选修3专题1基因工程1.2基因工程的基本操作程序

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1.2基因工程的基本操作程序 1.2基因工程的基本操作程序太原市外国语学校 赵成艺

第一步：目的基因的获取 第一步： 第二步：基因表达载体的构建 第二步： 第三步：将目的基因导入受体细胞 第三步： 第四步：目的基因的检测与鉴定 第四步：

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目的基因的获取1)从基因所在的生物体 直接获取 2)mRNA反转录成cDNA mRNA反转录成cDNA 反转录成 3)人工合成 4)从基因文库中获取目的基因 4)从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术 利用PCR技术 PCR 扩增目的基因

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基因表达载体的构建(基因工程的核心) 基因工程的核心) 切割质粒， ①用一定的 限制酶 切割质粒， 使其出现一个切口， 使其出现一个切口，产生 _________。 _________。 黏性末端 同种限制酶切割目的基因 ②用__________切割目的基因， __________切割目的基因， 同种黏性末端 同种黏性末端 使其产生 。 切口 ③将切下的目的基因片段插入质粒的_____处，再加 将切下的目的基因片段插入质粒的_____处 _____ DNA连接酶 DNA连接酶 入适量__________ 形成了一个重组DNA分子( __________, DNA分子 入适量__________,形成了一个重组DNA分子(重组质 粒) 。

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基因表达载体的组成(一)构建目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在， 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传 给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (二)构建零件及其作用 ①目的基因 ②启动子 RNA聚合酶识别和结合的 RNA聚合酶识别和结合的 一段特殊结构的DNA片段， DNA片段 一段特殊结构的DNA片段，位 于基因的首端，RNA聚合酶与 于基因的首端，RNA聚合酶与 之结合才能驱动基因转录出 mRNA,进而获得需要的蛋白质。 mRNA,进而获得需要的蛋白质。

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③终止子 一段特殊结构的DNA片 一段特殊结构的DNA片 DNA 位于基因的尾端， 段，位于基因的尾端，作 用是使转录在所需要的地 方停止。 方停止。 ④标记基因 鉴别受体细胞中是否 含有目的基因， 含有目的基因，从而将含 有目的基因的细胞筛选出 来。

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将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞： 常用的受体细胞： 动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。 动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。 将目的基因导入受体细胞的原理： 将目的基因导入受体细胞的原理： 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 受体细胞 转化—— 目的基因进入_________内，并且在受体 转化 目的基因进入_________ _________内 稳定 细胞内维持_____ _____的过程 _____和 表达 的过程。 细胞内维持_____和_____的过程。

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将目

的基因导入受体细胞农杆菌转化法

导入植物细胞 基因枪法花粉管通道法

方法

导入动物细胞

显微注射法

导入微生物细胞 感受态细胞吸收DNA分子 感受态细胞吸收DNA DNA分子

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目的基因的检测与鉴定(检查是否成功) 检查是否成功) ①检测转基因生物染色体的 DNA分子杂交 DNA分子杂交 DNA上是否插入了目的基因 DNA上是否插入了目的基因 分子水平 检测 ②检测目的基因是否转录出 DNA分子杂交 DNA分子杂交 了mRNA ③检测目的基因是否翻译成 抗原抗原-抗体杂交 蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、 个体水平鉴定： 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 个体水平鉴定：

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从基因所在的生物体直接获取即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来 编码蛋白质的结构基因 目的基因主要是指_____________________ _____________________。 目的基因主要是指_____________________。 供体生物细胞 取出DNA 取出DNA 用限制酶剪去 多余部分 目的基因

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mRNA反转录成cDNA mRNA反转录成cDNA 反转录成以目的基因转录成的mRNA为模板， 以目的基因转录成的mRNA为模板，反转录成互 mRNA为模板 补的单链DNA 然后在DNA DNA, DNA聚合酶的作用下合成双链 补的单链DNA,然后在DNA聚合酶的作用下合成双链 DNA,从而获得所需的基因。 DNA,从而获得所需的基因。

mRNA

逆转录酶

双链DNA 双链DNA 互补DNA DNA聚合酶 互补DNA DNA聚合酶 即目的基因) (即目的基因) cDNA) (cDNA) 合成

反转录

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人工合成目的基因根据已知的氨基酸序列合成DNA: 根据已知的氨基酸序列合成DNA: DNA 蛋白质的 推测 mRNA的 推测 目的基因 化学 目的 mRNA的 氨基酸序列 核苷酸序列 核苷酸序列 合成 基因

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从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多片段， 将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体 菌的群体中储存， 菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不 同的基因，称为基因文库。 同的基因，称为基因文库。 1. 基因组文库 受体菌包含了某种生物所有的基因， 受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群 体称为这种生物的基因组文库。 体称为这种生物的基因组文库。 2. 部分基因文库 受体菌包含了一种生物部分基因， 受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体 称为这种生物的部分基因文库， cDNA文库 文库。 称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。

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基因文库的构建(1)基因组文库的构建 提取某生物 全部DNA 全部DNA用适当 限制酶切割

许 多 DNA片段 DNA片段

与载体连接 导入受体菌群

该生物基 因组文库

(每个受体菌含有一段不同的DNA片段)

(2)cDNA文库的构建 cDNA文库的构建——mRNA反转录形成 mRNA反

转录形成 文库的构建 mRNA

mRNA

逆转录酶

互补DNA 互补DNA (cDNA)

DNA聚合酶 DNA聚合酶

该生物 双链DNA 双链DNA 与载体连接 cDNA文库 即目的基因) (即目的基因)导入受体菌群 cDNA文库

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聚合酶链式反应(PCR,polymerase chain reaction ) PCR,原理： DNA双链复制的基本原理 原理： DNA双链复制的基本原理 前提： 前提： 一段已知目的基因的核苷酸序列 条件： 条件： 四种脱氧核苷酸 DNA的两条链为模板 DNA的两条链为模板 热稳定DNA聚合酶(Taq酶 热稳定DNA聚合酶(Taq酶) DNA聚合酶(Taq 一对引物 温度控制 PCR扩增仪 PCR扩增仪

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PCR扩增过程 PCR扩增过程①DNA变性(90℃-95℃):双链DNA模板在热作用下， DNA变性(90℃-95℃):双链DNA模板在热作用下， 变性(90℃ DNA模板在热作用下 断裂， 断裂，形成 。 单链DNA 单链DNA 氢键 ②复性(55℃-60℃):系统温度降低，引物与DNA模 复性(55℃-60℃):系统温度降低，引物与DNA模 DNA 板结合， 板结合，形成局部 双链DNA 。 双链DNA ③延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下，从引物的 延伸(70℃-75℃): Taq酶的作用下， (70℃ 酶的作用下 5′端 3′端延伸 合成与模板链互补的_______ 端延伸， _______。 5′端→3′端延伸，合成与模板链互补的_______。 DNA链 DNA链

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农杆菌转化法农杆菌特点： 农杆菌特点： 易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的 易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的 DNA可转移至受体细胞的染色体上 T-DNA可转移至受体细胞的染色体上

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显微注射法含目的基因 显微 的表达载体 注射 动物的 受精卵

早期胚胎移 植

分裂 含目的基因 分化 的受精卵

雌性动物输 发育 卵管或子宫

转基因 动物

为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？ 为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？

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将目的基因导入微生物细胞1.常用菌： 大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等。 1.常用菌： 常用菌 大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等。 2.微生物作受体细胞原因： 2.微生物作受体细胞原因： 微生物作受体细胞原因 繁殖快、多为单细胞、 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 3.转化方法： 3.转化方法： 转化方法 Ca2+ 处理细胞→ 感受态 细胞→表达载体与感 处理细胞→ 细胞→ 感受态 细胞吸收DNA分子。 受态细胞混合→_______细胞吸收DNA分子 受态细胞混合→_______细胞吸收DNA分子。

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分子杂交技术该方法是根据碱基互补配对原则， 该方法是根据碱基互补配对原则，把 互补的双链DNA解开，把单链的DNA小片段 互补的双链DNA解开，把单链的DNA小片段 DNA解开 DNA 用同位素、 用同位素、荧光分子或化学发光剂等进行 标记，之后同被检测的DNA中的

同源互补序 标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序 DNA 列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。 列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。 DNA或基因

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分子杂交技术检测转基因生物的DNA DNA上是否插入了目的基因 1. 检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因提取受体生 适当限制 用同位素标记的 DNA片段 DNA片段 目的基因片段杂交 显出杂交带 酶切割 物全部DNA 物全部DNA(表明目的基因已插入) 表明目的基因已插入)

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检测目的基因是否转录出了mRNA 2. 检测目的基因是否转录出了mRNA提取受体生物 的mRNA用同位素标记的 目的基因片段杂交

显出杂交带

(表明目的基因已转录出了mRNA) 表明目的基因已转录出了mRNA) mRNA

检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA 检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA DNA利用的是DNA 杂交 利用的是DNA与mRNA杂交。 利用的是DNA与mRNA杂交。 DNA 杂交

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