组织切片操作流程

切片法主要步骤 1、取材与固

（1）取材：从动物体取下所需的器官材料。取材的动物要健康，材料愈新鲜愈好，应在致死后立即取材，防止组织细胞自溶变性；取材的器械要锋利；所取材料力求小而薄（以不超过0.5cm为宜），不能挤压和损伤。

（2）固定：将所取的材料立即投入固定液中，目的是使组织蛋白迅速凝固，使细胞内的结构和成分不再发生变化，保持组织细胞与活体相似的形态结构，固定后的组织块变硬，便于进一步处理。常用的固定剂有甲醛、乙醇、苦味酸或混合固定液。实验室常用Bouin固定液，固定时间为12～24小时，其固定的组织块不需进行水洗，可直接进行脱水。 2、脱水与透明

（1）脱水：固定后的组织块内含有的大量水分要彻底脱去，以便石蜡的浸入。常用的脱水剂为乙醇，脱水过程必须循序渐进，从低浓度开始，逐步升高，使组织块中的水分逐渐被乙醇所取代。具体操作为：Bouin固定液固定的组织块可直接进入70％的乙醇进行脱水，时间12小时左右。（若材料暂不制片，可保存于70％乙醇中。）然后将组织块依次移入85％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各8-12小时，→95％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各2小时，→100％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各1小时。因无水乙醇对组织有脆化作用，故在无水乙醇中时间不能超过2小时。

（2）透明：由于乙醇与石蜡不能相溶，故浸蜡前要对脱水后的组织块进行透明。常用透明剂有二甲苯、氯仿、苯、香柏油或冬青油等，透明剂能同与乙醇和石蜡相溶，并能增强组织块的折光系数，故透明后的组织块呈半透明状。使用二甲苯作透明剂的透明过程为：将脱水后的组织块放入无水乙醇与二甲苯混合液（1:1）中30分钟，再移入二甲苯中15-20分钟。 3、浸蜡与包埋

（1）浸蜡：将透明后的组织块置于刚过熔点的熔化石蜡中浸渍，使石蜡逐渐渗入并完全置换出透明剂。过程为：先将透明的组织块移入二甲苯与石蜡混合液（1:1）中，在60℃温箱中放置30分钟，再移入熔化的石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）中，在温箱中每级各1小时。

（2）包埋：将浸蜡后的组织块置于盛有熔化石蜡的模具中，并使之凝固成蜡块。 4、切片与贴片

（1）切片：将修整后的蜡块夹在切片机的固定器内，使蜡块的被切面与刀口平行，刀和蜡块成一斜角，以右手摇动摇柄进行切片，切片厚度以5～8um为宜，连续操作可形成蜡带，此时左手持毛笔轻轻取下蜡带，放于盒中。

（2）展片：将切下的蜡片放于温水（约40℃）的表面，使皱褶自然舒展开来。

（3）贴片：借助分离针或镊子，将蜡片贴在洁净载玻片上。贴片后，将切片置于切片架上自然干燥或放入温箱（40℃左右）中烘干。

5、染色与封固

（1）染色：染色后可增加细胞和组织中各结构间色彩的对比以便于观察。切片的染色方法很多，常用的是苏木精（hematoxylin）·伊红(eosin)染色，简称HE染色。染色的具体步骤如下： ①脱蜡：将切片放入二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）中，各置5～10分钟，溶去切片上的石蜡。

②将脱蜡的切片经各级浓度乙醇（由高到低）下行至水：将从二甲苯（Ⅱ）中取出的切片依次经过：二甲苯与无水乙醇混合液（1:1）→无水乙醇（Ⅰ）→无水乙醇（Ⅱ）→95%乙醇→85％乙醇→70％乙醇各3～5分钟，最后在蒸馏水中浸5分钟，即可进行染色。

③切片由蒸馏水中转入苏木精染液染色5～10分钟，使细胞内的嗜碱性物质着色。 ④用自来水洗去切片上残余的染液。 ⑤0.5～1％盐酸溶液分色数十秒钟。 ⑥放入自来水中15～20分钟、蓝化。 ⑦置入70％、85％乙醇中各3～5分钟。

⑧置入伊红染液中染色1～2分钟，使细胞中嗜酸性 物质着色。

⑨依次进入95％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）→100％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ），各5分钟，以除去切片上水份。 ⑩透明：切片入无水乙醇与二甲苯混合液（1:1）→二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）（Ⅲ），各5分钟。

zzz 常用固定液和染液的配制

Bouin固定液的配制 饱和苦味酸溶液 75份 甲醛 25份 冰醋酸 5份

由于Bouin固定液的各种成分一旦混合，若不立即 使用将会失效，故Bouin固定液只能现配现用。

苏木精染液的配制

（1）Harris苏木精染液

甲液： 苏木素 0.5g 95％乙醇 5.0ml 乙液： 硫酸铝钾（钾明矾） 10g 蒸馏水 100ml 氧化汞 0.25g 冰醋酸 几滴

先将甲液用玻棒搅拌使苏木精溶解，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水中，并加热使之溶解，去火；迅速加入甲液，煮沸后，再去火；立即加入氧化汞后再煮沸；将此液迅速冷却后用滤纸过滤，加入几滴冰醋酸即可。此液可保存数月。

苏木精染液的配制

Hansen苏木精染液

甲液： 苏木素 1g 95％乙醇 10ml 乙液： 硫酸铝钾（钾明矾） 20g 蒸馏水 200ml 丙液： 过锰酸钾 1g 蒸馏水 16ml

将三液分别溶化，然后将甲液注入乙液，再加入丙液3ml，时时搅拌，加温至煮沸0.5～1分钟，迅速冷却。

0.5％伊红染液的配制

将0.5g伊红溶于100毫升95％乙醇中即可。

0.5％盐酸溶液配制 将0.5毫升盐酸加入100毫升蒸馏水

固定后处理及切片 一、 洗涤与修切

1、水洗法

一般常用流水冲洗，凡用含铬或锇的固定液固定的组织块，必须用流水冲洗24h左右。常用的固定液为10%的甲醛水溶液，也必须用流水冲洗，一般时间也为24h左右，固定时间长的标本，冲洗时间也应延长。 2、酒精洗涤法

凡含苦味酸或酒精的固定液固定的组织块，大多采用酒精洗涤，如苦味酸影响着色，但易溶于70%酒精。 三、 脱水与透明 （一）、脱水的意义与目的

组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混合，因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水，脱水是借某些溶媒置换组织内水分的过程。脱水时必须由低浓度脱水剂开始，逐步转入高浓度脱水剂，以防组织过度收缩而变形，或脱水不完全而影响制片效果。脱水剂必须具有下列特性:脱水剂能

与水按比例混合；高浓度，一般指不含水分；脱水剂也能与透明剂混合。 2、透明或媒浸

（1）二甲苯：是最常用的常规透明剂，它对组织的收缩性强，易使组织变硬变脆，在二甲苯中一般30min即可使组织透明，组织块可先经过无水酒精-二甲苯混合液处理，再浸入二甲苯。也常用于切片染色后透明，且不会使染料退色。

（2zzz）苯和甲苯：对组织收缩性较小，与二甲苯相比不易使组织变脆，但透明速度慢且挥发快，适用于处理致密结缔组织、肌肉及腺体等组织的透明。 3、浸蜡

组织经透明后，在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56℃，在夏天较热时一般用高熔点石蜡，在冬天气温较低时用低熔点石蜡，主要是有利于切片的制作。时间不易过长，否则容易造成组织脆硬，时间不足，也难制作良好的切片。 （一）、石蜡包埋法

石蜡包埋法为组织学技术中最常用的一种包埋法。石蜡具有不同的熔点，夏天一般用50℃以上熔点（硬蜡）石蜡包埋，冬天用50℃以下熔点（软蜡）石蜡包埋，软的组织用软蜡包埋，硬的组织用硬蜡包埋，一般常用的包埋熔点使52-56℃，如果需要切4微米以下的切片，则用56-60 ℃的石蜡，较厚的切片则用熔点为52-54℃的石蜡。新蜡必须在温箱内溶化一次，以使其所含的挥发性物质蒸发，无论新蜡和旧蜡都必须加热过滤后再包埋。 （二）、石蜡包埋法包埋过程

组织块透明后，即可放入已熔的石蜡内浸蜡；一般厚度约5mm的实质性器官，总的浸蜡时间约2-3h，均在恒温箱内进行。较理想的的浸蜡温度是石蜡刚溶化的温度，或在蜡杯底部尚残留一小部分未熔完蜡时的温度，浸蜡完成后，即做成包有组织的蜡块。包埋蜡块的器材有专用的包埋框，也有自己制作的包埋盒，只要是具有一定形状的容器，我们都可以把它用作包埋盒。包埋的具体过程详述。 B:切片用品准备

（1）切片刀：预先磨好切片刀备用或切片前更换 新的一次性切片，切片刀对组织块的倾角非常重要，一般在10°以内，过小则组织块不能先与刀刃的刀口接触，过大时，使刀口刮组织蜡块表面，切片易碎。

（2）载物片：载物片经清洁液、95%乙醇处理后备用。 （3）展片仪：加入温水，接通电源，调整温度 （4）其他用品：准备好毛笔、记号笔、镊子、等。

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