硝基呋喃类代谢物残留量检测标准的比较

ChineseJournalofAnalysisLaboratory2011－11

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第30卷第11期2011年11月

分析试验室Vol.30．No．11

硝基呋喃类代谢物残留量检测标准的比较

*1

刘正才，杨

11

方，余孔捷，赵

111

芳，林永辉，邱元进，张

峰

2

（1．福建出入境检验检疫局，福州350001；2．中国检验检疫科学研究院，北京100123）摘

要：对我国现有硝基呋喃类代谢物检测标准进行比较和分析，同时用不同检

虾、猪肉、牙鲆鱼、白鲫鱼等阳性样品的测定结果进行了统计比较测标准对鳗鱼、

pH在7.0～7.5范围内对硝基呋喃类代谢物的分析。结果表明：各检测方法中，

乙酸乙酯萃取影响不大；用t－检验：双样本等方差假设比较两种方法的差异显由于样品制备中洗涤和不洗涤的差异，采用不同标准的检测结果差异著性表明，

显著。

关键词：硝基呋喃类代谢物；检测标准；比较

中图分类号：O657.63

文献标识码：A

文章编号：1000-0720（2011）11-043-05

硝基呋喃类抗菌药物包括了呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因，这类化合物对光敏感，衰减快，其母体化合物在动物体内及其产品中代谢很

但其代谢物以蛋白结合物的形式存在可残留较快，

目前各国均将硝基呋喃类代谢物作为指示长时间，

硝基呋喃类药物残留的标示物。因硝基呋喃类药物及其代谢物具有相当大的毒副作用，世界上绝大部分国家规定在食用动物组织中不允许有硝基呋喃类药物残留；美国21CFR530.41规定食源性动物禁止使用呋喃唑酮和呋喃妥因；欧盟EEC2377/90将硝基呋喃类药物及其代谢产物列为A类禁用药物；我国也于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃

［1］

类抗生素的禁令。

我国目前颁布了有关硝基呋喃类代谢物的残

［2～5］

、留检测标准，主要有国家标准检验检疫行业

［6，7］［8～10］

、标准农业行业标准等，这些标准在实施

检验检疫系统、进出口企业和其期间被农业部门、

他相关部门广泛采用。本研究在检测工作的基础

上比较了硝基呋喃类代谢物检测标准的主要差异，并以鳗鱼基体标准物质以及阳性样品作为实验基体，分别对常用的硝基呋喃类代谢物检测标准进行了比较和统计分析。

11.1

材料与方法

仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源

（4000QTrap，美国AppliedBiosystems公司）；台式

空气恒温摇床（SHK－99－Ⅱ，北方同正生物技术公司）；旋转蒸发系统（上海申生科技公司）；MilliQ纯水系统（Millipore公司）。

实验用水符合GB/T6682一级水的要求；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸乙酯为色谱纯（北京振翔公司）；正已烷（分析纯，国药集团化学试剂公司）；邻硝基苯甲醛（＞99%，上海盈元化工公司）；二甲亚砜分析纯（广东汕头市西陇化工厂）。

硝基呋喃类代谢物以及内标标准品：AOZ（AOZ_D4），AMOZ（AMOZ_D5）、AHD·HCl（AHD

15_13C3）、SEM·HCl（SCA_13C，N2），纯度≥99.0%（SigmaChemicalCo）；衍生化试剂（0.1mol/L）：称

取100mg邻硝基苯甲醛溶于12.5mL二甲亚砜中，然后以甲醇定容至100mL，现用现配；标准品储备液：分别称取硝基呋喃类代谢物标准品以及其内标约10mg（准确至0.1mg），用甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中，各组分浓度均为

06-21；修订日期：2011-07-05收稿日期：2011-基金项目：质检公益项目（200910145－3）资助

mail：zhengcailiu@yahoo．com．cn作者简介：刘正才（1977－），男，工程师；E-

—43—

100.0μg/mL，4℃以下保存，保存期为6个月。1.2试验材料

鳗鱼采用基体标准物质（GBW（E）100180）；

B17）虾由国家认监委能力验证计划（CNCA－11-承担单位提供；猪肉由国家认监委能力验证计划

（CNCA－10-A08）承担单位提供；牙鲆鱼来自本实验室日常检测的阳性样品。1.3样品处理

目前大部分标准前处理部分分为两类，一类是需要洗涤后进行测试，即主要测试结合态的硝基呋

［2，5，8］

，另外一类是不需要洗喃类代谢物

［3，4，6，7，9，10］

，涤即主要测试游离态和结合态的硝基呋

40℃；流动相A：5mmol/L乙酸铵－0.2%甲酸（体

流动相B：乙腈；梯度洗脱，洗脱程序：起始积比），

4.0min升至90%，并维持至7.0比例B为15%，

7.5min降至15%，min，然后回复至起始比例平衡系统，总分析时间为10.0min。流速为0.40mL/min；进样量10μL。1.4.2

+

质谱条件电离方式：ESI；扫描方式：多

反应监测（MRM），电喷雾电压（IS）：4500V；气帘

气压力（CUR）：0.172MPa（氮气）；离子源温度（TEM）：500℃；雾化气压力0.379MPa；辅助气压力0.379MPa；其它质谱参数见表1。2结果与分析2.1

标准方法的比较

目前检测硝基呋喃类代谢物的标准比较多，表2列举了常用检测标准的异同点。从表2中可以看出，检测硝基呋喃类代谢物的标准方法主要有HPLC-MS/MS法和HPLC-UV法，各种标准的差异主要有检测基体、前处理方法、测定的仪器方法以及

检测限等，而前处理的差异主要在衍生化前洗涤与不洗涤、调节衍生化后溶液的pH值、净化方式的差异。2.2

pH值实验

研究了pH为6.8～7.6时，以等量的乙酸乙

温度为25℃，震荡20min后对萃取酯为萃取溶剂，

AMOZ用乙酸乙酯率的影响，实验结果表明：AOZ，

SEM萃取的最佳pH值范围为7.4～7.6；而AHD，用乙酸乙酯萃取的最佳pH值范围为6.9～7.1。

2.3前处理方法的比较

根据文献报道，硝基呋喃母药在动物体内很快被代谢成为蛋白结合物，检测该类化合物依赖于对动物组织中提取的游离型代谢物的检测，而这些小分子代谢产物要经过衍生化处理，才能在色谱柱上实现更好的分离并在质谱检测时获得更高的灵敏度。从表2中可以看出，目前对硝基呋喃代谢物的测定分两种：一种检测结合态的硝基呋喃代谢物（方法1），一种是检测总的硝基呋喃代谢物（方法2），包括结合态和游离态，实验以阳性基体进行两者之间的比较，检测的基体有鳗鱼、虾、猪肉、牙鲆鱼等，其结果见表3。用t－检验分析：双样本等方差假设比较检测方法与检测结果的差异显著性，见表4、表5。

喃类代谢物。本文采用以下两种样品前处理方法：

方法1：衍生：称取5.0g匀样于50mL具塞离心管中，加入10mL甲醇-水混合溶液（体积比1：1），振荡10min后离心，弃去淋洗液。加入30mL0.125mol/LHCl溶液和1.0mL衍生试剂（邻硝基苯甲醛溶液），以及0.1mL100ng/mL混合内标标准溶液，均质1min，于恒温振荡器上37℃振荡水解16h。

净化：加入约4.0mL1mol/LNaOH溶液，用1mol/LHCl溶液和0.1mol/LNaOH溶液，调节pH值至7.0～7.5。加入2x20mL乙酸乙酯，振摇1min，静置3min以上，合并乙酸乙酯相，弃去水相。用10mL300g/LNaCl溶液洗涤分液漏斗中的乙酸乙酯溶液，弃去水相，将乙酸乙酯层通过装有2g无水硫酸钠的漏斗过滤至鸡心瓶中。45℃旋转蒸发至近干，分别加入2mL乙腈-水－甲酸（体积比：20：80：0.1）溶液和3mL正己烷洗涤鸡心瓶，在震荡器中旋转2min，合并洗涤液于5mL3000r/min离心2min。取下层水溶液过试管中，

0.45μm滤膜，供液相色谱质谱测定。方法2：衍生：称取5.0g匀样于50mL具塞离心管中；加入30mL0.125mol/LHCl溶液和1.0mL衍生试剂（邻硝基苯甲醛溶液），以及0.1mL100ng/mL混合内标标准溶液，均质1min，于恒温振荡器上37℃振荡水解16h。

净化：同方法1中净化部分。1.4测试条件1.4.1

液相色谱条件色谱柱：PhenomenexLuna

3μC18（2）100A（150×2.00mm3μm）；柱温为—44—

表1Tab．1

化合物AMOZAMOZD5-SEMC13-SEMAHDC13-AHDAOZD4-AOZ*定量离子

表2

Tab．2

标准号

SN/T1627－2005

农业部781号公告－4－2006DB33/T599－2006GB/T20752－2006GB/T21166－2007GB/T_21311－2007SN/T2061－2008

农业部1077号公告－2－2008

硝基呋喃类代谢物检测标准的比较

仪器方法HPLC-MS/MSHPLC-MS/MSHPLC-MS/MSHPLC-MS/MSHPLC-MS/MSHPLC-MS/MSHPLC-MS/MSHPLC-UV

测试方法不洗涤洗涤不洗涤洗涤不洗涤洗涤不洗涤不洗涤

pH7.0～7.57.2～7.47.0～7.47.47.0～7.57.47.57.0

LOQw/（μg/kg）

10.250.50.50.50.50.50.5

母离子335.0340.2209212249252236240

硝基呋喃类代谢物的主要质谱参数子离子262.2291.2

*

MS/MSparametersofNitrofuranmetaholite

停留时间

202020202020202020202020

去簇电压/ev

555555505050555555505050

碰撞气能量/ev

251818171414182020201919

296.3166*192168178.1134.1*134104134

*

134

ComparisonbetweendifferentstandardmethodsofNitrofuranmetaholite

适应范围动物源性食品动物源食品水产品中

猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产肠衣

动物源性食品蜂王浆水产品中表3

Tab．3

AMOZ测试的结果不同阳性基体对AOZ，

ResultsofAOZandAMOZofdifferentpositivesamples．

AOZ

AMOZ

猪肉w/（μg/kg）方法10.8340.8290.8110.8170.7990.82

方法20.9590.9580.9431.060.9500.953

SEM

牙鲆鱼w/（μg/kg）方法13.935.384.224.024.564.39

方法211.711.810.410.511.29.90

化合物基体No．123456

虾w/（μg/kg）方法11.171.161.191.101.261.09

方法21.761.811.831.851.931.87

鳗鱼w/（μg/kg）方法10.5970.6620.6180.6500.7300.560

方法20.8120.7440.7910.6500.7520.782

猪肉w/（μg/kg）方法11.941.971.971.801.881.92

方法22.792.762.692.732.812.75

—45—

表4

Tab．4基体平均值方差观测值合并方差df（自由度）t－统计量P（T＜=t）t双尾临界

表5

两种方法测定AOZ残留量的差异性比较虾

方法11.160.00460.0041019.62.56E－092.23

方法21.840.0032976

方法10.6360.00360.003103.550.005292.23

鳗鱼

方法20.7550.0046

方法11.920.00460.0031026.51.35E－102.23

猪肉

方法22.750.0026

ComparisonofthedifferencebetweentheresultofAOZresidue

两种方法测定AMOZ与SEM残留量的差异性比较

ComparisonofthedifferencebetweentheresultofAMOZandSEMresidues

化合物

AMOZ方法10.8180.000160.001108.101.05E－052.23

方法20.9700.0026

方法14.420.27660.4331017.19.82E－092.23

SEM

方法210.90.5906

Tab．5

P（T＜=t）双尾均＜均大于t双尾临界值2.23，

0.01，说明两种方法差异极显著；对猪肉中的AMOZ以及牙鲆鱼中SEM的测试结果表明P均＜0.01，说明两种方法差异极显著。2.4

样品检测

取市售白鲫鱼12条置于水箱中（每条约400g），每条口灌10mg/L四种硝基呋喃原药水

5h后全部宰杀，溶液0.5mL，去磷片、骨后取鱼肉匀浆10min制成糜状样品，按本实验方法1.3

分别进行测试，测定结果的差异性比较见表6，从4种硝基呋喃代谢表中可以看出，采用t－检验，

AOZ、SEM、AHD的∣t∣分别为28.3、物AMOZ、

6.40、6.82、3.62，P（T均大于t双尾临界值2.23，

＜=t）双尾均＜0.01，说明两种前处理方法差异极显著。

平均值

方差观测值合并方差df（自由度）t－统计量P（T＜=t）t双尾临界

t－检验：双样本等方差假设的结果表明（假设平均差为0），采用不同的前处理方法对虾、鳗鱼、|t|分别为19.6，3.55，26.5，猪肉中的AOZ测定，

表6Tab．6

白鲫鱼中4种硝基呋喃代谢物残留量测定结果的差异性比较Comparisonofthedifferencebetweentheresultsof4Nitrofuran

metaholiteresiduesinwhitecrucian

化合物方法平均值方差6观测值合并方差df（自由度）t－统计量P（T＜=t）t双尾临界

AMOZ方法2

0.3670.00014

60.00021028.37.12E－112.23

方法10.1320.00028

方法29.01

AOZ

方法17.510.2716260.165106.407.85E－052.23

方法20.476

SEM

方法10.1630.0004560.006106.824.65E－052.23

方法21.322

AHD

方法10.6420.0635260.106103.620.004712.23

0.0588670.012210.14842

—46—

参考文献

［1］郭桢，连瑾，2005（5）：57吴淑君．．广东农业科学，［2］GB/T20752－2006．猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产

品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定．液相色谱-串联质谱法．

［3］GB/T21167－2007．蜂王浆中硝基呋喃类代谢物

串联质谱法残留量的测定－液相色谱-［4］GB/T21166－2007．肠衣中硝基呋喃类代谢物残留

量的测定－液相色谱-串联质谱法

［5］GB/T21311－2007．动物源性食品中硝基呋喃类药

物代谢物残留量检测方法高效液相色谱-串联质谱法

［6］SN/T1627－2005．进出口动物源食品中硝基呋喃

类代谢物残留量测定方法－高效液相色谱串联质谱法

［7］SN/T2061－2008．进出口蜂王浆中硝基呋喃类代

谢物残留量的测定，液相色谱-质谱/质谱法［8］动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定高

效液相色谱-串联质谱法．中华人民共和国国家标准：农业部781号公告－4－2006

［9］水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定高效液

相色谱法．中华人民共和国国家标准：农业部1077号公告－2－2008

［10］水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定－－液

相色谱-串联质谱法．浙江省地方标准：DB33/T599－2006

Studyonnitrofuranmetaboliteresiduesanditscomparativeanalysisoftestingstandards

LIUZheng-cai*1，YANGFang1，YUKong-jie1，ZHAOFang1，LINYong-hui1，QIUYuan-jin1andZHANGFeng2（1．FujianEntry-ExitInspection＆QuarantineBureau，Fuzhou350001；2．ChineseAcademyofInspection＆2011，30（11）：43～47Quarantine，Beijing100123），FenxiShiyanshi，

Abstract：ThedeterminationstandardsofnitrofuranmetabolitesinChinanowadaywerecomparedandanalyzedthedeterminationresultsofpositivesamplesofeel，shrimp，pork，paralichthys，orivaceusandinthemeantime，

whitecrucianwereanalyzedstatisticallyandcomparatively．ItisshownthatthepHvalueintherangeof7.0～7.5extractsolutionshaslittleinfluenceontheextractionefficiencyofethylacetateanddifferenttestingstandardsofnitrofuranmetaboliteshaveextremelysignificantdifferencesduetotestingstandardsofsamplepreparationwithorwithoutwashingstepsbytheresultsofdoublesamplet-test．Keywords：Nitrofuranmetabolite；Testingstandards；Comparison

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/5r44.html