适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学技术

《乳业科学与技术》

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2009年第2期（总第135期）89

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综述

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古呼和浩特010018）

摘要：介绍了几种适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学方法及其原理、优缺点和研究现状。关键词：分子生物学技术；乳酸菌；分类鉴定

中图分类号：TS252.1

文献标识码：A

文章编号：1671-5187（2009）02-0089-05

ReviewontheMolecularBiotechnologyfortheClassification

andIdentificationofLacticAcidBacteria

ZhangJiachao,SunZhihong,LiuWenjun,ZhangHeping*

（KeyLaboratoryofDairyBiotechnologyandEngineering,MinistryofEducationHuhhotof

）InnerMongolia010018,P.R.China

Abstract:Theprinciples,methodsandapplicabilityofmolecularbiotechnologyusedforclassificationandi－dentificationoflacticacidbacteriawerereviewed.

Keywords:molecularbiotechnology;lacticacidbacteria;classificationandidentification

乳酸菌是一群形态代谢性能和生理学特征不完全相同的能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌。目前在自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上可以划分为43个属，包括373个种及亚种，其中绝大多数是厌氧菌或兼性厌氧菌，乳酸菌的自然宿主是人类、动物和植物，在发酵过程中的关键代谢产物是乳酸。由于其代谢产

物对人体健康有益，所以在各类食品中，如酸牛乳、干酪、巧克力和各类保健药品中得到了广泛的应用。

分类鉴定是微生物学的一个重要领域，建立一套精确快速的分类鉴定方法具有重要的意义。传统的微生物分类鉴定方法是利用形态学和生理学特征及其差异来进行的，但是这种经典分类学方法的弊端是耗时耗力，并且在区分一些形态相近的菌株方面存在局限性[1]。随着分子生物学的飞速发展，从分子和基因水平来鉴定乳酸菌已

成为可能,许多新的分子生物学技术正在被用来进行乳酸菌的分类鉴定，如16SrRNA基因间隔区（IntergenicSpacerRegion，ISR）的序列分析技

术、随机扩增多态DNA技术（RandomlyAmplifiedRAPD）、变性梯度凝胶电泳标PolymorphicDNA，

记技术（DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE）、限制性片段长度多态性分析技术（Re－strictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）、扩增片段长度多态性分析技术（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）、DNA芯片技术、肠细菌基因间重复共有序列分析技术（Enterobacte－rialRepetitiveIntergenicConsensusSequences,ERIC）以及重复基因外回文序列分析技术（RepetitiveExtragenicPalindromicSequences,REP）。本文将就以上几种分子生物学技术的方法原理以及各自的优缺点进行阐述。

收稿日期：2008-08-07；

作者简介：张家超，男，硕士，研究方向为乳品生物技术；*通讯作者：张和平，男，教授，博士生导师；基金项目：国家自然科学基金项目（30660135，30760156），教育部新世纪优秀人才支持计划资助项目（NCET-06-0269），国家科技基础条件平台建设项目（2005DKA21208-12）。

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适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学技术

张家超，孙志宏，刘文俊，张和平*

116SrRNA序列分析

原核生物含有3种类型rRNA：23S、16S和

5SrRNA，它们分别含有2,900，1,540和120个核苷酸。5SrRNA虽然容易分析，但是核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；而23SrRNA

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菌中的46株应用传统生理生化方法和RAPD-PCR技术进行了遗传学特征分析，研究结果表明RAPD-PCR技术更能显示出这46株植物乳杆菌

之间的同源性。UlrichSchillinger等[10]从酸乳酪中使用RAPD-PCR技术与11分离出20株益生菌，

株模式菌株电泳图谱进行比对分析，鉴定出这20株菌属于嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）和干酪乳杆菌（L.casei）。G.Spano等[11]从红葡萄酒中分离出一株能产生瓜氨酸和氨，并能起到降低精氨酸作用的菌株，经过RAPD-PCR技术鉴定为植物乳杆菌（L.plantarum）。Hayford等[12]也用此方法对玉米发酵进行研究，发现在玉米发酵中的优势菌种是发酵乳杆菌（L.fermentum）。

含有的核苷酸几乎是16SrRNA的两倍，分析十分困难。通过大量的研究证明16SrRNA的全长约为1540bp，片段长度适中信息量较大且易于

分析。

上个世纪60年代末，Woese首次采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，通过比较各类生物细胞的核糖体RNA特征序列，认为16SrRNA序列作为微生物分类鉴定的依据最为合适。因为rRNA结构既具有保守性，又具有可变性。保守性能够反应生物物种的亲缘关系；可变性则能够揭示出生物物种的序列差异，是种属鉴定的分子基础[2]。在对16SrRNA序列进行测定后，可以通过序列比对分析来完成其种属归类。

近几年，随着测序技术的日益成熟以及测序的市场化，使得16SrRNA序列分析技术在乳酸菌鉴定中得到广泛应用。P.Parola等应用16SrRNA序列分析技术，通过分析序列成功分离鉴定出了败血病人体内的干酪乳杆菌（Lactobacillus

[3]

3变性梯度凝胶电泳标记技术（DGGE）

1979年Fischer和Lennan[13]最先提出了用于检测DNA突变的一种电泳技术———变性梯度凝

胶电泳（DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE）技术。1993年Muzyer等[14]首次将DGGE技术应用于微生物研究，并证实这种方法用于微生物种属鉴定是十分有效的。

DGGE的基本原理是：DNA分子中4种碱基的组成和排列差异，使不同序列的双链DNA分子具有不同的解链温度。当双链DNA分子在含梯度变性剂（尿素、甲酰胺）的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，因其解链的速度和程度与其序列密切相关，所以当某一双链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其解链温度时，即开始部分解链，部分解链的DNA分子的迁移速度随解链程度增大而减小，从而使具有不同序列的。DNA片段滞留于凝胶的不同位置，结束电泳时，只要选择的形成相互分开的带谱。理论上认为，电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，一个碱基差异的DNA片段都可以被区分开。

2007年，MilicaNikolic等人[15]通过PCR-DGGE的方法成功鉴定了当地自制山羊奶干酪中的乳酸菌。2006年，G.Spano等[16]运用DGGE技术成功分析了红葡萄酒中的酒类酒球菌（Oenococcusoeni）和植物乳杆菌（L.plantarum），并指出植物乳杆菌（L.plantarum）是发酵初期的优势菌种。KingsleyCAnukam等[17]运用DGGE技术和16SrRNA序列分析技术相结合的方法对采自尼日利亚健康女性阴道的241株乳酸菌进行了鉴定，鉴定结果表明惰

）是优势菌株，占64%，另外有性乳杆菌（L.iners

7.3%属于加氏乳杆菌（L.gasseri），有6%属于植物

casei）。2002年Booysen等[4]将分离自麦汁中的乳

酸菌进行了分类研究，通过对其16SrRNA序列分析，成功的对实验菌株在亚种水平上进行了鉴定和区分。乌日娜等[5]结合传统生理生化鉴定方法与16SrRNA序列分析技术将实验室一株益生菌鉴定为干酪乳杆菌（L.casei）。2001年，Corseffi等[6]同样运用16SrDNA序列分析技术，成功的对分离自25个小麦酸面包中的317株乳酸菌在种的水平进行了分类鉴定。2000年TerenceR等对

[7]

猪排泄物中的一种能够产抗生素的菌株进行了DNA序列分析，在分析其16SrRNA序列的同时进一步对其4232bp质粒进行分析，最后以16SrRNA基因大于99%的同源性将其鉴定为罗伊乳杆菌（L.reuteri）。

2随机扩增多态DNA技术（RAPD）

随机扩增多态性DNA（RandomAmplified）标记技术是由PolymorphismDNA,RAPD

Williams[8]和Welsh同时发展起来的一种分类鉴定方法。它的基本原理是利用随机引物（一般为8-10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后应用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性，来完成其进化遗传分析。在应用中RAPD技术的优点是简单便捷，在不知道基因组DNA的任何序列信息的情况下就可以进行鉴定；缺点是重复性差，鉴定结果不稳定，很难在种以及亚种的水平上准确鉴定。

2007年IsabelLopez等[9]对120株植物乳杆

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乳杆菌（L.plantarum），有3%属于卷曲乳杆菌（L.crispatus），有2.7%属于鼠李糖乳杆菌（L.rhamno－sus），有2.7%属于阴道乳杆菌（L.vaginalis），有

1.3%属于发酵乳杆菌（L.fermenti），有1.3%属于），有1.3%属于唾液乳杆瑞士乳杆菌（L.helveticus菌（L.salivarus）。Randazzo等[18]也报道了将DGGE分析与RT-PCR相结合的技术来研究干酪生产过程中微生物的构成和代谢活性。

尽管DGGE电泳技术在研究群落动态和多样性方面存在很多优势，但是该技术无法给出代谢活性、细菌数量和基因表达水平方面的信息。因此必须与其它技术相结合才能弥补不足。

测整个生物基因组的多态性。

AFLP的基本原理是对基因组DNA酶切片段进行选择性扩增,将获得的扩增片段通过琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测，根据带型中一些特征条带的出现或消失，检测出不

首先使用同扩增片段长度的多态性。一般而言，两种不同的限制性内切酶对整个基因组DNA进行酶切反应，然后将所得的两端具有不同黏性末端的酶切片段与特异人工接头在T4连接酶的作

用下进行连接，形成选择性扩增的模板，然后用带有选择性碱基的特异引物进行选择性扩增。为使得扩增效果更好，反应一般分两步进行，即预扩增和选择性扩增，最后将获得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，再经EB染色或银染后，清晰呈现片段长度的多态性。该技术建立初期用于植物育种的研究，后来发展成为可以分析任何来源DNA指纹图谱的一项通用技术，近些年来被广泛的应用于乳酸菌的分类鉴定。2007年MatteoBusconi等[25]首次应用AFLP技术对小牛肠道中的乳酸菌菌群进行了分析，他们选取了两只健康小牛肠道中的311株乳酸菌使用该技术完成了分类鉴定，这些乳酸菌被无一例外的分类到8个属，其中最具代表性的是乳杆菌属（169株），其次是链球菌属（99株）。同年，ZhechkoPanayotovDimitrov等对49株分离自健康人类排泄物的乳酸菌进行了分类鉴定，通过对比使用RAPD、PFGE以及AFLP三种分子生物学技术得出结论：RAPD技术是最迅速最便捷的技术，但是重复性不好，鉴定结果不甚准确；PFGE技术虽然鉴定结果稳定且准确，但是耗费人力物力财力最大，实施起来比较困难；而AFLP技术操作相对简单便捷，而且鉴定结果准确，完全可以在种的水平上甚至于亚种的水平上对乳酸菌准确分类鉴定，因此AFLP技术必将成为乳酸菌鉴定的强有力的工具。2001年Torriani等[26]使用AFLP技术成功区分开了植物乳杆菌（L.plantarum）、戊糖乳杆菌（L.pentosus）和类植物乳杆菌（L.paraplan－tarum）。Ventura采用AFLP技术，不经过预扩增，在其中一个预扩增引物加上一个选择性核苷酸组成一对引物，将47株约氏乳杆菌（L.johnsonii）为7个亚类。

4限制性片段长度多态性分析技术（RFLP）

上个世纪八十年代，Bostein[19]首先提出利用

限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）作为标记构建遗传图谱。RFLP基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割基因组特定片段的PCR扩增产物，得到大小不等的DNA片段,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析这些片段，便可以获得个体的差异，从而达到鉴定辨别的目的。

最近几年，PCR与RFLP相结合的技术被普遍的应用于乳酸菌的分类鉴定中。2003年，ElifYavuz等[20]应用RFLP技术对分离自当地的酸酪中的150株乳酸菌进行分类研究，并与九株标准菌株RFLP图谱比较分析，在种的水平上对其进行了鉴定。JohnW等[21]应用PCR-RFLP对拟南芥中的细菌群落进行了菌群分析，通过与模式参考菌株比对，将分离细菌进行了鉴定，其中植物乳杆菌（L.plantarum）为优势菌群。2002年GiraffaG等人[22]对分离自当地不同乳制品中的35株德式乳杆菌（L.delbrueckii）和保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus）在亚种水平上进行了鉴定；并通过比较使用RFLP蛋白基因编码技术与16SrRNA序RFLP蛋白基因编码列分析技术最终得出结论，

技术在亚种水平的鉴定中较之16SrRNA序列分析技术更为有效。Randazzo等[23]应用此技术对分离自绿橄榄中的部分乳酸菌进行研究，发现大部分菌株为干酪乳杆菌（L.casei）和短乳杆菌（L.brevis）。

5扩增片段长度多态性分析技术（AFLP）

1993年荷兰科学家Zabeau和Vos[24]率先提出并发展建立起来一种DNA多态性分析的新方（AFLP），它可以用来检法—扩增片段长度多态性

6DNA探针技术及芯片技术

DNA探针技术是20世纪70年代在基因工

程学基础上发展起来的一项新技术，又称核酸分子杂交技术，具有敏感性高和特异性强等特点。

92张家超等：适用于乳酸菌分类鉴定的分子生物学技术

间保守重复序列（EnterobacterialRepetitiveInter－genicConsensus，ERIC）。

ERIC的中心有一段保守性很高的反向重复

序列,该序列长约44bp。Versalovic等以ERIC的核心序列设计了一对反向引物（ERIC15′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC25′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′），认为ERIC-PCR扩增的是两个相邻的ERIC保守序列之间的区域,由于不同的细菌基因组上的ERIC重复序列的数目和分布不同，从而得到由一系列大小不同片段组成的DNA指纹图谱。此后，这项技术就被广泛用于细菌分类和菌种鉴别。

重复基因外回文序列分析技术（Repetitive-ElementPCR，REP-PCR）是以PCR为基础发展起来的一种针对原核生物的DNA指纹图谱技术。REP-PCR技术的原理是利用特定的引物扩增细菌基因组DNA的重复序列,这些序列在进化过程中高度保守，扩增位于这些序列之间的不同区域可得到不同的图谱，扩增产物经凝胶电泳便可以分析其多态性。经实践研究证明该方法具有简便快捷、重复性好、分辨率高等特点，所以这项技术也成为一种鉴定乳酸菌的新方法。

2001年，FranciseBerthier等对当地两个干酪厂生产的八块干酪中的488株嗜温乳杆菌运用ERIC-PCR技术进行了分类鉴定，其鉴定结果显示，这488株嗜温乳杆菌可以被分为3个种群，其中副干酪乳杆菌（L.paracasei）是超级优势菌群，占到了总数的98.7%。Ventura等采用多种分子标记方法对16株约氏乳杆菌进行分类研究，其中用ERIC标记分为6个亚类，用REP-PCR标记则分为4个亚类，AFLP标记分为7个亚类，ERIC标记与AFLP标记比较有90%-96%的相似性，这也表明这些分子标记技术具有多重共线性。

因为DNA探针技术方法特异、敏感又没有放射性，且不需要进行复杂的纯培养和扩培菌等过程，所以在微生物的鉴定方面应用前景广阔。

DNA探针技术的原理是：两条不同来源的核酸链如果具有互补的碱基序列,就能够特异性的结合而形成分子杂交链。若在已知的DNA或RNA片段上加上可识别的标记（如用32P同位素标记、生物素标记），就可制成DNA探针，用以检测未知样品中是否有与其互补的基因序列，并可进一步判定其与已知序列的相同程度。乳酸菌DNA探针技术是指利用限制性内切酶消化DNA后再用DNA探针来检测产生的DNA片段。DuToit利用DNA探针技术从297株乳杆菌中成功筛选出了益生菌。2003年，Stackebrandt等也应用此项技术对采自当地酸牛乳中的48株乳杆菌在种的水平上成功进行了分类鉴定，鉴定结果表明干酪乳杆菌（L.casei）是明显的优势菌群。

基因芯片是利用核酸杂交原理对未知分子进行检测。将核酸或核酸片段按照一定顺序排列在固相支持物上组成密集的分子阵列。按照其结构基本上可分为两种类型：一种是将待测DNA分子样品固定在固相支持物上并与一系列游离的标记探针杂交，杂交探针或是单一的或是混合的；另一种是按照预先设定顺序将寡核苷酸固定于固相支持物上，再与标记的DNA样品进行杂交，然后由已知的寡核苷酸序列确定被检测的DNA样品。

具体做法是将固相介质（如玻璃片）通过适当机制进行位置固定，再利用高速机械手和连续点样技术将多个DNA均匀地点在固相介质上，为使点样精度保持恒定，要求多针头具备单次取样、连续点样的功能，且自动取样的同时保证高通量和高精度，然后由系统直接通过程序控制连续点样操作。信号的强弱由共聚焦的芯片检测器测量。2006年，BernardBerger等人[27]对12株嗜酸乳杆菌群（L.acidophilusgroup）应用基因芯片技术以及其他分子标记技术进行了分析研究，结果清晰阐释了这一嗜酸乳杆菌群之间的相似性和细微差异性。

8展望

分子生物学技术以其快速、准确、灵敏的优点逐渐成为微生物分类鉴定的主要手段，但是还没有任何一种分子生物学技术可以单独用来鉴定乳酸菌；而传统的表型、生物化学方法鉴定乳酸菌耗时耗力，鉴定结果不稳定，只有将分子生物学方法和传统鉴定方法结合起来鉴定乳酸菌才会更加准确。不难想象，随着技术手段的不断改进、实验操做的逐步规范以及商品化试剂盒研制进程的加快，分子生物学技术必将在乳酸菌的分类鉴定以及进一步研究中发挥更大的作用。

7基因间重复序列分析技术

1990年，Sharples等在对Escherichiacolitls菌株基因组中ds的3’末端区进行分析时首次发现了ERIC片段，命名为“基因间重复单位[IRU（In－tergenicRepetitiveUnit）]序列。随后，Hulton等也鉴定出了相同的重复序列，并命名为肠细菌基因

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