第十七章 病毒基因工程

第十七章 病毒基因工程第一节 病毒载体 第二节 病毒与基因工程

病毒的一般介绍

病毒(virus)是一种介于生命与非生命之间的生命形 式，是最原始的生命体。 病毒结构简单，没有细胞结构，由蛋白质外壳和一 种核酸(DNA或RNA)组成。病毒粒子的体积极其微 小，直径在10~300nm之间，能通过细菌滤器，需 借助电子显微镜才能观察到它的存在。 病毒是一种严格的细胞内寄生生物，必须依赖宿主 细胞内才能完成自身的复制增殖；一旦离开宿主细 胞就失去了增殖能力，但保留了对宿主细胞的感染 能力。

病毒粒子的形状电子显微镜下的病毒粒子呈球形，卵圆形，杆状，丝状 和蝌蚪状等形态，其中以近球形和杆状为多。

10nm

50nm

25nm

50nm

烟草花叶病毒

腺病毒

流感病毒

噬菌体

图17-1 四种代表性病毒的电子显微观察图

病毒几乎可以感染所有的生物体

病毒在生物系统中是一个独立的界(kingdom), 可感 染几乎所有的生物体，在脊椎动物、无脊椎动物、 植物、真菌和细菌(一般称细菌病毒为噬菌体， bacteriophage 或phage)中都有病毒的寄生。 有些病毒的宿主范围宽，可感染多种生物，如禽 流感病毒可感染鸡、鸭、鸟、猪，其中某些分离 株如禽流感病毒H5N1甚至感染人类； 有些病毒的宿主范围窄，只感染一种特定的生物， 如杆状病毒科病毒仅感染某一特定种的昆虫，但 还没有发现病毒的宿主范围超越了原核生物和真 核生物的界限。

病毒的分类

自1892年伊万诺夫斯基(Iwanovski)首次烟草花叶病毒(TMV) 以来，已发现各种病毒4千多种。由于对病毒间的进化关 系知之甚少，以至于还没有一个获得一致赞同的病毒分类 系统。 国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)对病毒的分类原则作了规定，现一般根据 病毒分类依据有病毒的核酸类型(DNA 或RNA,单链还是 双链);病毒粒子的大小、形状、衣壳的对称性、有无囊 膜；有时也根据它们所引起的疾病、传播方式等特征进行 分类。而根据宿主的不同，把病毒分为脊椎动物(包括人 类)病毒、无脊椎动物病毒、植物病毒和微生物病毒4大类。

病毒与基因工程

病毒因其具有结构简单，可通过感染而大量复制， 易于操作和大量获得等特点，所以从一开始就成 为分子生物学与基因工程研究的好材料，并对其 发展起到了积极的推动作用。 自70年代基因工程兴起后，病毒成为基因工程的 改造对象，包括病毒全基因组序列的测定，基因 功能的鉴定，抗病毒药物的开发等，为病毒性疾 病的预防、诊断和治疗提供先进的手段。 病毒作为基因工程的优良载体，在基因

转移与表 达、作物改良、疾病的基因治疗中发挥了巨大作 用。

真核基因表达载体

质粒载体：在真核细胞中进行瞬时表达 整合质粒载体：将外源基因整合到真核细 胞染色体上持续表达 病毒载体：病毒携带外源基因在细胞表达

病毒载体的特点

病毒的衣壳蛋白能够识别细胞受体(acceptor),不需要 额外添加辅助试剂就可直接将外源基因高效导入寄主 细胞； 使用病毒衣壳蛋白、包装重组质粒DNA形成的假病毒 颗粒(pseudovirions),相当于构成了一种高效的转化体 系； 病毒具有能够被宿主细胞识别的有效启动子；

多数病毒在其感染周期中都能够持续地复制，使其基 因组拷贝数达到相当高的水平；有些病毒在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄 主基因组；

病毒载体的安全问题

目前，各种病毒载体已经广泛用于蛋白表 达、疫苗制备、基因转移与基因治疗。但无论是何种病毒载体，在构建和使用过 程中都需要非常重视防止病毒本身的致病 性以保证病毒载体的安全性。

第一节 病毒载体1.1 动物病毒载体1.2 植物病毒载体

1.3 噬菌体载体

1.1 动物病毒载体1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.1.5 1.1.6 1.1.7 SV40载体 痘苗病毒载体 反转录病毒载体 慢病毒载体 腺病毒载体 单纯疱疹病毒载体 杆状病毒载体

1.1.1 SV40载体

SV40(Simian vacuolating virus 40, 猿猴空泡病 毒)是迄今为止研究最为详尽的乳多空病毒 之一，也是第一个完成基因组DNA全序列 分析的动物病毒。 SV40病毒的基因组是环状双链DNA,大小 仅为5243bp,与质粒大小相似，适于基因操 作(图17-2)。

ori t-antigen VP2 VP3

s v40 ge nom e 5243 bpT-antigen VP1

图17-2 SV40 病毒基因组物理图谱及转录示意图

由于SV40病毒包装十分严格，不能包装大 于SV40基因组的DNA分子，因此外源基因 只能通过取代病毒本身的DNA片段进行克 隆。其克隆外源片段的能力有限，只能达 到约2.5kb。

两种类型的SV40病毒载体：置换型和穿梭型

置换型的重组病毒载体：一种是早期置换型病毒 载体，另一种是晚期置换型载体。 在早期置换型病毒载体中，早期基因T抗原基因被 缺失掉，因此重组后的病毒不能在正常的敏感细 胞中进行复制，只能在一种可以持续表达T抗原的 猴肾细胞即COS细胞中才能复制和繁殖。 在晚期取代型载体中，晚期转录区被外源基因取 代。由于缺少晚期基因，病毒DNA不能被包装， 因此必须由辅助病毒提供包装必须的蛋白质，而 辅助病毒本身由于不能表达T抗原而不能复制。

两种类型的SV40病毒载体：置换型和穿梭型

重组的病毒-质粒载体：这是这一类穿梭载体，

该 载体中病毒基因组部分只保留下维持在哺乳动物 细胞中进行复制所必须的有关序列，但它融合上 了一个细菌质粒，因而还能够在大肠杆菌细胞中 进行复制和增殖，从而避免了从培养细胞中抽提 SV40-DNA 的繁琐步骤。 因为载体上只保留了复制序列，没有衣壳蛋白等 基因，不能产生病毒粒子，这种穿梭载体只能使 外源基因在细胞内瞬时表达。 但是载体DNA可以进行复制并产生很多拷贝，依 然可以高水平表达外源基因。

1.1.2 痘苗病毒载体

痘苗病毒(vaccinia virus)为感染哺乳动物细胞的双链线性 DNA病毒，基因组大小在180kb左右，其中有30kb左右为 非必须区，可以被外源DNA片段取代而不影响病毒的复制 与繁殖。 痘苗病毒容易培养、相当稳定并能在大多数哺乳动物细胞 中复制繁殖，因此是一种理想的病毒载体。 由于其基因组很大，因此只能通过先将目的基因克隆到到 转移载体上，然后将重组转移载体与野生型痘苗病毒DNA 共转染哺乳动物细胞，在细胞内发生同源重组而获得重组 痘苗病毒。 由于痘苗病毒本身是一种高效活疫苗，当将一种或者几种 外源基因引入该病毒时，能够构建出多价疫苗株，同时预 防几种病原微生物引起的传染病，这是目前痘苗病毒载体 最吸引人的特点。

1.1.3 反转录病毒载体1.1.3.1 反转录病毒

反转录病毒(retrovirus)为单链RNA病毒，可高效地感染 许多类型的宿主细胞。 病毒进入细胞后，其基因组RNA反转录成双链DNA, DNA进入宿主细胞核并整合在细胞染色体中，且以此 为模板合成病毒基因及子代基因组RNA,然后装配成 病毒颗粒。 反转录病毒基因组大约10kb,含有三个最重要的基因， 即gag(编码核心蛋白)、pol(编码反转录酶)和env(编码病 毒外膜蛋白),并依次由5’向3’方向排列。 env基因中含有病毒包装所必需的序列，同时两端存在 长末端重复区(LTRS),用于介导病毒的整合。

1.1.3.2 反转录病毒载体的构建过程

目前使用的反转录病毒载体主要源于鼠白血病病毒 (murine leukaemia virus, MLV),其中病毒的大部分序列， 如gag、pol和env缺失，仅保留病毒基因组5’、3’端的长末 端重复序列(LTR)(包括启动子、增强子、整合必需序 列)和包装信号 及其相关序列(图17-3)。 携带外源基因(如图17-3中的基因A,B)的反转录病毒 载体需要由能提供Gag、Pol和Env 等结构蛋白的包装 细胞如ProPak(最常用)或PA317等细胞系才能成为成熟 的重组“假病毒粒子”。 “假病毒粒子”有感染细胞的能力，可将外源基因带 入靶细胞中，但是不能在靶细胞中复制 “假病毒粒子”通过LTR序列将外源目的基因随机整 合到靶细胞染

色体上，使外源基因在靶细胞中稳定、 持久地表达。

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