基因和蛋白不一致的分析
更新时间:2024-05-16 03:28:02 阅读量: 综合文库 文档下载
这是我最近实验遇到的问题,拿出来请教一下各位
我的目的基因经real-time pcr 验证,在病灶区和非病灶区中,20多对样本,两两对照,最低的表达差异也要高出10倍。
但是我用western和组化研究蛋白时,发现表达几乎无差异。我在考虑可能是什么可能使得目的基因在mrna水平上变化如此之大(我认为这变化应该和我研究的疾病有关,可能是疾病的因,也可能是果,不然不会在疾病中表达差异这么明显这么一致,不知各位同意否),以便设计我下面的实验。 我想出来的可能性:
1、可能我的目的基因位于基因组拷贝数变化的一个区域内,可能是它相邻的基因在疾病中发挥了作用,但是我用real-time做过它相邻的基因,没有变化,因此我基本否认了这个猜测。
2、也可能是另一种蛋白高表达引起了这个疾病,而这个蛋白可能同时又调控我研究的目的基因的表达,不知这样的猜测应该如何设计实验进行验证比较好?
因为才疏学浅,只想到了这两种可能性,因为请问还有没有其他的可能性呢?望版上各位不吝赐教。
首先建议验证qPCR assay的重复性和可靠性。
2. 有无在mRNA水平由于alternative splicing而引起的两者水平不一致?
关于这个问题,要分开两步来分析。
第一,在mRNA水平,你用不同的样本、多次qPCR均有10倍以上的差异,相信你的结果是非常肯定的,这一结果不用怀疑;
第二,在蛋白质检测水平,你用免疫组化与western blot均证实该抗体的信号没有明显差异,个人觉得这个结果也应该比较肯定的;
但是,两者的不一致导致你的怀疑,难以解释。从mRNA到蛋白一般来说很少出现这样的差异,至于alternative splicing的可能,你可以认真检索一下该基因是否存在splicing而产生的多个transcriptor,而你的引物又刚好引起了这种差异。因为现在的引物设计软件是比较严谨的,这种原因可以分析出来。由于这个基因不是新的,所以很多信息都可以查到,这个问题很容易解决。
到于蛋白质的检测要受到抗体特异性的限制,你所使用的抗体是否是国际公认的大公司所生产的,有没有其它文章已经使用过并且证明特异性很好;能否找一个该基因明显变化的细胞模型,然后用qPCR与western检验一下该基因的变化。
还有一种非常低级、概率非常低的可能,就是你所买的抗体根本就不是你所
需要的抗体,而是其它没有变化的蛋白的抗体,甚至是actin这类的内参,所以上面提到的用细胞模型来验证抗体的特异性也是一个原因。
根据你的描述,我觉得基因表达和蛋白表达的结果都没有问题。因为对于基因水平,多次重复后,两者都相差10倍以上,而蛋白水平你又是通过WB(定量)和IHC(半定量)2种不同的检测方法后得到的一致的结果,因此毋庸怀疑。当然,如果你还在怀疑蛋白水平的话,建议你可以再试试采用放射免疫分析法或者elisa方法对蛋白水平进行定量分析,如果结果还是没有改变的话,那就完全证明蛋白的确没有变化。
我们都希望实验出现阳性的结果,这样在写文章的时候就可以大写特写,否则,就无话可说,甚至认为这实验白做了,更有甚者,出现捏造或者篡改实验数据,人为地把实验结果改为阳性。其实,这种做法后果很严重,应该杜绝。
首先,我有几个问题想自问一下:
1、为什么一定要基因表达和蛋白表达都要有差异呢?
2、为什么不可以基因表达有差异,而蛋白表达无差异呢? 3、为什么不可以基因表达无差异,而蛋白表达有差异呢? 4、为什么不可以基因表达和蛋白表达都无差异呢? 带着这几个问题,我个人觉得:
1、如果基因表达和蛋白表达都没有差异,可能说明在这种实验处理条件下,这个基因在转录水平和翻译水平上都不存在调节。还有另外一种情况是,可能和你处理的时间、剂量/程度以及采样的时间段有关。如果是后几种可能的话,那么你就要分别检测在不同处理时间、不同的剂量/程度及不同的采样时间段,来检测你样品中基因和蛋白的表达水平,最后才能定论了。 2、如果基因表达和蛋白表达都有差异,很简单,这种结果是我们预期想要的,此时就可大写特写该基因的生理功能和调节作用了。 3、如果基因表达无差异,而蛋白表达有差异。乍一看,有点矛盾,其实不然,对于这样的结果,我们可以解释为,在这种实验处理条件下,这个基因在翻译水平上存在调节,并且这个蛋白对这种病理性症状可能具有一定的调节功能,因为该基因蛋白表达有差异嘛。
4、如果基因表达有差异,而蛋白表达无差异。对于这一结果,也就是楼主所反映的实验现象,乍一看,有点矛盾,而且也不好解释。仔细一想,其实不然,对于这样的结果,我们首先可以初步判断,在这种实验处理条件下,这个基因在转录水平存在调节,但是在翻译水平上不存在调节。为什么会只在转录水平存在调节呢?对于这个问题的解答,实际上就是回答在这种实验处
理条件下,这个基因的转录调控了,也就是寻找这个基因的上游,存在哪些基因或者转录因子,参与了这个基因转录活性的调节。这个问题的解决有点难哦~,涉及到分子生物学的很多知识。
1、如果这个基因比较经典,序列已经有了,并且已经大概知道了受哪些基因的调控,那么可以先将这个基因的调控区序列从基因银行里调出来,然后进行序列比对,找到这个基因的整个调控区有哪些关键基因的结合位点。 2、找到结合位点后,然后要对这个基因进行克隆,将一些重要的结合位点截去,或者用错乱序列取代(即突变),然后进行质粒构建,重组,并将之连接到带有荧光报告基因的载体上。
3、接下来进行细胞转染,并检测报告基因荧光素酶的活性,根据荧光素酶活性水平的差异,确定上游的哪些关键基因参与了在你的实验条件下,目的基因转录活性的调控。
4、根据上述结果,你可以进一步采用敲除关键基因或者目的基因的手段,或者采用转基因动物,在体上进一步研究这些关键的调节基因或目的基因的生物学功能,如果实验结果是你想要得到的话,那么一切就OK了。
当然,这些证明实验有点难度,但是,只要能够做出来,应该是一篇很好的文章了,可以说,投5以上的杂志应该问题很小了。
我觉得会不会还有以下的可能性:
1、该蛋白质mRNA升高以后蛋白质也确实表达上调了,但是该蛋白的定位却有了变化,分泌出细胞了?
2、虽然mRNA升高了(这说明转录步骤是上调的),但是另外还有控制该基因翻译的负调控因素被激活,这是很正常的,蛋白质的表达本身就是多步骤调控的结果,而且功能越重要的蛋白质其调控也就越复杂
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