马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因cDNA克隆及其在甲醇毕赤酵母中的表达

马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因cDNA克隆及其在甲醇毕赤酵母中的表达

农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2005,13(3):282~287

··研究论文

马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基

基因(的克隆及其在毕赤酵母中的表达*

宋波涛柳俊**谢从华成善汉

(华中农业大学园艺林学学院，国家蔬菜改良中心华中分中心，园艺植物生物学教育部重点实验室，

湖北省马铃薯工程技术研究中心，武汉430070)

摘要：用RT-PCR结合RACE的方法，在腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因(温处理的马铃薯(

目标片段为体。DNA序列测定结果表明，

从低的保守位点设计1对引物，

L.)块茎cDNA中，扩增出1条约1.9kb的特异性条带，并将其克隆到pBluescriptSK域载

编码521个氨基酸。全长为1854bp，包含一个1563bp的开放阅读框架，5'端

有63bp的非翻译区，3'端包含219bp的非编码序列，3'端poly(A)尾端上游12和19bp处有加尾信号AATAAA。该基因已在GenBank注册，登记号为AY186620。将该基因PCR突变后，克隆到酵母表达载体pMET琢-B中，构成表达载体pMET琢A4，将其线性化，用电穿孔法导入

pMAD16，得到重组表达酵母，经甲醇诱导表达后，SDS-PAGE电泳显示，在诱导表

结果表明诱导表达重组酵母达重组酵母中检测到50kD左右的特异蛋白带。裂解酵母菌体提取蛋白质，进行酶活力活性测定，中AGPase活性明显上升，证明诱导表达成功。

关键词：马铃薯

克隆;酵母表达;酶活性

CloningoftheSmallSubunitcDNAofADPGlucosePyrophosphorylasefromPotatoandItsExpressioninYeast

SONGBo-Tao

(

complete

cDNAfrompotato(

L.)tuberofcloneJHstoredinlowtemperaturewasampli-conservative

LIUJun**XIECong-HuaCHENGShan-Han

fiedusingRT-PCRcombinedwithrapidamplificationofcDNAend(RACE)strategyaccordingtothefragmentof

site,whichyieldeda1.9kbspecificbandthatwasinstertedintothevectorpBluescriptSK域.ThesequenceanalysisshowedthattheclonedcDNAhadalengthof1854bp,encodingaproteinof521aminoacidsandhada65bp5'untranslatedsequenceanda219bp3'non-codingregionincludingtwoputativepolyadenylationsignalsAATAAat12and19bpupstreamofthepoly(A)(GenBankAc-cessionnumber:AY186620).TheclonewassubclonedintotheexpressionvectorpMET琢-B.Therecombinantplasmidwastrans-formedintothe

pMAD16.TheresultsofSDS-PAGEanalysisindicatedthatcloning;yeastexpression;AGPaseactivity

expressedinthereceptorand

theAGPaseactivitiesofinducedrecombinantyeastwereincreased

significantly.

马铃薯总产和栽培面积仅次于小麦、水稻和玉米的第4大粮食作物(Jackson,1999)，其块茎的贮藏物质主要是淀粉，约占块茎干物重的70%～80%。马

铃薯淀粉不仅用于医药、食品和饮料生产，还可以用

*基金项目：国家自然科学基金项目(No.30270842)、国家高技术研究与发展计划（863）项目(No.2002AA241181)和湖北省科技攻关项目(No.

2002001006)资助。

宋波涛：男，1975年生，华中农业大学园艺林学学院博士研究生。

**通讯作者。Authorforcorrespondence.E-mail:收稿日期：2004-09-20接受日期：2004-11-10

马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因cDNA克隆及其在甲醇毕赤酵母中的表达

因而淀粉合成与作造纸、包装、纺织和化工原料等，

调控是现代农业的主要研究领域之一。而腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucosepyrophosphory-lase,AGPase)是植物淀粉生物合成过程中的限速酶

1999)，催化G-1-P与ATP作用，形(Sweetlove

成ADPG和焦磷酸(G-1-P+ATP→ADPG+PPi)，ADPG则是淀粉合成的葡萄糖基供体。前人研究表明，AGPase对淀粉合成的一般控制系数在0.3～0.6(Sweetlove1999)，而且马铃薯淀粉合成的曲线与AGPase的积累曲线基本一致(Sweetlove1996)，抑制AGPase的活性将导致淀粉合成的部分

eber或全部终止(M俟ller-R1990;1992)，这些结果为调控淀粉代谢提供了依据。马铃薯AGPase

为异源四聚体，由2个小亚基和2个大亚基组成，AGPase大亚基只起调节作用，而活性则由小亚基控制(Iglesias1993;Ballicora1995)，因此，克隆马铃薯AGPase小亚基基因()，并进行体外表达，一方面有利于进一步研究淀粉积累和碳代谢机理，另一方面通过转基因，增强该基因的表达，提高AGPase的活性，对于提高马铃薯淀粉含量(干物重)、改良马铃薯品质等，具有重要的现实意义。本

并研究旨在克隆马铃薯完整的cDNA序列，

通过在真核酵母中表达，测定其酶活性，为下一步体外突变、转基因以及淀粉和糖代谢理论研究提供基础。

温度(20依1)℃条件下培养60d，以成苗并形成试管

于4℃贮藏7d进行低温块茎。将试管块茎收获后，

诱导处理，然后取2g试管块茎，用Logemann等(1987)的方法抽提总RNA。最后将RNA溶解于100滋LDEPC处理的无菌水中，电泳检测RNA的完整性，用紫外分光光度计(UV-2401PC，日本岛津)检测RNA的浓度与纯度。1.4cDNA合成、RACE扩增和全长cDNA的获得与克隆

第1链逆转录cDNA合成采用ClontechSMARTTMLibraryConstructionKit，按Tian等(2003)的方法进行。用该方法合成的单链cDNA两端分别带有不同接头:

5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3';5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGAC-3'。

依据前人报道的结果，在sAGP内部高度保守区设计了2个基因特异引物(GSP)：

GSP1:5'-CATTCGGTCTCATGAAGATT-3';GSP2:5'-AATCTTCATGAGACCGAATG-3'。5'RACE:5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3';3'RACE:5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGAC-3'。

1材料和方法

1.1植物材料、菌种与质粒

本实验用植物材料为本实验室选育的马铃薯(L.)品系JH，大肠杆菌(

)宿主菌为DH5琢，克隆载体为pBlue-scriptSK域，表达酵母为

pMAD16，表达载体为pMET琢-B。1.2酶和试剂

第一链逆转录cDNA合成使用的SMARTTMLi-braryConstructionKit购自Clontech公司DNAPolymerase、限制性内切酶、连接酶、分

子量Marker等分子生物学常规试剂购自TaKaRa生物公司，本实验所有PCR引物均由上海生工生物

其它试剂均为Sigma公司产品或国工程公司合成，

产分析纯。

1.3RNA的提取

将JH试管苗单节段接种到含8%蔗糖的MS培养基上(pH5.8)，于光照强度2500lx、光照8h/d、

均由SMARTTMLibraryConstructionKit提供。

5'RACE引物和GSP2引物用于扩增cDNA5'端，3'RACE引物和GSP1引物用于扩增cDNA3'端。最后用重叠延伸法将cDNA5'和3'端连接起来，得到全长cDNA，PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，回收目的片段，具体的PCR反应和克隆策略见Tian

单酶切克隆载体pBluescriptSK等(2003)。用

Kelow去磷酸化，回收和连接两片段并转化

抽提质粒(命名为DH5琢。而后筛选白斑摇菌，pSKA4)，经酶切鉴定后，送上海基康公司测序，其结

果用BLAST软件进行序列分析。

1.5重组表达载体pMET琢-A4的构建

根据表达载体pMET琢-B的多克隆位点重新设计带克隆酶切位点的PCR引物，以克隆pSKA4为模板扩增。5'引物为:

。

3'引物为pBluescriptSK域载体上的一个通用引物T7。PCR循环参数为：94℃3min；92℃40s，58℃40s，72℃2min，25个循环；72℃5min，4℃停止反应。

将纯化的PCR产物和表达载体pMET琢-B经和双酶切后回收，用T4DNALigase连

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农业生物技术学报2005年

转化DH5琢，接，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆。提取质粒(命名为pMET琢-A4)，经和双酶切鉴定，并根据克隆载体所提供的正向和反向测序引物，送上海基康公司测序。1.6重组质粒的转化与重组酵母的鉴定

取100滋L新鲜制备的pMAD16感受态细胞于

线性化后的质1.5mL离心管中，加入3滋g经粒DNA，冰上孵育2min。将细胞与DNA混合物转

入0.2cm的电极转化杯中，1800V电击后(Elec-tropotor2510，Eppendorf)，立即加入1mLYPAD1%酵母粉，20%蛋白胨，20%葡萄糖0.01%腺嘌呤，1.5%琼脂粉,并转入1.5mL的离心管中，30℃静置培养1h，然后离心收集悬浮细胞铺2个MD(1.34%YNB,4伊105%D-生物素,1.23%葡萄糖,1.5%琼脂

直到长出白色菌落。粉)选择性板，30℃孵育3~4d，

1.7诱导表达

挑取单个菌落，用10mLBMDY(1％酵母浸出膏，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，0.34％YNB，4伊10-5％D-生物素，2％葡萄糖)培养16~24h(30℃，300r/min)，直到值达2~10。取1mL培养物离心，收集细胞作为未诱导对照。收集剩余细胞并用10mLBMMY(用0.5％的甲醇代替BMDY中的葡萄糖)重悬细胞，30℃，300r/min，诱

每隔24h取1mL，导基因表达，再补充1mL5％甲

醇继续培养3~5d。

将取出的1mL培养物1500离心3min，细胞沉淀加100滋L酵母裂解液PBS和等体积的酸化玻璃珠，剧烈涡旋震荡1min，置冰上1min，重复5次，13000r/min离心1min，取上清液，加入等体积

煮沸3min，的2伊上样缓冲液，取20滋L用10％的

聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳分析。1.8诱导重组酵母中AGPase活性测定

AGPase活性测定参考Kim等(2000)介绍的方法加修改。将诱导72h的酵母菌液通过超滤收集，取0.5g样品于1mLAGPase抽提缓冲液中匀浆破碎后离心，取上清液用于酶活性检测。将50滋L上清液加入600滋L反应缓冲体系中，水浴反应20

取500滋L上清液，加入15min，煮沸1min后离心，

滋L10mmol/LNADP，于340nm测定吸光值。再加入1U葡萄糖磷酸变位酶(PGM)和1U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)测定吸光值。每个样品重复3次，并用SAS进行统计分析。样品酶活性计算公式为24伊伊10-3伊单位为nmol/min/g(式中24为实际样品体积与所取样品体积的换算倍数，

6.22伊10-3为吸光系数换算值为反应时间内吸光值的变为样品质量为反应时间min)。

2结果

2.15'RACE、3'RACE及重叠延伸PCR

根据设计引物计算，5'RACE扩增产物约为800bp，3'RACE产物约为1100bp。5'RACE和3'RACE完毕以后，分别取10滋L扩增产物在琼脂糖胶上电泳检测，电泳结果显示，5'RACE产物约为800bp(图1，泳道2)，3'RACE产物约为1100bp(图1，泳道1)。重叠延伸PCR扩增产物长度在1900bp左右

cDNA全长。(图2，泳道2)，扩增产物包含了

图1.5'RACE和3'RACE的PCR结果Fig.1.PCRresultsof5'RACEand3'RACE

1,3'RACE产物;2,5'RACE产物;3,DNA分子量标准。1,3'RACEprouct;2,5'RACEproduct;3,DL2000marker.

图2.重叠延伸扩增全长cDNA结果Fig.2.Splicingoverlapextensionamplification

offull-lengthcDNA

1，DNA分子量标准；2，重叠延伸产物。1,DL2000marker;2,overlapextensionPCRproduct.

测序和序列分析2.2扩增产物的克隆、

将重叠延伸PCR扩增产物直接连接到pBlue-对编号为scriptSK域上，转化DH5琢，筛选阳性克隆，

马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因cDNA克隆及其在甲醇毕赤酵母中的表达

pSKA4的克隆进行酶切分析，结果显示有一条1.9kb的目标带(图3，泳道2)。测序表明，除去两端接头引物序列，马铃薯cDNA全长为1854bp，包含一个1563bp的开放阅读框架，编码521个氨基酸，5'端有63bp的非翻译区，3'端包含219bp的非编码序列，3'端poly(A)尾端上游12和19bp处有加尾信号AATAAA。该基因已在GenBank注册，登录号为AY186620。

图3.pSKA4+

玉

功构建到表达载体上。

酶切结果玉+

玉+

1,姿-

Fig.3.DigestfragmentbypSKA4

1，DNA分子量标准；2.酶切产物。1,姿-2,

玉+

图4.pMET琢-A4双酶切结果

Fig.4.DigestfragmentbypMET琢-A4

Ⅰdigestmarker;2and3,

+1,DNA分子量标准；2、3，pMET琢-A4双酶切产物。

Ⅰdigestmarker;digestfragment.

+digestfragment.

GenBankBlast(nr)和Blast(x)检索结果表明，克

隆到的马铃薯cDNA具有AGPase的所有活性位点和保守位点。该基因cDNA与已报道的马铃薯cDNA(GenBankAccessionNo.X61186)在DNA序列上有16个碱基差异，同源性为99%(1550/1566)，相应的氨基酸在41(T/A)、65(S/P)66(L/M)、171(L/F)、296(L/F)、297(V/I)、483(E/K)位上不同，同源性为99%(514/521)；与马铃薯另一个

cDNA(GenBankAccessionNo.X55155)核苷酸同源性为98%(1495/1519)，与其氨基酸序列同源性为99%(437/442)；与番茄(

(Mill))(GenBankAccessionNo.

L41126)的核苷酸和氨基酸的同源性分别为96%(1690/1764)和96%(507/521)；与甘薯(

(GenBankAccessionNo.Z79636)相应序列的同源性分别为86%(1159/1337)和91%(478/521)。

2.3重组表达载体的构建结果

用所设计的突变引物和载体另一端的通用引物T7PCR扩增，将纯化的PCR产物和表达载体pMET琢-B经和玉双酶切后回收，用T4

转化DH5琢，DNA连接酶连接，在含氨苄青霉素的

LB平板上筛选阳性克隆，命名为pMET琢-A4。提取

和质粒，重组表达载体pMET琢-A4，经

双酶切后，得到1.8kb左右的目标片段(图4)。用载

结果表明体两端的测序引物测序，基因已成

2.4sAGP在毕赤酵母pMAD16中的表达

收集菌体，经玻璃珠破碎法破碎后进行SDS-PAGE电泳,结果显示，1、2和3号经甲醇诱导

分子量约为50的重组酵母有明显的目的蛋白表达，

kD(图5，泳道1~3)，而未诱导的重组酵母(图5，泳道4)和甲醇诱导的转入空载体pMET琢-B重组酵母(图5，泳道5)均无目的蛋白表达。

图5.重组酵母细胞裂解液SDS-PAGEFig.5.SDS-PAGEofrecombinantyeastlysate

1~3，诱导表达重组酵母；4，未诱导表达重组酵母；5，诱导表达空载

体重组酵母；6，蛋白质分子量标准。

1~3,inducedhomologicalrecombinant;4,uninducdhomologicalrecombinant;5,inducedpMET琢-Brecombinant;6,proteinmarker.

2.5AGPase活性测定

用宿主酵母和重组空载体pMET琢-B的重组酵母抽提液作阴性对照，分别测定未诱导和诱导72h的酵母

抽

提

液的AGPase活性，结果表明(图6)，诱

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农业生物技术学报2005年

导72h的重组酵母中AGPase活性均明显高于诱导宿主酵母、转入空载体pMET琢-B重组酵母和未诱导的重组酵母(琢=0.05)，诱导后重组酵母酶活性均比阴性对照高23%以上，而且诱导后的重组酵母比诱导前分别高27%、30%和23%。

图6.酶活性测定结果

Fig.6.TestingresultsoftheAGPaseactivity

1，宿主酵母；2，空载体重组酵母；3~5，重组酵母。1,hostyeast;2,pMET琢-Brecombinantyeast;3~5,homologicalrecombinantyeast.

3讨论

本研究从淀粉含量较高和抗低温糖化能力较强

2004)中克隆了全长的的材料JH(Cheng

cDNA，该基因具有AGPase的两个活性结构域IKRAIIDKNAR(467~477)和SGIVTVIKDALIPSGI(503~519)(Press,1996)。将该基因的酵母表达载体，通过同源重组基因整合到酵母染色体上，实现了该基因的真核体外表达，结果表明，诱导表达重组酵母中AGPase活性均比对照提高25%以上，这说明克隆的基因具有AGPase功能。马铃薯基因作为AGPase的活性亚基，直接控制着AGPase的活性。因此推测，增强的表达将有利于提高AGPase的活性，提高淀粉合成前体ADP-glucose的含量，促进葡萄糖向淀粉方向的转化，从而提高淀粉含量，降低还原糖含量，达到改良加工品质的目的。

AGPase是淀粉代谢的关键酶，普遍存在于高等植物中，到现在为止已从马铃薯中克隆了不同的

基因，但不同的马铃薯基因型其抗低温糖化的能力有所差异，可能是调节淀粉代谢的酶的活力在低温条件下出现差异所致。本研究克隆的sAGP

与GenBank基因来自于抗低温糖化的马铃薯品系，

中的CAA43489(X61186的蛋白质序列)比较有7个

位点不一样，与A55317相比除了以上7个位点不同外，还有43(T/A)和520(I/V)位点不一样。从位置上看，出现差异的主要集中在氨基酸序列的N端如41、49、65和66位点，而且成对出现如65~66、

多数为非极性296~297位点；从氨基酸的极性上看，

氨基酸间的变换如49、66、171、296、297和520位点，但在2个活性结构域(467~477位点，503~519位点)的中间483位点却出现了一个带正电可形成二硫键的Lys变成了带负电的Glu；而且从氨基酸的组成上看，在66位点的Met、171位点的Phe和296位点的Phe均变成了同一个氨基酸(Leu)；这些变化是否对AGPase的结构和活性产生影响，以及该基因与其它同类基因功能上是否存在的差异还有待于进一步研究。

Salamone等(2002)和Kavakli等(2001)的研究均表明AGPase的小亚基基因上还存在多个结合激活因子三磷酸甘油酸的激活位点和结合抑制因子无机磷酸的抑制位点。而且Leung等(1986)和Stark等(1992)研究也表明，将大肠杆菌的AGPase基因的抑制位点突变，获得突变基因转化马铃薯后使块茎的淀粉含量提高。本研究在进行所克隆的

基因功能论证的同时，也正利用酵母表达系统将目标基因体外突变，增强或增加目标基因中的激活位点，去除抑制位点，以进一步提高基因的表达活性，研究结果将另文发表。

与原核表达相比酵母表达系统具有以下几个可

能完利用的优点：①酵母表达系统为真核表达系统，

成目标蛋白的部分加工，如糖基化等，使得表达的目标蛋白和原始蛋白更加接近，有利于酶活性测定等实验；②酵母中的一些分泌信号和先导序列将目标蛋白分泌到培养液中，更利于目标蛋白的收集和纯化；③酵母表达系统利用甲醇氧化酶基因的强启动

具有高效和子，将目标基因整合到酵母的染色体上，高稳定性的特点。因此选择该系统更加有利于目标

增蛋白的定点改造，如去除目标基因中的抑制位点、

加激活位点等后续实验。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/5i61.html