AFLP简介方法、及所用引物

AFLP(扩增片段长度多态性)分子标记实验

扩增片段长度多态性Amplified fragment length polymorphism（AFLP）是在随机扩增多态性（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术上发展起来的DNA 多态性检测技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点，不需象RFLP分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性

研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。

其基本原理是：以PCR(聚合酶链式反应)为基础，结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。

一、 实验材料

采用青稞叶片提取总DNA。

二、 实验设备

1.美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统，

2.美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机，

3.美国MJ公司PCR仪，

4.安玛西亚电泳仪等。

三、 实验试剂

1. 试剂：请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品。

DNA提取试剂盒；

EcoRI酶,MseI酶，T4连接酶试剂盒；

Taq酶，dNTP, PCR reaction buffer；

AFLP 引物；

琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料；

超纯水（18.2MΩ·cm）

2．其他实验需要物品

微量移液枪（一套）及相应尺寸Tip头,PCR管,冰浴等。

四、 实验流程

1、 总DNA提取

使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA，通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说，100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。

2、 EcoR1酶消化（20ul体系/样品）

3、 Mse1酶消化（20ul体系/样品）

5、 预扩增（20ul体系/样品）

sample 4ul

Primer(Mse1/EcoR1) 1ul

AFLP Core Mix 15ul

* AFLP Core Mix 配方：

ddH2O 13.8ul

MgCl2 1.6ul

dNTPs(2.5mM) 1.6ul

Taq酶(1U/ul) 1ul

10×Buffer 2ul

预扩增程序：

6、选择性扩增（20ul体系/样品）

sample>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> >> 4ul(预扩增产物稀释20倍) Primer(Mse1-XXX/EcoR1-XXX)> >1ul>>>>

AFLP Core Mix>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> >> 15ul

选择性扩增程序：

7、产物电泳检测

上样液：Loading Buffer>>>>>>> 20ul

Size standard-600>>>>>>>>>>>>>>>>> > 0.2ul

Sample>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> >>> 3ul(稀释10倍)

四、实验结果与分析

本实验使用贝克曼库尔特（BeckmanCoulter）公司CEQ8000遗传分析系统，运用先进的荧光标记技术和毛细管电泳分离技术进行实验，扩增产物在高分辨率毛细管中电泳分离，采用激光激发荧光采集数据，灵敏度极高，电泳结果通过软件自动统计分析并转换成“0、1”矩阵，便于对结果进一步深入分析研究，整个电泳、数据采集和数据分析过程由软件来控制完成，最大程度避免了人工操作造成的误差，提高了数据的可靠性。

产物电泳数据采集在CEQ8000遗传分析系统上进行（图1），得到的数据（图2）用第三方软件再进一步统计分析。

图 2 AFLP“0、1”矩阵图

AFLP操作流程图：

>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> 图1> AFLP分子指纹图谱

附录1：常用的8对AFLP选择性扩增引物：

E-AGG:>>> 5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3

E-ACG:>>> 5-GACTGCGTACCAATTCACG-3

E-AAC:>>> 5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3

E-ACA:>>> 5-GACTGCGTACCAATTCACA-3

E-AGC:>>> 5-GACTGCGTACCAATTCAGC-3

E-ACT:>>> 5-GACTGCGTACCAATTCACT-3

E-AAG:>>> 5-GACTGCGTACCAATTCAAG-3

E-ACC:>>> 5-GACTGCGTACCAATTCACC-3

M-CAA:>> 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACAA-3

M-CAC:>> 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACAC-3

M-CAG:>> 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACAG-3

M-CTA:>> 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACTA-3

M-CAT:>> 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACAT-3

M-CTC:>> 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACTC-3

M-CTG:>> 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACTG-3

M-CTT:>> 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACTT-3

附录2：AFLP传统垂直板电泳(银染法检测)介绍：

>>> 原理与方法同前，区别：1.选择性扩增引物不带荧光标记；2.电泳方法不同，采用测序胶垂直板电泳；

3.电泳结果采用银染法，比较直观，但条带的统计与分析全人工化，工作量大，银染法灵敏度比荧光标记法要低。

示例：下图为玉米(maize)DNA的AFLP图谱。

Panel A: AFLP fingerprints of control maize DNA using EcoR1 primer E-AGG with eight Mse1 primers: M-CAA (1), M-CAC (2), M-CAG (3), M-CAT (4), M-CTA (5), M-CTC (6), M-CTG (7), and M-CTT (8). Panel B: AFLP fingerprints of control maize DNA using Mse1 primer M-CAG with eight EcoR1 primers: E-AAC (a), E-AAG (b), E-ACA (c), E-ACT (d), E-ACC (e), E-ACG (f), E-AGC (g), and E-AGG (h).

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/5myj.html