western 配方和操作步骤

Western blotting试剂的配制

① 100mMPMSF：0.0174gPMSF 溶于1mL异丙醇中，-20°C保存。注：PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸和、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。PMSF在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加入裂解缓冲液中。

② 1.5M Tris-base PH8.8：36.33gTris-base 溶于60mL双蒸水中，调PH为8.8，再加入双蒸水定容至200mL。1.0M Tris-base PH6.8：24.22gTris-base 溶于60mL双蒸水中，调PH为6.8，再加入双蒸水定容至200mL。

③ 10%SDS：SDS 10g溶于60mL双蒸水中，68°C助溶，由于SDS溶解时会产生很多泡沫，定容时应先定容至95mL，等泡沫散去，再加入双蒸水定容至100mL。

④ 30?ry/bis：29g丙烯酰胺，1g甲叉丙烯酰胺，双蒸水60mL，37°C助溶，然后定容至100mL，-4°C保存。注：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺时应戴手套和口罩，配制该溶液时应在通风橱中进行，操作过程中应穿好实验服，注意防护。

⑤ 5×SDS凝胶上样缓冲液：1.25mL1MTris-base PH6.8，2.5mL丙三醇，0.5g SDS，0.025g溴酚蓝，用双蒸水定容至5mL，1mL分装后，于室温保存，使用前每mL中加入50μLβ-巯基乙醇，加入β-巯基乙醇的上样缓冲液可在室温中保存一个月，使用时稀释为1×工作液。

⑥ TBST缓冲液：2.42gTris-base，8.8gNacl，500μLTween-20，用双蒸水定容至1000mL，调PH为7.4。

⑦ 10%APS：0.1gAPS溶于1mL双蒸水中，4°C保存一星期有效，最好现配现用。

⑧ 10%浓缩胶（7.5mL/块胶）：3mL双蒸水，1.875mL 1.5MTris-base PH8.8，75μL10%SDS，2.475mL30?ry/bis（毒），75μL10%APS，3μLTEMED（毒）,依次加入上述试剂后充分混匀。5%浓缩胶（5mL/块胶）：2mL双蒸水，0.5mL 1.0MTris-base PH6.8，40μL10%SDS，0.5mL30?ry/bis（毒），30μL10%APS，4μLTEMED（毒）依次加入上述试剂后充分混匀，现配现用，为有毒试剂注意防护。

⑨ 电泳缓冲液：1.515gTris-base，9.4g甘氨酸，0.5gSDS，用双蒸水定容至500mL，由于SDS溶解过程中会产生泡沫，因此定容之后再加，现配现用。转移缓冲液：3.03gTris-base，14.4g甘氨酸，200mL甲醇，0.3gSDS，制胶完成后配制，用双蒸水定容至800mL，然后放入4°C冰箱预冷，使用时再加入200mL甲醇。

⑩ 5%牛奶封闭液：1.5g伊利脱脂奶粉，30mLTBST，现配现用。 Western blot操作过程

① 制胶：将制胶板固定好，按上述方法配好分离胶，充分混匀后倒入制胶板中，确保胶不漏，然后用双蒸水封闭，室温静置30min，凝固后倒出双蒸水，用滤纸吸干，配置好浓缩胶，倒入制胶板中，然后插入梳子，室温静置30min。

② 电泳：组装好电泳仪，红对红黑对黑，从密封的中间区域倒入电泳缓冲液，至漫过下方的金属丝，然后拔出梳子，加入蛋白样品及蛋白Maker。插上电源，浓缩胶区域电压设为80V（约20min），分离胶区域电压设为120V（约100min）。

③ 转膜：将预冷后的转膜缓冲液中加入200mL甲醇混匀后倒置在托盘中，裁剪4张稍微小于转膜海绵的滤纸，于转膜液中浸泡15min，同时取出胶，切割目的胶片段，置于转膜液中，裁剪与之大小相同的PVDF膜于无水甲醇浸泡几秒。将转膜夹板置于托盘中，白色板在下，依次放置：白色夹板-海绵-4层滤纸-PVDF膜-胶-4层滤纸-海绵-黑色夹板。将夹板固定好后放入转膜槽中黑对黑白对红，接通电源，250mA恒流转膜2h。注：转膜过程在冰里操作。

④ 封闭：将PVDF膜取出，在Maker端剪个小角，与胶接触面标记为上，然后置于20mL 5%牛奶封闭液中，室温振荡摇匀1h。

⑤ 一抗孵育：按1:1000比例配制一抗，4°C振荡摇匀过夜。 ⑥ 洗膜：TBST洗膜三遍，每遍5min。

⑦ 二抗孵育：按1:3000比例配制二抗，室温振荡摇匀1h。 ⑧ 洗膜：TBST洗膜三遍，每遍5min。

⑨ ECL显色：取A液与B液各200μL即为ECL显色液（400μL），混匀备用。然后在显影仪中显影，最后用Image J软件分析。

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