本科毕业论文参考格式

申请学位类别： 理学学士学位

安 徽 医 科 大 学（二号粗楷体，居中） ANHUI MEDICAL UNIVERSITY（二号粗宋体，居中）

本 科 毕 业 论文

（小初号粗宋体，居中）

曼氏血吸虫表膜Sm29基因原核表达…（小三号黑体，居中）

Construction of prokayotic expression plasmid and prokayotic expression …（四号加粗Arial字体，居中）

学 生 姓 名： 学 号： 所属院系专业： 生命科学学院生物技术 论文实习单位：安徽医科大学病原生物学教研室 提交论文日期： 论文答辩日期： 指 导 教 师: 职称 单位

职称 单位 五号宋体

2013年5月（小四号，中文宋体，居中）

目 录（小二黑体）

中

英

文

词

汇

对

照

表………………………………………………………………………………1 中

文

摘

要…………………………………………………………………………………..….……2 英

文

摘

要……………………………………………………………………………………...……3 1

前

言 ……………………………………………………………………………………….……4 2

材

料

与

方

法……………………………………………………………………………….……5 2.1

实

验

材

料……………………………………………………………………………....……6 2.2

实

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方

法……………………………………………………………………..………….…10 3

实

验

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果……………………………………………………………………..…………….…18 4

讨

论…………………………………………………………………………………………

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.…20 5

结

论……………………………………………………………………………………….……21 6

参

考

文

献………………………………………………………………………..……….……22

附录：致谢…………………………………………………………………… 24

中英文词汇对照表（小二黑体）

英文缩写 英文全名 PCR E.coli Amp Kana LB IPTG SDS PAGE

中文全名

聚合酶链反应 大肠杆菌 氨苄青霉素 卡那霉素 LB 培养基

异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺电泳

1

polymerase chain reaction Escherichia coli ampicillin kanamycin

luria-Bertani medium isopropylthio-β-D-galactoside sodium dodecyl sulphate

Polyacrylamide gel electrophoresis

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TEMED tetramethyl ethylene diamine APS PBS PBST EDTA HRP OD

四甲基乙二胺 过硫酸铵 磷酸盐缓冲液 磷酸盐吐温缓冲液 乙二胺四乙酸 辣根过氧化物酶 光密度

ammonium Persulfate phosphate buffer saline phosphate buffer saline tween ethylene diaminetetra-acetic acid horseradish peroxidase optical density

曼氏血吸虫表膜Sm29基因原核表达质粒的

构建与表达（小二黑体） 中文摘要（小二黑体）

目的 为鉴定抗日本血吸虫表膜rSj29单克隆抗体能否识别曼氏血吸虫表膜蛋白rSm29，为进一步研究抗日本血吸虫表膜rSj29单克隆抗体的作用打下基础。 方法 根据曼氏血吸虫Sm29基因已知序列设计合成一对引物，体外合成Sm29基因；将Sm29基因定向克隆入pET28a，转化感受态BL21/DE3菌；酶切鉴定筛选得到的重组阳性克隆。IPTG诱导pET28a-Sm29转化的BL21/DE3菌，SDS-PAGE和Western-blotting分析表达产物并鉴定抗日本血吸虫表膜Sj29单克隆抗体能否识

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别表达产物。

结果 成功构建曼氏血吸虫 Sm29基因原核表达质粒；pET28a-Sm29转化的BL21/DE3菌经IPTG诱导表达，SDS-PAGE结果显示诱导后出现一新的表达产物（约21kDa）；Western-blotting结果显示抗6×His-Tag抗体能特异性识别该蛋白，而抗日本血吸虫表膜rSj29单克隆抗体不能识别该蛋白。

结论 该抗日本血吸虫表膜rSj29单克隆抗体对曼氏血吸虫病没有诊断价值。 关键词 曼氏血吸虫 膜蛋白 原核表达

Construction of prokayotic expression plasmid and prokayotic expression of Sm29 gene of Schistosoma

mansoni（小二号Times New Roman粗体）

Abstract（小二号Times New Roman粗体）

Objective: To explore the value of anti-rSj29 monoclonal antibody on detection of rSm29.

Methods: A couple of primers were designed according to the known sequence of Schistosoma mansoni Sm29 and the Sm29 gene was synthesized in vitro. By cloning Sm29 gene into a prokaryotic expression vector, pET28a-Sm29, a recombinant

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pET28a-Sm29 was constructed and transferred into E.coli BL21/DE3. The positive recombinant pET28a-Sm29 was screened and identified by agarose gel electrophoresis and endonuclease digestion. The BL21/DE3 which was transformed with pET28a-Sm29 was induced by IPTG, and the expressed protein was analyzed by SDS-PAGE and Western-blotting.

Results: The specific fragment of Sm29 was amplified and the recombinant prokaryotic expression plasmid pET28a-Sm29 was successfully constructed. After being induced by IPTG, the transformed BL21/ DE3 expressed an about 21 kDa protein which was fused with His-tag. This protein could be recognized by anti-6×His-Tag antibody and could not be recognized by anti-rSj29 monoclonal antibody in Western-blotting.

Conclusion: There is no value of anti-rSj29 monoclonal antibody on detection of rSm29. （以上为：小四号Times New Roman）

Key words Schistosoma mansoni / membrane protein / prokayotic expression

曼氏血吸虫 Sm29基因原核表达质粒的构建（小二号黑体）

1 前言（一级标题，四号黑体，下同）

血吸虫病(schistosomiasis)是由寄生于人体的血吸虫引起的以虫卵肉芽肿和肝纤维化为主要特征的人兽共患寄生虫病，呈世界性分布。2001年10月9日至14日世界卫生组织（WHO）在日内瓦召开的预防与控制血吸虫病和土源性蠕虫病专家委员会联席会议讨论中指出，目前人类血吸虫病主要由曼氏血吸虫(S. mansoni)、日本血吸虫(S. japonicum)、埃及血吸虫(S. hacmatobium)、间插血吸虫（S. intercalatum）和湄公血吸虫（S. mekongi）引起，主要流行于发展中国家[1]。就人

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体感染寄生虫后死亡率而言，血吸虫病在全球范围是最严重的[2]，全球每年仍有 2 亿人口感染血吸虫病并有25万人死于血吸虫病。就疾病引起的社会经济负担与公共卫生重要性而言，目前血吸虫病依然是不容忽视的全球性社会公共卫生问题[3,4]。

曼氏血吸虫病是血吸虫病中分布最为广泛、病人数最多的，其分布于阿拉伯半岛、非洲和拉丁美洲的54个国家，受威胁人数约4～5亿[5]。我国虽然不是曼氏血吸虫主要流行地区，但是近年来，随着外出旅游、务工人群的增加，这些人群很可能在流行地区感染曼氏血吸虫病并将疾病带回国内，因此，如何及早诊断曼氏血吸虫病也是我们需要密切关注的问题。

血吸虫病诊断主要包括病原学诊断和免疫学诊断。病原学诊断是曼氏血吸虫病的主要确诊方法，但由于病原学诊断费时、费力，人群的依从性逐渐下降，更主要的是其敏感性不高（特别是对轻度感染者），故限制了该法在大规模筛查中的应用[6]。免疫诊断方法具有敏感性高、使用方便等优点，已在流行区广泛应用[6-8]。

血吸虫病免疫学诊断包括抗体检测和循环抗原检测[9]。血吸虫病抗体检测方法多样，较常用的为环卵沉淀试验(COPT)、间接血凝(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和酶联免疫转移印迹(EITB)等，方法各具优缺点，目前使用最为广泛的是ELISA 和 IHA 等；循环抗原指由寄生于宿主门静脉系统内的血吸虫成虫所不断释放进入血流和尿液的分泌物、排泄物以及不断更新的表膜蛋白这些抗原物质。血吸虫循环抗原的提取，鉴定和分析研究为体液中循环抗原的检测提供了线索，随着生物技术的发展，循环抗原的检测方法也更趋敏感和特异性[10]。一般认为血吸虫循环抗原的检测具有反映活动性感染、估计虫荷和考核药物疗效的优点。上世纪80年代至今，国内外寄生虫学者已把单克隆抗体技术引入到血吸虫病防治，因而可以定性或定量检测宿主血清中循环抗原[11]。单克隆抗体是指在一株B淋巴细胞系中的每个细胞只能产生一种它所专有的、只针对一种它识别的抗原决定簇的抗体，具有理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强，少或无血清交叉反应等特点。

实习单位病原生物学教研室任翠平等[12]利用单克隆抗体技术获得了两株特异性分泌抗Sj29单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经过体外多次传代培养后，仍能分泌

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高效价的抗体，细胞上清效价稳定在 1:800~1:3200之间。用BALB/c小鼠大量制备单抗腹水并纯化第1株单抗腹水，ELISA法测效价为1.024×105以上。Western-blotting和免疫荧光定位的结果证实两株细胞均为分泌抗日本血吸虫膜蛋白Sj29单克隆抗体的杂交瘤细胞株。与此同时，制备和初步纯化多抗建立了双抗体夹心ELISA实验方法，在检测日本血吸虫病人血清中循环抗原中具有较好的初步应用价值。

曼氏血吸虫Sm29是近年来发现的一种血吸虫表膜蛋白[13]，经Blast基因序列对比发现，曼氏血吸虫表膜Sm29基因与日本血吸虫表膜Sj29基因序列具有69%的相似度，曼氏血吸虫表膜Sm29蛋白与日本血吸虫表膜Sj29蛋白氨基酸序列55%的同源性。本室已在体外成功扩增出曼氏血吸虫Sm29基因片段并进行了序列分析。本文采用基因重组技术, 将扩增得到曼氏血吸虫Sm29基因并定向克隆入pET28a(+) Vectors原核表达载体并进行了原核表达，并用Western-blotting鉴定抗日本血吸虫表膜rSj29单克隆抗体能否识别曼氏血吸虫表膜蛋白rSm29，为进一步研究抗日本血吸虫表膜rSj29单克隆抗体的作用打下基础。

2 材料与方法

2.1 实验材料（二级、三级标题，小四号黑体，下同） 2.1.1 菌株

曼氏血吸虫pUC57-Sm29∕XLI-Blue、大肠埃希菌(E.coli)菌株 XL1-Blue、BL21 和表达质粒 pET28a (+) Vectors、纯化抗rSj29小鼠单克隆抗体腹水由本室保存。 2.1.2 主要实验试剂

T4 连接酶、DL2000 Marker、低分子量蛋白Marker购自MBI公司；限制性内切酶EcoR I、限制性内切酶Xho I、DNA连接试剂盒购自Takara公司；TEMED购自Promega公司；氨苄青霉素、卡那霉素、抗6×His-Tag抗体、质粒小量抽提试剂盒及胶回收纯化试剂盒购自生工生物(上海)有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG购自北京中衫金桥生物技术公司；ECL化学发光试剂盒购自Pierce公司；

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NC膜购自Millipore公司；IPTG、甘氨酸、Tris 购自 Sigma 公司；琼脂、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司；SDS、APS、考马思亮蓝、丽春红、丙烯酰胺、N，N’--亚甲双丙烯酰胺、购自 Amerasco 公司；其余试剂为国内分析纯。 2.1.3 部分试剂配制 PBS (0.01M, PH7.4)

PBST

LB 液体培养基

LB 固体培养基

氨苄青霉素/卡那霉素(100mg/ml) 20% IPTG (M/V)

50×TAE 电泳缓冲液

NaCl

8.00g Na2HPO4·12H2O 3.59g KH2PO4 0.24g KCl

0.20g

去离子水加至1000ml。

即在PBS中加Tween 20至终浓度为0.1%。 胰蛋白胨 1.0g 酵母提取物 0.5g NaCl

1.0g 去离子水加至100ml，用NaOH调PH值7.2-7.4之间，高温灭菌后储存于 4℃。

在LB液体培养基基础上按每100ml加入1.5g琼脂，高温灭菌后备用。

1.0g溶于10ml去离子水中，0.22μm滤器过滤，-20℃保存。

8ml H2O 加 2.0g IPTG 定容至 10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装1ml，-20℃保存。

Tris 242.0g 冰醋酸

57.1ml EDTA (Na2EDTA?2H2O) 37.2g 溶解加水至 1000ml。

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10%SDS

2×蛋白上样缓冲液

30%丙烯酰胺溶液

10%过硫酸铵(APS) 1.5M Tris-HCl (PH8.8)

0.5 M Tris-HCl (PH6.8)

12%分离胶(5ml)

5%浓缩胶(2ml)

90ml 水溶 10.0g SDS，加热助溶(68℃)，定量至 100ml。

1M Tris-HCl(PH6.8) 1.0ml β-巯基乙醇 1.0ml 10%SDS 4.0ml 0.1%溴酚兰 0.5ml 甘油 2.0ml 去离子水

1.5ml 丙烯酰胺

29.0g N，N’--亚甲双丙烯酰

1.0g

去离子水加至 100 ml(37℃助溶)。

1.0g APS溶于10ml水中，4℃保存数周。

Tris 18.16g溶于70ml水，调PH至8.8，用水补至 100ml，4℃保存。

Tris 6.05g 溶于 70ml 水，调 PH 至 6.8，用水补至 100ml，4℃保存。 去离子水 1.6ml 30%丙烯酰胺溶液 2.0ml 1.5M Tris-HCl(PH8.8) 1.3ml 10%SDS 0.05ml 10%过硫酸胺 0.05ml TEMED

0.002ml 去离子水 1.4ml 30%丙烯酰胺溶液 0.33ml 0.5 M Tris-HCl(PH6.8) 0.25ml 10%SDS 0.02ml 10%过硫酸胺 0.02ml TEMED

0.002ml

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考马思亮蓝染液 脱色液

SDS-PAGE 电泳缓冲液

0.25g 考马思亮蓝 R250 溶于 100ml 脱色液中，用 1 号 Whatman滤纸过滤后，室温保存。

按甲醇:冰乙酸:水=45:10:45 比例配制，室温保存。 甘氨酸 Tris 10%SDS

去离子水加至 1000ml。

18.8g 3.02g 10.0ml

丽春红染液的配制

丽春红 三氯乙酸 磺基水杨酸

2.0g 30.0g 30.0g

溶于 100ml 水。使用时取 1 份上述贮存液加 9 份去离子水即可。

转移缓冲液

甘氨酸 Tris SDS 甲醇

去离子水加至 1000ml。

2.90g 5.80g 0.37g 200ml

2.1.4 实验主要仪器 LQG157A 台式高速离心机 凝胶成像系统

UV-2102C 型紫外可见分光光度计 DK-8D 型电热恒温三孔水槽 隔水式恒温培养箱 FA1104 电子天平 PHS-3D 精密数显酸度计 TY-80R 脱色摇床

珠海黑马医学仪器有限公司 天能科技（上海）有限公司 尤尼柯(上海)仪器有限公司 上海跃进医疗器械有限公司 上海一恒科技有限公司 上海精密科学仪器厂 上海天达仪器有限公司 江苏金坛市医疗器械厂

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WD-9405B 型水平摇床 微波炉 电泳仪

U410-86 超低温冰箱 普通冰箱

SW-CJ-IB型单人单面净化工作台 纯水机 HVE-50高压锅 CXG-1电脑恒温层析柜 HJ-2双头磁力加热搅拌器 Trans-Blot SD半干转膜仪 制冰机

北京六一仪器厂 格兰仕电器公司 BIO-RAD公司 NBSC 公司 合肥美菱冰箱厂 苏州净化设备有限公司 艾科浦公司 Hirayama公司

上海沪西分析仪器厂有限公司 金坛市杰瑞尔电器有限公司 BIO-RAD公司 SANYO公司

4500SF全自动数码凝胶化学发光图天能科技（上海）有限公司 像分析系统

DNP-9162电热恒温培养箱 2.2 实验方法

2.2.1 Sm29基因原核表达重组质粒的构建和鉴定 2.2.1.1 细菌的培养及阳性克隆的挑选保存

1）无菌操作台中，取实验室冻存的已测序鉴定过的菌种pUC57-Sm29∕XL1-Blue一支，融化后用接种环沾取少量菌液,在含氨苄青霉素(Amp)抗性的LB固体培养基上进行四区划线；

2）另取实验室冻存的pET28a∕XL1-blue空表达载体一支，融化后用接种环沾取少量菌液，在含卡那霉素（kana）抗性的LB固体培养基上进行四区划线； 3）做好标记，将两块平皿置于37℃恒温培养箱中倒置培养12-16个小时； 4）无菌操作台中，分别挑取单个菌落，接种到3mL 1mmol/L相应抗生素的液体LB的离心管中，于37℃，210rpm振荡培养12-16个小时；

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上海三发科学仪器有限公司

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5）留菌种：无菌操作台中，100μL 30%高压过的甘油加100μL过夜菌液保存至0.5mL EP管中，混合均匀，做好标记，于－20℃保存（长期保存应放置于－80℃或液氮中）； 2.2.1.2 质粒的制备

将留菌种后剩余菌液全部用于质粒制备，具体操作步骤按生工生物 (上海)有限公司质粒小提试剂盒操作说明进行。 2.2.1.3 质粒DNA的限制性内切酶酶切鉴定

1）双酶切：用EcoRⅠ和XhoⅠ同时双酶切重组pUC57-Sm29载体和空表达载体pET28a，37℃水浴2h； 酶切体系（μL)：

plasmid 10×H buffer EcoR I Xho I ddH2O 总体积

pUC57-Sm29

6 1 0.5 0.5 2 10

pET28a 6 1 0.5 0.5 2 10

2） 琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖凝胶）：分别将酶切产物与2 μL 6×loading buffer充分混合，开始上样，上样顺序为： pET28a酶切产物，pUC57-Sm29酶切产物，DNA marker DL2000。90V电泳30min； 3）小心将胶取出并快速于紫外灯下观察、拍照； 2.2.1.4 DNA片段的回收

1）将酶切鉴定结果正确的重组pUC57-Sm29载体和空表达载体pET28a质粒用EcoRⅠ和XhoⅠ同时进行双酶切，37℃水浴2h； 酶切体系（μL)：

plasmid 10×H buffer EcoR I

pUC57-Sm29

12 2 1

11

pET28a 12 2 1

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Xho I ddH2O 总体积

1 4 20

1 4 20

2） 琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖凝胶）：分别将酶切产物与4μL 6×loading buffer充分混合，开始上样，上样顺序为： pET28a酶切产物，pUC57-Sm29酶切产物，DNA marker DL2000。90V电泳30min； 3）小心将胶取出并快速于紫外灯下观察；

4） 将鉴定正确的片段进行胶回收,按生工生物 (上海)有限公司胶回收试剂盒操作

说明进行：分别回收重组的pUC57载体上的目的片段(小片段)和表达载体pET28a上的载体片段(大片段)；

5）将部分胶回收产物进行琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖凝胶）鉴定，拍照； 2.2.1.5 目的片段与表达载体的连接（DNA重组）

将鉴定正确的胶回收产物部分用于连接：按6:2摩尔比将此二片段4℃连接过夜；

连接体系（μL)：

Sm29 pET28a T4 ligase T4 buffer 总体积

6 2 1 1 10

2.2.1.6 CaCl2法制备XL1-BLue感受态细胞(BL21感受态细胞制备方法相同) 1) 从－80℃冰箱取 XL1-BLue 菌种，无菌操作台中在 LB(无抗生素)平板上划线，37℃生化培养箱过夜培养(14-16h)；

2) 从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有 3mL LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜；

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3) 将菌液按 1:50 的比例接种到 LB 培养基中，37℃ 210rpm培养至 OD600约为 0.3到 0.5(对数生长前期或对数生长期)，然后置于冰浴中 30min； 4) 无菌操作台中，用预冷的 1.5mL 离心管收集菌液，4℃ 4000rpm离心 5min； 5) 弃上清，用预冷的 0.3ml/管 0.1M CaCl2重悬菌体，冰水浴 10min，然后 4℃4000rpm 离心 5min；弃上清，加入预冷的 0.1MCaCl2 0.12mL/管，轻轻重悬菌体，置于冰水浴中 15min；

6) 加入等体积的 30%无菌甘油，混匀后立即置于-80℃保存。 2.2.1.7 连接产物转化至XL1-BLue感受态细胞扩增重组质粒

1) 无菌操作台中，在一EP管中将10μL连接产物加入到一支200μL XL1-BLue感受态细胞中轻轻混匀； 2) 冰浴30 min；

3) 42℃水浴1.5 min(热休克)，不摇动管，立即至冰浴2 min； 4) 无菌操作台中，每一EP管加400μL 液体LB培养基；

5) 37℃，150rpm，温育45 min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；

6) 12000 rpm，2min，离心，弃400μL上清；

7) 无菌操作台中，剩余重悬菌体，将其加入含质粒编码的抗生素抗性的固体LB平皿，并用涂布器涂布；

8) 37℃孵育箱放置20 min，待铺板菌液被吸收； 9) 37℃孵育箱倒置过夜。

2.2.1.8阳性克隆的挑选、鉴定及保存

1）无菌操作台中，挑取前日转化的pET28a-Sm29 (XL1-Blue)单菌落接种到3mL 1mmol/L卡那霉素抗性的液体LB的离心管中，于37℃，210rpm振荡培养12-16个小时；

3）留菌种：无菌操作台中，100μL 30%高压过的甘油加100μL过夜菌液保存至0.5mL EP管中，混合均匀，做好标记，于－20℃保存；

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4）质粒的制备：将留菌种后剩余菌液全部用于质粒制备，具体操作步骤按生工生物 (上海)有限公司质粒小提试剂盒操作说明进行；

5）双酶切：用EcoRⅠ和XhoⅠ对所提质粒进行酶切，37℃水浴2h； 酶切体系（μL）： pet28a-sm29 plasmid

10×H buffer EcoR I Xho I ddH2O 总体积

6 1 0.5 0.5 2 10

6）琼脂糖凝胶电泳：分别将酶切产物与2μL 6×loading buffer充分混合，开始上样，上样顺序为： DNA marker DL2000，酶切产物。90V，电泳30min； 7）小心将胶取出并于紫外灯下观察、拍照； 2.2.2 重组的Sm29基因在大肠杆菌中的表达

2.2.2.1重组表达质粒 pET28a-Sm29转化至感受态细胞BL21进行原核表达 将鉴定正确的重组表达质粒 pET28a-Sm29 1μL转化至200μL BL21感受态细胞,转化步骤同前述； 2.2.2.2 IPTG诱导表达蛋白

1）无菌操作台中，挑取单个重组菌落，接种于3mL 1mmol/L卡那霉素溶液的LB离心管中，于37℃，210rpm振荡培养12-16个小时；

2）留菌种：无菌操作台中，100μL 30%无菌甘油加100μL过夜菌液，混合均匀，做好标记，于－20℃保存；

3）无菌操作台中，取200μL过夜菌，接种于10mL 1mmol/L卡那霉素溶液的LB离心管中，于37℃，210rpm振荡培养；

4）培养1h后打开紫外分光光度仪预热，1.5h后无菌操作台中，取1mL菌液测OD600=0.6-1.0之间，如果没有达到0.6，继续培养，20min后再测，直至OD600=0.883；

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5）无菌操作台中，取1mL菌液留用向剩余菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L继续培养，分别在 1h、3h、5h 收集 1mL菌液留用；

6）将上述培养不同时刻的菌液1200rpm离心2min，弃上清；沉淀用50μL 1×PBS重悬；

7）加入等量的2×SDS蛋白上样缓冲液重悬后，沸水浴8min 处理后做 SDS-PAGE； 2.2.2.3 SDS-PAGE 操作步骤

1) SDS-PAGE12%凝胶配制，配方如下: 去离子水 30%丙烯酰胺溶液

1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 缓冲液 0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl 缓冲液 10%SDS 10%过硫酸铵 TEMED 总体积

12%分离胶 1.6mL 2.0mL 1.3mL － 50μL 50μL 2μL 5mL

5%浓缩胶 1.4mL 0.33mL － 0.25mL 40μL 40μL 2μL 2mL

2）安装好玻璃板，迅速在两玻璃板间灌注 12%分离胶溶液，预留 1.5cm 灌注浓缩胶，在丙烯酰胺溶液上层轻轻覆盖双蒸水或异丙醇，将凝胶置于37℃恒温箱中30min；

3) 分离胶聚合后倾出覆盖液体，并用滤纸吸净残留液体；

4) 在已经聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即插入梳子，避免气泡产生； 5) 浓缩胶聚合后小心拔出梳子，立即用水洗涤加样槽，以除去未聚合的丙烯酰胺； 6) 安装好电泳装置，内外槽都加入电泳缓冲液，用微量加样器在加样孔加入样品和低分子量蛋白质标准，蛋白样品上样量每孔20μL，蛋白分子量标准3μL，上样顺序：0h样品，1h样品，3h样品，5h样品，蛋白分子量标准；

7) 电泳:浓缩胶 55V，30min，分离胶 110V，60min，直至溴酚蓝到达分离胶的底部，关闭电源；

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8) 剥胶及染色：取出凝胶放入考马斯亮蓝R-250染色液中，置脱色摇床缓慢摇动10-16h；

9) 脱色:去净染液后，加脱色液置脱色摇床上缓慢摇动，至背景干净条带清晰为止。观察重组蛋白条带的有无和位置。

2.2.3 rSm29融合蛋白免疫印迹法(Western blotting)鉴定

蛋白按常规进行SDS-PAGE，上样顺序：蛋白分子量标准，未诱导样品，诱导5h样品；NC膜电转印，5%脱脂奶粉4℃封闭16-18h，取出后加入抗6×His-Tag(用封闭液按1:100稀释)37℃孵育2h，PBST洗涤后用HRP-标记的山羊抗兔IgG(用PBST 1:20,000稀释) 37℃孵育1h，PBST洗涤后行化学发光(ECL)显色。 2.2.3.1样品 SDS-PAGE

样品 SDS-PAGE 同前，上样顺序：蛋白分子量标准，未诱导样品，诱导5h样品，未诱导样品，诱导5h样品； 2.2.3.2 半干转膜

1) 电泳结束后，戴上手套，准备好一张NC膜和2张滤纸，大小应与凝胶大小吻合，将膜、滤纸和海绵一起浸泡在转移缓冲液中；

2) 在半干转膜仪上从下到上依次铺上滤纸，NC膜，精确对齐，勿有气泡； 3) 从电泳槽上撤下放置 SDS-PAGE 凝胶的玻璃，小心将凝胶铲起，平铺在NC膜上，精确对齐，然后用一玻璃棒做滚筒以挤出气泡； 4) 最后将滤纸和海绵放在凝胶上方，各层精确对齐并排除气泡； 5) 盖好转膜仪顶盖，接通电源，恒压15V，转移22min；

6) 断开电源，凝胶同前进行染色，以便检查蛋白质是否转移完全； 2.2.3.3 封闭

1) NC 膜转移至含有1×丽春红染液的平皿中，轻轻摇动染色 10min 左右； 2) 蛋白条带出现后，将膜按泳道剪出条带（暂不剪断），同时在目的条带上下用圆珠笔做好标记，再用自来水漂洗NC膜，摇床脱色直至颜色褪去； 3）封闭：把膜放入5%脱脂牛奶封闭液（用PBST配制），4℃，摇床过夜； 2.2.3.4一抗孵育

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1）剪下每个条带，剪成合适尺寸，取出0h和5h条带装入用抗6×His-Tag抗体，封闭液按1:100配成的EP管中，另取出0h和5h条带装入用纯化抗rSj29小鼠单克隆抗体腹水，封闭液按1:100配成的EP管中，将两支EP管37℃恒温孵育2h；

2）将EP管中的条带取出放入平皿中，用PBST洗4次，每次15min； 2.2.3.5二抗孵育

1) 将用抗6×His-Tag抗体孵育的条带放入用PBST以1:20,000稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG的平皿；将用纯化抗rSj29小鼠单克隆抗体腹水孵育的条带放入用PBST以1:20,000稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG的平皿，将两个平皿37℃恒温孵育1h； 2）用PBST漂洗条带4次，每次15min； 2.2.3.5 化学发光(ECL)显色并拍照。

3 实验结果

3.1 Sm29基因克隆的酶切鉴定

分别将pET28a和pUC57-Sm29∕XLI-Blue阳性克隆进行双酶切(EcoRⅠ和Xho

Ⅰ)鉴定。产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，分别得到长约5000bp的片段（大片段）和约570bp的片段（小片段），其酶切图谱与预期一致，可进行下一步胶回收，如图1所示。

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图 1 pET28a质粒和pUC57 -Sm29 重组质粒的双酶切鉴定

1: pET28a质粒双酶切产物，2: pUC57 -Sm29 重组质粒双酶切产物， M:DL 2000 Marker Fig.1 restriction endonuclease analysis of pET28a plasmid and pUC57-Sm29 recombinant plasmid

3.2 重组表达质粒 pET28a-Sm29的双酶切鉴定及蛋白表达

pET28a-Sm29重组质粒分别用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，分别得到长约570bp的片段，其酶切图谱与预期一致，如图2所示。诱导前及诱导后各时相的蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳检测，诱导后有新条带出现，该条带与目的条带大小相近，在约21KD处见明显的特异性蛋白质区带，如图3所示。

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图 2 重组表达质粒 pET28a-Sm29的双酶切鉴定 1: pET28a-Sm29双酶切产物，M:DL 2000 Marker

Fig.2 Identification of pET28a-Sm29 plasmid by restriction endonuclease analysis

Sm29 图3 Sm29 诱导表达及SDS-PAGE 分析

1:诱导前菌体，2:菌体诱导1h，3:菌体诱导3h，4:菌体诱导5h，M:低分子量蛋白Marker。

Fig.3 SDS-PAGE analysis of protein expression

3.3 Sm29融合蛋白的 Western-blotting鉴定

免疫印迹分析, 该蛋白能特异地被抗6×His-Tag(1∶100稀释)识别，于约21kDa 位置有一条条带。本室先前制备的抗日本血吸虫表膜rSj29单克隆抗体不能识别该蛋白。如图4所示。

图 4 rSm29蛋白的 Western blotting 分析

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1: pET28a-Sm29诱导前，抗6×His-Tag，2: pET28a-Sm29诱导5h抗6×His-Tag，3: pET28a-Sm29

诱导前，纯化抗rSj29小鼠单克隆抗体腹水，4: pET28a-Sm29诱导5h，纯化抗rSj29小鼠

单克隆抗体腹水

Fig.4 Western blotting analysis of rSm29 protein

4 讨论

4.1 曼氏血吸虫表膜rSm29 蛋白的表达及鉴定

血吸虫的表皮曾被认为是无活力，只是有保护作用的“角皮”。但深入的研究发现，它是覆盖整个虫体的“合胞体”结构[14,15]。表皮在与宿主相互作用的过程中参与营养吸收、免疫逃避及免疫调节、排泄代谢产物、调节渗透压、感觉和信号转导等生理过程。血吸虫表面膜蛋白(表膜)是血吸虫虫体与宿主免疫系统直接接触的界面，也是宿主免疫细胞和免疫分子与虫体相互作用的界面。因表膜蛋白更易接触机体的免疫系统，刺激机体产生相对应的抗体，大多研究都支持虫体的表膜蛋白较其他蛋白有较好的诊断价值，表膜抗原用于检测感染血清中的抗体是血吸虫免疫诊断的重要方法之一[14,16]。因此寻找具有诊断价值的膜蛋白是许多科学工作者的研究兴趣。

本研究参考文献[2,13]，初步了解到Sm29是一血吸虫膜蛋白，因此构建了曼氏血吸虫Sm29基因的原核表达重组质粒pET28a-Sm29。pET28a-Sm29转化的BL21/DE3菌经IPTG诱导表达与His-Tag融合的蛋白（约21kDa），Western-blotting结果显示抗6×His-Tag抗体能特异性识别该蛋白，进一步验证了rSm29蛋白的表达，与预期结果相符。

4.2 日本血吸虫膜蛋白 rSj29 抗体检测价值的评估

据报道日本血吸虫与曼氏血吸虫虫卵卵壳成分中氨基酸组成非常相似[17]，朱荫昌等[18]认为曼氏血吸虫与日本血吸虫虫卵抗原存在着共同抗原成分，他们的研究结果显示日本血吸虫的虫卵抗原用于检测曼氏血吸虫病同样具有很高的敏感性和特异性。

通过Blast基因序列对比，我们发现曼氏血吸虫Sm29基因与日本血吸虫Sj29

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基因具有基因序列具有69%的相似度，曼氏血吸虫表膜Sm29蛋白与日本血吸虫表膜Sj29蛋白氨基酸序列55%的同源性。我们由此推测抗rSj29单克隆抗体能够特异性识别rSm29蛋白。本研究使用实习单位病原生物学教研室所纯化的抗rSj29小鼠单克隆抗体腹水对表达的rSm29蛋白进行Western-blotting鉴定。实验结果显示，抗rSj29单克隆抗体不能够特异性识别rSm29蛋白，即该rSj29单克隆抗体不能用于诊断曼氏血吸虫病。

5 结论

本研究成功地构建了原核表达重组质粒pET28a-Sm29并进行了原核表达，Western-blotting结果显示该日本血吸虫表膜rSj29单克隆抗体对曼氏血吸虫病没有诊断价值。

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附录：

致 谢

弹指一挥间，四年的大学生活转瞬即逝。这四年来，在学习和生活上，有很

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安徽医科大学本科毕业论文

多老师和同学帮助过我，让我深深体会到集体力量的伟大。在此，特向培养和帮助过我的各位老师和同学表示最挚诚的谢意。

本篇论文是在沈际佳教授的悉心指导下，实验室其他老师的热情关心下完成的。在此我要向沈教授致以最诚挚的敬意和感谢，谢谢他在实验过程中给予的极大帮助！沈教授学识渊博、思维缜密、思路清晰，不仅开拓了我的实验思维更培养了我主动学习的能力，使我受益匪浅。他为人和蔼可亲，耐心，细致。他一切以研究为重心的端正、高尚的科研态度，甘为人梯默默奉献的无私精神亦深深感动了我，教育了我。

在这短暂的实习生活中沈教授给了我莫大的启迪，使我学会了很多实验技能，为我以后的实验操作打下了坚实的基础，也为我完成这篇论文提供了巨大的帮助。今后我必将恩师作为自己毕生学习的榜样，时刻警戒自己要做一名合格的研究探索者。

另外，我还要感谢任翠平老师、刘淼老师、周胤老师和冯睿老师在我实习期间为我提供的帮助。同时还要感谢安徽医科大学病原生物学教研室的其他各位老师、学姐、还有我的实习同伴甘璟璟、尹亭亭对我的无私帮助，使我得以顺利完成论文。

最后，再次对关心和帮助过我的老师和同学们表示衷心地感谢！

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多老师和同学帮助过我，让我深深体会到集体力量的伟大。在此，特向培养和帮助过我的各位老师和同学表示最挚诚的谢意。

本篇论文是在沈际佳教授的悉心指导下，实验室其他老师的热情关心下完成的。在此我要向沈教授致以最诚挚的敬意和感谢，谢谢他在实验过程中给予的极大帮助！沈教授学识渊博、思维缜密、思路清晰，不仅开拓了我的实验思维更培养了我主动学习的能力，使我受益匪浅。他为人和蔼可亲，耐心，细致。他一切以研究为重心的端正、高尚的科研态度，甘为人梯默默奉献的无私精神亦深深感动了我，教育了我。

在这短暂的实习生活中沈教授给了我莫大的启迪，使我学会了很多实验技能，为我以后的实验操作打下了坚实的基础，也为我完成这篇论文提供了巨大的帮助。今后我必将恩师作为自己毕生学习的榜样，时刻警戒自己要做一名合格的研究探索者。

另外，我还要感谢任翠平老师、刘淼老师、周胤老师和冯睿老师在我实习期间为我提供的帮助。同时还要感谢安徽医科大学病原生物学教研室的其他各位老师、学姐、还有我的实习同伴甘璟璟、尹亭亭对我的无私帮助，使我得以顺利完成论文。

最后，再次对关心和帮助过我的老师和同学们表示衷心地感谢！

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