动物细胞工程课堂笔记

动物细胞工程课堂笔记

动物细胞工程常用的技术

? 动物细胞培养：是其他动物细胞工程技术的基础。 ? 动物细胞融合 ? 动物细胞核移植

? 生产单克隆抗体等

? 一.动物细胞培养

(一)概念

（二）、原理：

? 如何进行细胞培养?

（三）相关概念

1.细胞贴壁：培养贴附性细胞时,细胞要能贴附于底物上才能生长繁殖.

2.细胞接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。

3.原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。一般培养的第1代细胞与传10代以内

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的细胞称为原代细胞培养。

4.传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。

5.细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。 6.细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。

7.细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。 思考题：

1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？

2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？

3、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？

4、细胞膜的主要成份是什么？

5、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？

6、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？

7、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？

（四）、动物细胞培养的条件 1、无菌、无毒的环境

添加一定量的抗生素，定期更换培养液 2、营养

添加：糖（葡萄糖）、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、动物血清等。 3、温度和PH

培养室中控制,使之达到 36.5 ± 0.5℃, 7.2~7.4 4、气体环境：

培养箱中提供O2和CO2（95%空气和5% CO2 ） （五）、动物细胞培养技术的应用

（1） 培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植 （2） 基因工程的受体细胞

（3）细胞的生理、药理、病理研究

植物组织培养和动物细胞培养的比较：见三维设计

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P44旁栏

1.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？

用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.2～8.4。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适宜用于细胞培养时的消化。 胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？

提示：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。 二、动物细胞核移植 （一）概念：

克隆动物：用核移植的方法得到的动物。 （二）、分类：

胚胎细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易 体细胞核移植：细胞分化程度高，恢复全能性困难 克隆动物:用核移植方法得到的动物.

克隆（clone）是指通过无性生殖而产生的遗传上均一的生物群，即具有完全相同的遗传组成的一群细胞或者生物的个体。克隆在希腊语中是“小树枝叶”的意思，用以指无性增殖物。 (三)、体细胞核移植的过程： 思考：

1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？

2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？

过程：

P49讨论：

1. 在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？

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2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？

答：培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞 遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细 胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。

3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？

绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。 （四）、体细胞核移植技术的应用前景 1、 2、 3、 4、 （五）、体细胞核移植技术存在的问题

思考与探究

1.幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？

答：细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。

2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？

动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。 3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为 30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般 为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4 t。

（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。

可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良

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进程。

该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。

（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？

从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内

4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。 研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。

应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。 知识拓展：

1.动物细胞培养技术是如何发展起来的？

1907年，哈里森（Harrison）在无菌条件下用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。之后，又有人将悬滴培养法改良为双盖片培养，提高了传代效率并减少了污染。1923年，卡雷尔（Carrel）设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。 1951年， 厄尔 （Earle） 发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。1951年，波米拉（Pomerat）设计了灌流小室，使细胞生活在不断更新的培养液中，便于作显微摄影和细胞代谢的研究。1957年，格拉夫（Graff）用灌流技术进一步提高了细胞悬浮培养的效率。1957年，杜尔贝科（Dulbecco）等人采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了单层细胞培养。单层培养法的出现，对组织培养的发展起了很大的推动作用。此后单层培养成为组织培养普遍应用的技术。20世纪60年代后，动物细胞大规模培养技术开始起步，并逐步发展。20世纪80年代后，随着基因工程和其他细胞工程技术的发展，细胞培养技术已成为转基因技术、生物制药及其他许多技术的基础，在现代生物技术中发挥着重要的作用。

2.为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？用酶消化的是什么物质？ 细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培养。

分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。

用酶消化的是细胞间基质，细胞间基质主要成分有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。用蛋白酶可使其消化，从而使细胞相互分离。

3.体细胞核移植技术为什么要选择MⅡ期的卵母细胞做受体细胞？

细胞核移植技术中能用作受体细胞的通常有MⅡ期卵母细胞和受精卵（合子）。早期核移植技术中常用受精卵，后来基本上用MⅡ期卵母细胞取代了受精卵，主要因为两者的细胞质环境不

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同。有人认为重组需要的因子存在于MⅡ期卵母细胞的胞质中，而在原核形成时这些因子已被降解或用光，因此，原核扩张后受精卵去核可引起胞质中重组因子缺乏。成熟促进因子（MPF）是卵母细胞细胞质中重要的胞质影响因子，MPF的活性在卵母细胞减数分裂的MI期和MⅡ期达到最高，受精或激活后，MPF迅速灭活，因此，MⅡ期卵母细胞中MPF活性高，而受精卵中MPF活性低。MPF水平的高低可影响供体核染色质的状态和复制。MⅡ期卵母细胞细胞核、细胞质已成熟，而MI卵母细胞细胞核、细胞质尚未成熟，其细胞质不能支持胚胎的全程发育，因此，尽管MI期卵母细胞MPF活性也高，但不能用作受体卵母细胞。

也有人认为用去核合子做受体时，可能由于合子去核时一些早期发育必需的因子随原核的去除而被去掉了，而使去核受精卵缺乏发育能力。因此，目前广泛采用MⅡ期卵母细胞做受体。 三、动物细胞融合

(一)动物细胞融合的概念

杂交细胞:

（二）动物细胞融合的过程

原理： ， 与植物原生质体融合原理相同。 诱导的手段：

融合后细胞的类型？

诱导细胞融合的病毒必须灭活。 为什么灭活的病毒能作诱导剂？

因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 不灭活的病毒能作为诱导剂吗？

不能，因为不灭活的病毒会感染细胞。 比较动、植物细胞杂交技术 比较项目 细胞融合的原理 细胞融合的方法 诱导手段 用途 植物体细胞细胞膜的流动性 杂交 动物细胞融细胞膜的流动性 合 纤维素酶、果胶酶去离心、电刺激、振克服远源杂交不除细胞壁后诱导原生动、聚乙二醇 亲和的障碍，获得质体融合 杂种植株 用胰蛋白酶使细胞分除应用植物细胞杂获得杂种细胞、制散后诱导细胞融合 交手段外，还有灭备单克隆抗体 活病毒 (三)动物细胞融合的应用

1.突破有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能。

鼠—鸡、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—鸡、人—蛙、酵母菌—鸡 、人—胡萝卜等 2.成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。 3.为制造单克隆抗体开辟了新途径。 二、单克隆抗体 什么是抗体？

抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋

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白。浆细胞产生抗体。 单克隆抗体

由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。 特点：特异性强、灵敏度高 如何大量生产单克隆抗体？

? 利用淋巴细胞产生抗体的功能 ? 利用肿瘤细胞无限增殖的特性

? 利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞 ? 利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞 1、本过程利用了哪些原理？

免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理 2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？

这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体 单克隆抗体的应用

与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高。 应用主要有： 1、临床诊断

2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤 练习

1.动物细胞工程技术的基础是：（ ）

A．动物细胞融合 B．胚胎移植 C．动物细胞培养 D．核移植 ２．在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（ ） A．结果是相同的 B．杂种细胞的形成过程基本相同 C．操作过程中酶的作用相同 D．诱导融合的手段相同 ３. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞

诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是 ①淋巴细胞 ②小鼠骨髓瘤细胞 ③B淋巴细胞自身融合细胞 ④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 ⑤杂交瘤细胞

A． ②④ B．①③⑤ C． ①②③④ D．②③ 4.以下不能说明细胞全能性的 实验是 A.胡萝卜韧皮部细胞培育出植株 B.紫色糯性王米种子培育出植株

C.转入抗虫基因的棉花细胞培育出植株 D.番茄与马铃薯体细胞杂交后培育出植株 5.下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是

A．培养中的人效应T细胞能产生单克隆抗体 B．培养中的人B细胞能够无限地增殖 C．人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株

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D．用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞

6.右图是某种淋巴细胞，膜外颗粒状物质为抗体。据图回 答： （1）这是 细胞，它是由 分化而来。

（2）抗体从开始合成到分泌出细胞，经过的细胞结构顺序是（填标号） 。抗体的分泌说明细胞的各种生物膜在结构上具有 。并以［ ］ 的形式转变。（3）在分泌抗体时要消耗由［ ］ 提供的能量。 （4）抗体的化学本质是 ，它能与 发生特异性结合，发挥免疫效应。该过程属于 免疫的 阶段。

（5）若该抗体是单克隆抗体，则该细胞名称为 。在制备单克隆抗体的过程中，应用的动物细胞工程的技术手段是 。

7.(1)若A细胞是小鼠骨髓瘤细胞，则B细胞是取自小鼠体内的 细胞，从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射_____________类物质。 （2）d过程是一个_____________过程，该过程的进行常用____________或___________的诱导。 (3)假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成 种类型的C细胞，因此需用__________培养基筛选出D细胞用于培养，D细胞的名称是 ，其特点是_________________________________________。 (4)在培养时通过________分裂方式大量繁殖。D细胞体外培养需要注意的条件是（要求答5项）__________________________________。

（5）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，其特点是_________________。 8、（1）单克隆抗体是指 。（2）制备单克隆抗体的步骤：

①将__________注入小鼠体内，从小鼠脾脏中获得淋巴细胞，其中至少1个淋巴细胞带有抗该抗原的抗体。②将步骤①获得的B淋巴细胞与步骤②培养的骨髓瘤细胞在_________________的诱导下融合。③将诱导后产生的多种细胞，放在_______培养基的多孔培养板上培养，筛选。④这样获得的杂交瘤细胞既具有B淋巴细胞_____________的能力，又具有________________的本领。⑤检测和分离带有抗X抗体的阳性细胞，培养板中每孔放一个细胞进行培养。⑥将阳性细胞进行增殖，从而制备出大量抗该抗原的单克隆抗体。 （3）大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：

①体外培养法，可获得10μg/mL的抗体；②动物体内诱生法可获得5~20mg/mL的抗体。你

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选择的方法及原因是 。

（4）用本法制备出的单克隆抗体仍具有局限性，因为它是用小鼠的_______细胞制备的，其化学本质是___________，应用于人体，会作为 产生 ，解决这个问题的方法是_____________________________。

（1）效应B；B细胞或记忆性B细胞

（2）④→⑤→③→①；一定的连续性；②具膜小泡 （3）⑥线粒体

（4）球蛋白；相应的抗原；体液；效应 （5）杂交瘤细胞；动物细胞融合、动物细胞培养

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/5dcr.html