日照后在叶绿体内积累淀粉，不利于完整叶绿体的分离。豌豆也要选择嫩而厚的叶片，摘取后应尽快使用。叶片先在强光下照射15～20min，用以激活叶绿体，尤其用在完整叶绿体的以二氧化碳为底物放氧活性测定时，能使其缩短光合作用诱导期。为了防止强光照射下的温度上升，可把叶片铺放在冰块上，并在光源与叶片之间放隔水层。 (2)叶绿体制备

叶片去除叶柄及中脉后，以每10g叶片约加20～30ml冰冷的提取液。在电动捣碎器上高速捣碎，约2s/次，间隔捣碎3～4次，使叶片碎成绿豆粒样大小，然后经4层纱布过滤，去除残渣。注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体被膜破碎。滤液以1000×g离心，4℃，将离心管放人离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值，经约30s后再很快使其下降停止，整个离心程序大约用2～3min左右完成。小心地倒出上清液，先用少许提取介质漂洗去沉淀表面的浮物，再加入悬浮介质：即把提取介质中的MES换成HEPES(pH7.6)，悬浮叶绿体，在分散叶绿体沉淀时宜使用毛笔轻轻刷之，或者用手握住离心管，在冰块之间搅动，使叶绿体由于振动而分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓一些(含叶绿素2 mg/ml以上)，这样有利于其活性的保持。

(3)叶绿体被膜完整率的进一步提高

上述方法所得叶绿体被膜完整率一般约在60%左右，好的时候也可达到70%以上。如果需要进一步提纯，一种简单的方法是再次用悬浮介质洗涤叶绿体，并用同样离心方法沉淀叶绿体，把破碎的叶绿体漂洗去，起着浮选作用，但用此方法提高被膜完整率的程度有限，而且叶绿体损失也多。另一种方法是用Percoll作为密度梯度介质，方法是将3m1含有80% Percoll(以原液为100%浓度，用水稀释)，铺在10ml体积的离心管下层，再把3m1 40%Percoll铺在离心管的中层，然后将lml叶绿体悬浮液轻轻地铺在离心管的上层，用水平离心头的离心机在1500×g下离心2～3min，注意此时离心机的加速一定要缓慢上升，而下降时也要缓慢停下，否则会破坏Percoll的浓度梯度层的形成，取出离心管可以看到有3层绿色带，最上层的为破碎叶绿体，沉在底层的为粗颗粒，而40%～80% Percoll之间的界面上有一绿色层，是完整叶绿体，小心地将它吸取出来，转移到叶绿体悬浮介质里。此部分叶绿体的被膜完整率可达95%以上，有时甚至100%。Percoll介质可以重复使用，把密度梯度离心用过以后的40%和80% Percoll，分别吸取出来，存储于冰箱中以备下次使用。如果制备完整叶绿体的目的只是为了供叶绿体DNA的分离所用，则主要获得被膜完整率高的叶绿体制剂即可，不必考虑叶绿体同化二氧化碳的活性，因此提取介质可改用简单的STN溶液，但是操作顺序需按照制备完整叶绿体的方法，再用Percoll作密度梯度离心提纯。 叶绿体被膜完整率的测定：

由于铁氰化钾不能透过叶绿体被膜，故完整叶绿体在等渗条件下不能进行铁氰化钾光还原的反应，而被膜破碎的叶绿体，铁氰化钾可进入叶绿体进行反应，利用此原理来比较被膜破碎与未破碎叶绿体的Hill反

1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031 21

应速率的差别，就可测出叶绿体中被膜的完整率。被膜未破的叶绿体的Hill反应速率测定，是将上述被膜涨破叶绿体的Hill反应速率测定液，先以1：1体积与0.66 mol/L山梨醇混合，使之保持0.33 mol/L山梨醇浓度，再加入叶绿体(每毫升反应液约含叶绿素50μg)，用氧电极方法测定Hill反应速率(参阅氧电极测氧方法)。被膜破碎的叶绿体Hill反应速率测定，是先与不含山梨醇的Hill反应液混合，使被膜在低渗介质下胀破，再以1：1体积与0.66mol/L山梨醇混合，使测定时也保持0.33mol/L山梨醇浓度，在相同条件下测定Hill反应速率。被膜完整率的计算如下：

被膜完整率(%)＝[（被膜涨破叶绿体的Hill反应速率－完整叶绿体的Hill反应速率）/被膜涨破叶绿体的Hill反应速率 ]×100 测定计算实例见下图：

图8用铁氰化钾作Hill氧化剂检测叶绿体完整度记录图 被膜完整率(%)＝(150－8)/150 ＝94.7%

四、实验结果 按照上述的图表记录实验结果并计算。 五、思考题

1. 被膜完整的叶绿体与破碎的叶绿体在功能上有什么区别？ 2.在本实验中山梨醇的作用？ 3.本实验中铁氰化钾的作用？

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实验八 叶绿体色素的提取、分离和理化性质

I 叶绿体色素的提取与分离

一、原理

叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间层析后，可将各种色素分开。 二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：菠菜叶片

（二）仪器设备：研钵、漏斗、100ml三角瓶、 剪刀、 滴管、 培养皿（直径11cm）、康维皿或平底短玻管、圆形滤纸（直径11cm）、滤纸条（5cm×1.5cm）。

（三）试剂： 95％乙醇、 石英砂、 碳酸钙粉、推动剂：按石油醚：丙酮：苯（10:2:1）比例配制（V／V）。 三、实验步骤

1、叶绿体色素的提取

（1）取新鲜菠菜叶片4～5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。

（2）研钵中加2～3ml 95％乙醇，加入少许石英砂、碳酸钙粉末，研磨至糊状，再加10～15ml 95％乙醇，提取35min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95％乙醇冲洗，一同滤于三角瓶中。

（3）如无新鲜叶片，也可用事先制好的叶干粉提取。取新鲜叶片（以菠菜叶最好），先用105℃杀青，再在80℃下烘干，研成粉末，密闭贮存。用时称叶粉2g放入小烧杯中，加95％乙醇20～30ml浸提，并随时搅动。待乙醇呈深绿色时，滤出浸提液备用。

2、 叶绿体色素的分离：

（1）取圆形定性滤纸一张（直径11cm），在其中心戳一圆形小孔（直径约2mm）另取一张滤纸条（5cm×1.5cm），用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液沿纸条的长度方向涂在纸条的一边，使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，风干后，再重复操作数次，然后沿长度方向卷成纸捻，使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。

（2）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿突出）。

（3）在培养皿内放一康维皿，在康维皿中央小室中加入适量的推动剂，把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿。此时，推动剂借助毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。如无康维皿，也可在培养皿中放入一平底短玻管或塑料药瓶盖，以盛装推动剂。所用培养皿底、盖直径应相同，且应略小于滤纸直径，以便将滤纸架在培养皿边缘上。

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（4）当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色素的位置和名称。

1 2 3 4 5 分离叶绿体色素的圆形纸层析装置

1、培养皿 2、圆形层析滤纸 3、康维皿 4、纸捻（上有色素样品） 5、推动剂

II 叶绿体色素的理化性质

一、原理

叶绿素是一种二羧酸—叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定；叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

二、仪器与用具

20ml刻度试管、10ml小试管、试管架、分光镜、石棉网、药匙、烧杯（100ml）、酒精灯、玻棒、铁三角架、刻度吸量管2ml、5ml各1支、火柴。 三、试剂

95%乙醇；苯；醋酸铜粉末；5%的稀盐酸；

醋酸-醋酸铜溶液：6g醋酸酮溶于100ml 50%的醋酸中，再加蒸馏水4倍稀释而成； KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。 四、实验步骤

用本实验第一项中提取的叶绿体色素乙醇溶液和水研磨匀浆，进行以下实验。 1、光对叶绿素的破坏作用

（1）取4支小试管，其中两支各加入5ml用水研磨的叶片匀浆。另外两支各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀释1倍。

（2）取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片均浆的试管，放在直射光下，另外两

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支放到暗处，40min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。

2、荧光现象的观察 取1支20ml刻度试管加入5ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同？解释原因。

3、皂化作用（绿色素与黄色素的分离）

（1）在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。 （2）片刻后，加入5ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1～1.5ml蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（以及少量的叶黄素）；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。

4、吸收光谱的观察 将上述已分层的试管溶液，用分光镜观察两类色素的吸收光谱，首先让下层绿色素部分对准进光孔，看光谱有何变化；然后再将上层黄色素溶液对准进光孔，看光谱又有何变化。把观察的结果用简单的图表示出来。

5、H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用 方法一：

（1）取两支试管，第一支试管加叶绿体色素提取液2ml，作为对照。第二支试管中加叶绿体色素提取液5ml，再加入5%HCl数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。（2）当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记载溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。 方法二：

另取醋酸－醋酸铜溶液20ml，以烧杯盛之。取新鲜植物叶片两片，放入烧杯中，用酒精灯慢慢加热，随时观察并记录叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。解释原因。 五、注意事项

1．在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白絮状物，溶液浑浊，且不分层。可激烈摇匀，放在30～40℃的水浴中加热，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。

2．分离色素用的圆形滤纸，在中心打的小圆孔，周围必须整齐，否则分离的色素不是一个同心圆。 六、思考题

1．用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水丙酮等提取植物材料特别是干材料的叶绿体色素往往效果不佳，原因何在？

2．研磨提取叶绿素时加入CaCO3有什么作用？

3．从叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素的吸收光谱讨论其生理意义。

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实验九 植物叶片光合速率的测定（改良半叶法）

一、实验原理

光合速率测定是植物生理学的基本研究方法之一，在作物丰产生理、作物生态、新品种选育、以及光合作用基本理论研究等方面都有着广泛的用途。 根据光合作用的总反应式

CO2+2H2O→ (CH2O)+O2+H2O

光合强度原则上可以用任何一反应物消耗速度或生成物的产生速度来表示。由于植物体内水分含量很高，而且植物随时都在不断地吸水和失水，水参与的生化反应又特多，即体内水分含量经常变动，所以实际上不可能用水的含量变化来测定光合速率。目前最常用的方法有：改良半叶法，红外线CO2分析法，和氧电极法。以下介绍改良半叶法测定植物光合强度。

同一叶片的中脉两侧，其内部结构，生理功能基本一致。将叶片一侧遮光或一部分取下置于暗处，另一侧留在光下进行光合作用，过一定时间后，在这叶片两侧的对应部位取同等面积，分别烘干称重。根据照光部分干重的增量便可计算光合速率。为了防止光合产物从叶中输出，可对双子叶植物的叶柄采用环割，对单子叶植物的叶片基部用开水烫，或用三氯醋酸(蛋白质沉淀剂)处理等方法来损伤韧皮部活细胞，而这些处理几乎不影响水和无机盐分向叶片的输送。 二、实验材料、试剂与仪器设备

（一）实验材料 生长于田间的植株。 （二）仪器与用品

剪刀，分析天平，称量皿（或铝盒），烘箱，刀片，金属（有机玻璃也可）模板（或打孔器），纱布，夹子，有盖搪瓷盘，锡纸等。 （三）试剂

三氯乙酸、石蜡。 三、实验步骤

1．选择测定样品：实验可在晴天上午8~9点钟开始，预先在田间选定有代表性的叶片（如叶片在植株上的部位、年龄、受光条件等）10张，挂牌编号。

2．叶子基部处理，目的是将叶子输导系统的韧皮部破坏：

(1) 棉花等双子叶植物，可用刀片将叶柄的外皮环割约0.5 cm宽，切断韧皮部运输。

(2) 小麦、水稻等单子叶植物，由于韧皮部和木质部难以分开处理，可用刚在开水中浸过的纱布或棉花包裹的夹子将叶片基部烫伤一小段（一般用90℃以上的开水烫20秒）以伤害韧皮部。也可用110~120℃的石蜡烫伤韧皮部。

为了使烫后或环割等处理的叶片不致下垂影响叶片的自然生长角度，可用锡纸、橡皮管或塑料管包绕，使叶片保持原来的着生角度。

3．剪取样品：叶片基部处理完毕后，即可剪取样品，记录时间，开始光合速率测定。一般按编号次序

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分别剪下对称叶片的一半（中脉不剪下），并按编号顺序将叶片夹于湿润的纱布中，将叶置于暗处。4~5小时后（光照好、叶片大的样品，可缩短处理时间），再依次剪下另一半叶，同样按编号夹于湿润纱布中。两次剪叶的次序与所花时间应尽量保持一致，使各叶片经历相同的光照时数。

4．称重比较：将各同号叶片之两半按对应部位叠在一起，在无粗叶脉处放上已知面积（如棉花可用1.5×2cm）的金属模板（或用打孔器），用刀片沿边切下两个叶块，置于两个分别标记为照光及暗中的称量皿中，80~90℃下烘至恒重（约5小时），在分析天平上称重比较。按表36-1填入测定数据，并计算。 四、实验结果

光合作用强度计算：按照如下公式计算光合作用强度：

光合作用强度=干重增加总数（mg）/切取叶面积总和(dm2) ·照光时数（h） 光合作用强度单位为mg干物质/dm2·h 。

由于叶内贮存的光合产物一般为蔗糖和淀粉等，可将干物质重量乘系数1.5，即得二氧化碳同化量，单位为mg CO2/dm2·h。

表36-1用改良半叶法测定植物光合速率的记载表

实验人 日期 材料名称 光照时间 叶面积 编号 黑暗组 称量皿重 （g） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 五、思考题

1.选择同一植株不同叶位叶片，试问它们的光合作用强度是否相同，为什么？

2.如果选择不同生境（如阴生、阳生或出于逆境胁迫下）下生长的、同一生长阶段、相同叶位的同种植物，它们的光合速率会有什么不同？为什么？3.还有哪些方法可以简便地测定植物光合作用强度？请简述它们的原理。

称量皿+叶片干重（g） 光照组 称量皿重 （g） 称量皿+叶片干重（g） 叶片干重增量（g） 27

实验十 小篮子法（广口瓶法）测定植物的呼吸速率

一、原理

呼吸速率指在一定温度下，单位重量的活细胞(组织)在单位时间内吸收氧或释放二氧化碳的量，通常以“mg(μl)/(h·g)”为单位，表示每克活组织(鲜重、干重、含氮量等)在每小时内消耗氧或释放二氧化碳的毫克数。呼吸速率的大小可反映某生物体代谢活动的强弱。

本实验测定植物进行呼吸时放出CO2的量，计算一定的植物样品在单位时间内放出CO2的数量，即为该样品的呼吸速率。呼吸放出的CO2可用氢氧化钡溶液吸收，实验结束后用已知浓度的草酸溶液滴定剩余的碱液，从空白和样品二者消耗草酸溶液之差即可计算出呼吸过程中释放的CO2的量。 二、材料、设备仪器及试剂 （一）材料：发芽的小麦种子

（二）仪器设备：呼吸测定装置、天平、钟表、酸式及碱式滴定管、温度计

（三）试剂：0.05mol/L 左右的Ba（OH）2：称取Ba（OH）2 8.6g溶于1000ml蒸馏水中、1／44mol/L 草酸溶液：准确称取重结晶的H2C2O4.2H2O 2.8651g溶于蒸馏水中定容至1000ml，每ml相当于1mgCO2、 酚酞指示剂：1g酚酞溶于100ml 95％乙醇中，贮于滴瓶中。 三、实验步骤

1. 取500ml广口瓶一个，瓶口用打有三孔的橡皮塞塞紧，一孔插一盛碱石灰的干燥管，使呼吸过程中能进入无CO2的空气，一孔插温度计，另一孔直径约1cm，供滴定用，平时用一小橡皮塞塞紧，瓶塞下面挂一铁丝纱小篮，以便装植物样品，整个装置即谓―广口瓶呼吸测定装置‖。

2. 在瓶口准确加入约0.05mol/L 的Ba(OH)2溶液20ml，立即塞紧橡皮塞（不带小篮），充分摇动广口瓶2min，待瓶内CO2全部被吸收后，拔出小橡皮管塞，加入酚酞指示剂2滴，把滴定管插入孔中，用标准草酸溶液进行空白滴定，直到红色刚刚消失为止。

3. 倒出废液，用无CO2的蒸馏水（煮沸过的）洗净后，重加上述Ba（OH）2溶液20ml，同时称取植物样品5～10g，装入小篮子中，挂于橡皮塞下，塞紧瓶塞，开始记录时间，经过20～30min，其间轻轻摇动数次，使溶液表面的BaCO3薄膜破坏，有利于充分吸收CO2。然后用草酸滴定，方法如前。（注意：防止口中呼出的气体浸入瓶内！） 四、结果计算

呼吸速率（mgCO2/g(FW)/h）＝（A－B）×1/(W×t)

上式中，A：空白滴定用去的草酸量（ml）；B：样品滴定用去的草酸量（ml）；W：样品鲜重（g）；t：测定时间（h）。每毫升1／44mol/L 的草酸相当于1mgCO2。 五、思考题

1、测定呼吸速率有何意义？

2、在测定呼吸速率过程中哪些步骤容易出现误差？应当如何避免？

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实验十一 谷物淀粉含量的测定（旋光法）

一、原理

酸性氯化钙溶液与磨细的含淀粉样品共煮，可使淀粉轻度水解。同时钙离子与淀粉分子上的羟基络合，这就使得淀粉分子充分地分散到溶液中，成为淀粉溶液。淀粉分子具有不对称碳原子，因而具有旋光性，可以利用旋光仪测定淀粉溶胶的旋光度（α），旋光度的大小与淀粉的浓度成正比，据此可以求出淀粉含量。溶提淀粉溶胶所用的酸性氯化钙溶液的pH值必须保持2.30，密度须为1.30，加时间的长短也要控制在一定范围。因为只有在这些条件下，各种不同来源的淀粉溶液的比旋度［α］才都是203°，恒定不变。样品中其他旋光性物质（如糖分）须预先除去。 二、材料、仪器设备及试剂： （一）材料：面粉

（二）仪器设备：离心机、天平、旋光仪、250ml三角瓶、漏斗、离心管、小电炉。 （三）试剂：乙醚、氯化高汞、乙醇、醋酸－氯化钙、30％ZnSO4、15％K4Fe（CN） 三、实验步骤：

1. 样品准备：（1）称取样品：精确称取约2.5g样品细粉（要求含淀粉约2g），置于离心管内。（2）脱脂：加乙醚数ml到离心管内，用细玻棒充分搅拌，然后离心。倾出上清液并收集以备回收乙醚。重复脱脂数次，以去除大部分油脂、色素等（因油脂的的存在会使以后淀粉溶液的过滤困难）。大多数谷物样品含脂肪较少，可免去这个脱脂手续。（3）抑制酶活性：加含有氯化高汞的溶液10ml到离心管内，充分搅拌，然后离心，倾去上清液，得到残余物。（4）脱糖：加80％乙醇10ml到离心管中，充分搅拌以洗涤残余物（每次都用同一玻棒），离心，倾去下清液。重复洗涤数次以去除可溶性糖分。

2. 溶提淀粉：（1）加醋酸－氯化钙：先用醋酸氯化钙溶液约10ml加到离心管中，搅拌后全部倾入250ml三角瓶内，再用醋酸氯化钙溶液50ml分数次洗涤离心管，洗涤液并入三角瓶内，搅拌玻棒也转移到三角瓶内。（2）煮沸溶解：先用蜡笔标记液面高度，直接置于加有石棉网的小电炉上，在4min～5min内迅速煮沸，保持沸腾15min～17min，立即将三角瓶取下，置流水中冷却。煮沸过程中要时加搅拌，勿令烧焦；要调节温度，勿使泡沫涌出瓶外；常用玻璃将瓶侧的细粒擦下；并加水保持液面高度。

3. 沉淀杂质和定容：（1）加沉淀剂：将三角瓶内的水解液转入100ml容量瓶，用醋酸氯化钙溶液充分洗涤三角瓶瓶，并入容量瓶内，加30％ZnSO41ml混合后，再加15％K4Fe（CN）61ml，用水稀释至接近刻度时，加95％乙醇一滴以破坏泡沫，然后稀释到刻度，充分混合，静置，以使蛋白充分沉淀。（2）滤清：用漏斗（加一层滤纸）过滤。先倾清溶液约10ml于此滤纸上，使其完全湿润，让溶液流干，弃去滤液，再倾清溶液进行过滤，用干燥的容器接受此滤液，收集约50ml，即可供测定之用。

4. 测定旋光度：用旋光测定管装满滤液，小心地按照旋光仪使用说明，进行旋光度的测定。 四、结果计算

淀粉（％）＝α×N×100/{[α]D×L×(W－K)}×100

式中：α：用钠光时观测到的旋光度；［α］ D：淀粉的比旋度，在这种方法条件下为203°；L：旋

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光管长度（dm）；W：样品质量（g）；K：样品水分含量（g）；N：稀释倍数；100：换算为百分率。也可以不用上列公式计算，改用工作曲线来求得淀粉含量，这样准确度高些。 五、思考题

1、干扰淀粉含量测定的主要因素有哪些？应如何避免？ 2、为什么要加入硫酸锌和亚铁氰化钾？

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实验十二 类似生长素对种子萌发的影响

一、原理

生长素及人工合成的类似物质如萘乙酸(NAA)等对植物生长有很大的调节作用，在不同浓度下对植物生长的效应也不同。萘乙酸是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加坐果，防止落果，改变雌、雄花比率等。可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。在生产上有比较广泛的应用。一般来说，低浓度的生长素促进生长，高浓度时则抑制生长。不同的植物器官对生长素的反应也不同，通常根比芽、茎对生长素更敏感。本实验据此观察不同浓度的萘乙酸在种子萌发过程中对植物不同器官生长的影响。 二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：小麦种子。

（二）仪器设备：温箱，培养皿，移液管，镊子，滤纸，尺子。 （三）试剂：10mg/L萘乙酸，0.1%升汞。 三、实验步骤

1. 取小麦种子，用0.1%升汞消毒15min，再用自来水和蒸馏水各冲洗3次，置于22℃的温箱中催芽2d。 2. 取9cm的洁净培养皿7套，编号。在1号培养皿中加入10mg/L 萘乙酸10mL，然后从其中吸取1mL放入2号培养皿中，加9mL蒸馏水混匀后即成为1 mg/L 萘乙酸溶液。如此依次稀释到6号培养皿（最后从第6号培养皿中取出1mL弃去），则1号至6号培养皿中萘乙酸浓度依次为10 mg/L、1 mg/L、0.1 mg/L、0.01 mg/L、0.001 mg/L、0.0001 mg/L。第7号培养皿中则加入9mL蒸馏水作为对照。

3. 在各培养皿中放入一张与培养皿皿底大小一致的滤纸，选取已萌动的小麦种子10粒，用镊子将其整齐地排列在培养皿中，使芽尖朝上并使胚的部位朝向同一侧，盖上皿盖后，放在22℃的温箱中暗培养3d。

4. 测量培养皿内小麦幼芽及幼根的平均长度以及根的数目。 四、实验结果计算与分析

以蒸馏水中的材料为对照，计算不同浓度萘乙酸溶液中小麦幼芽及幼根长度的增加或减少值，并进行比较分析。

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实验十三 赤霉素对α-淀粉酶的诱导形成

一、原理

赤霉素（gibberellin），是一类属于双萜类化合物的植物激素。赤霉素最突出的生理效应是促进茎的伸长和诱导长日植物在短日条件下抽薹开花。关于赤霉素的作用机理，研究得较深入的是它对去胚大麦种子中淀粉水解的诱发。

种子萌发过程中贮藏物质的动员，需要在一系列酶的催化作用下才能进行。这些酶有的已经存在于干燥种子中，有的需要在种子吸水后重新合成。种子萌发过程中淀粉的分解主要是在淀粉酶的催化下完成的。淀粉酶在植物中存在多种形式，包括 α - 淀粉酶、 β - 淀粉酶等。 β- 淀粉酶已经存在于干燥种子中，而 α - 淀粉酶不存在或很少存在于干燥种子中，需要在种子吸水后重新合成。

实验证明，启动 α - 淀粉酶合成的化学信使是赤霉素。萌发的大麦种子的胚产生赤霉素扩散到胚乳的糊粉层中，刺激糊粉层细胞内 α - 淀粉酶的合成。合成的淀粉酶进入胚乳，将胚乳内贮藏的淀粉水解成还原糖。因此，没有胚释放赤霉素的活动， α - 淀粉酶就不能合成。外加的赤霉素可以代替胚的释放作用，从而诱导 α - 淀粉酶的合成。这个极其专一的反应被用来作为赤霉素的生物鉴定法。在一定范围内，由去胚的吸胀大麦粒所产生的还原糖量，与外加赤霉素浓度的对数成正比。根据淀粉可与 I 2 -KI 显蓝色，而淀粉分解的产物还原糖不能与 I 2 -KI 显色的原理，可以定性和定量地分析 α - 淀粉酶的活性。 二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：大麦、小麦种子

（二）仪器设备：分光光度计、恒温箱、水浴锅、移液管、烧杯、试管、青霉素小瓶、镊子、刀片。 （三）试剂：1、 1%次氯酸钠溶液； 2、 0.1%淀粉溶液：淀粉1g，KH2PO4 8.16g定容至1000mL；3、2×10–5mol/L赤霉素溶液：6.8mg赤霉素溶于少量95%乙醇，加水定容至1000mL；4、10–3mol/L 醋酸缓冲液； 5、I2-KI溶液：0.6gKI、0.06g I2溶于1000mL0.05mol/L HCl中。 三、实验步骤

1. 选取大小一致、健康的大麦种子50粒，用刀片将每粒种子横切成两半，使成无胚的半粒和有胚的半粒，分别置于新配制的1％次氯酸钠溶液中，消毒15min，取出用无菌水冲洗数次，备用。

2. 取小瓶6只编好号码，按表加入各种溶液和材料，于25℃下培养24小时（最好进行振荡培养，如无条件，则必须经常摇动小瓶）。

3. 淀粉酶活性分析：从每个小瓶中吸取培养液0.1mL，分别置于事先盛有1.9mL淀粉磷酸盐的溶液中，摇匀，在30℃温箱或水浴中精确保温10min，然后加I2-KI溶液2mL，蒸馏水5mL，充分摇匀，于波长580nm下测定吸光度，以蒸馏水为空白校正仪器零点。读数，从标准曲线查得淀粉含量，以被分解的淀粉量作为淀粉酶的活性。

4. 以不同淀粉浓度（0～700μg/L）或淀粉量（0～1000μg）及其吸光度绘制标准曲线。 青霉素小瓶编号 1 赤霉素溶液 浓度（ mol/L ） 0 mL 1 醋酸缓冲液 (mL) 1 实验材料 10 个无胚半粒 32

2 3 4 5 6 0 2 × 10 -5 2 × 10 -6 2 × 10 -7 2 × 10 -8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 10 个有胚半粒 10 个无胚半粒 10 个无胚半粒 10 个无胚半粒 10 个无胚半粒

四、结果计算

1. 第1瓶为淀粉的原始量（X）。

2. 第2～6瓶分别为反应后淀粉的剩余量（Y）。 3. 淀粉水解量=[（X—Y）/X]×100%。 五、思考题

为什么要用10 个无胚半粒和10 个有胚半粒不加赤霉素处理作对照？

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实验十四 植物光周期现象的观察

一、目的

在自然光照条件下，对植物进行短日照、间断光期、间断黑夜等处理，借以了解日照和黑夜的交替及其长度对大豆、水稻等短日照作物开花结果的影响。 二、原理

许多植物须经过一定的光周期才能开花。并已知叶是感受光周期影响的器官。在一定的光周期条件下，叶内形成某些特殊的代谢产物，传递到生长点，导致生长点形成花芽。 三、材料与设备

1. 材料：大豆幼苗（迟熟种）或水稻幼苗（感光性强的品种），菊花或其他短日照植物

2. 设备：黑罩（外面白色，里面黑色）或暗箱、暗柜、暗室；日光灯或红色灯泡（60～100瓦）；闹钟（附光源开关自动控制装置）。 四、实验步骤

1. 当大豆幼苗长出第一片复叶，或水稻幼苗长出5～6片叶（夜温在20℃以上）后，即按下述方法给以不同处理，一般情况连续处理10天后即可完成。 处 理 短 日 照 间断白昼 间断黑夜 对 照 处 理 方 法 每日照光十小时（早上七时半——下午五时半） 每日中午十一时半至下午二时半移入暗处间断白昼三小时。 在短日照处理基础上，于午夜24时至凌晨1时照光1小时，以间断黑夜。 以自然条件为对照。 经上述处理后记下各处理的大豆现蕾期或水稻始穗期，并与对照作比较。

2. 取菊花或其他适当地短日植物4株；第1株予以每日光照18小时的长日处理；第2株予以每日光照10小时的短日处理；第3株下部叶片予以短日处理，而摘去叶片的顶端则使受长日处理，第4株使与第3株适相反。观察最后开花情况。记录结果。 五、 思考题

1. 幼苗经不同处理后，花期有的较对照提前，有的与对照相当，如何解释？ 2. 按植物对光周期的要求，可把植物分为哪几大类？

3. 根据植物光周期现象的原理，在引种工作中应注意哪些问题

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实验十五 植物抗逆性的测定（电导仪法）

一、原理

电导率是以数字表示溶液传导电流的能力。水的电导率与其所含无机酸、碱、盐的量有一定的关系，当它们的浓度较低时，电导率随着浓度的增大而增加，因此，该指标常用于推测水中离子的总浓度或含盐量。

植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用。在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，如高温或低温，干旱、盐渍、病原菌侵染后，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以致植物细胞浸提液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。这样，比较不同作物或同一作物不同品种在相同胁迫温度下膜透性的增大程度，即可比较作物间或品种间的抗逆性强弱，因此，电导法目前已成为作物抗性栽培、育种上鉴定植物抗逆性强弱的一个精确而实用的方法。 二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：小麦、韭菜叶片

（二）仪器设备：电导仪、天平、温箱、真空干燥器、抽气机、恒温水浴锅、 注射器。 （三）试剂：NaCl溶液(100mg/ml)。 三、实验步骤

1. 制作标准曲线：如需定量测定透性变化，可用纯NaCl配成0、10、20、40、60、80、100μg/ml的标准液，在20～25℃恒温下用电导仪测定，可读出电导度。

2. 选取小麦或其他植物在一定部位上生长叶龄相似的叶子若干，剪下后，先用纱布拭净，称取二份，各重2g。

3. 一份插入小杯中放在40℃恒温箱内萎蔫0.5～1h，另一份插入水杯中放在室温下做对照。处理后分别用蒸馏水冲洗二次，并用洁净滤纸吸干。然后剪成长约1cm小段放入小玻杯中（大小以够容电极为度），并用玻棒或干净尼龙网压住，在杯中准确加入蒸馏水20ml，浸没叶片。

4. 放入真空干燥器，用抽气机抽气7～8min以抽出细胞间隙中的空气；重新缓缓放入空气，水即被压入组织中而使叶下沉。

5. 将抽过气的小玻杯取出，放在实验桌上静置20min，然后用玻棒轻轻搅动叶片，在20～25℃恒温下，用电导仪测定溶液电导率。

6. 测过电导率的之后，再，放入100℃沸水浴中15min，以杀死植物组织，取出放入自来水冷却10min，在20～25℃恒温下测其煮沸电导率。 四、实验结果及分析

比较不同处理（高温或低温处理与对照）的叶片细胞透性的变化情况，记录结果，并加解释。 五、思考题

植物抗逆性与植物细胞膜的透性有何关系？

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