凯氏定氮法测定蛋白质含量

更新时间：2023-04-28 09:04:01 阅读量：实用文档文档下载

说明：文章内容仅供预览，部分内容可能不全。下载后的文档，内容与下面显示的完全一致。下载之前请确认下面内容是否您想要的，是否完整无缺。

半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量

(一)方法原理

样品与硫酸一同加热消化, 分解有机质, 释放出的NH3 与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。在定氮消化瓶中,用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵,加热又分解NH3 ,用硼酸吸收, 用标定过的盐酸或硫酸滴定, 从而计算出总氮量, 换算为蛋白质量。

(二) 仪器、设备

1. 仪器

分析天平: 感量0.0001克；实验用粉碎机；半微量凯氏蒸馏装置；半微量滴定管, 容积10毫升；硬质凯氏烧瓶: 容积25毫升, 50毫升；锥形瓶: 容积150毫升；电炉: 600瓦。

2. 试剂

(1) 盐酸: 分析纯, 0.02mol/L, 0.05mol/L标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)；

(2) 氢氧化钠: 工业用或化学纯, 40%溶液(W/V)；

(3) 硼酸: 分析纯, 2%溶液(W/V)；

(4) 硼酸混合指示剂: 溴甲酚绿0.1克, 甲基红0.1克分别溶于95%乙醇中,混合后稀至100毫升, 将混合指示剂与2%硼酸溶液按 1:100比例混合, 用稀酸或稀碱调节PH值为

4.5, 使呈灰紫色, 此溶液放置时间不宜过长, 需在1个月之内使用；

(5) 加速剂: 五水合硫酸铜(分析纯)10克, 硫酸钾(分析纯)100克在研钵中研磨, 仔细混匀, 过40目筛；

(6) 浓硫酸: 比重1.84, 无氮；双氧水: 分析纯,30%；蔗糖: 分析纯；

(7) 双氧水硫酸混合液(简称混液): 双氧水、硫酸、水的比例为3:2:1, 即在100毫升蒸馏水中,慢慢加入200毫升浓硫酸, 待冷却后, 将其加入300毫升30%双氧水, 混匀, 此混液可一次配制500～1000毫升贮藏于试剂瓶中备用, 夏天最好放入冰箱或阴凉处贮藏, 室温(20℃)上下时不必冷藏, 贮藏进间不超过1个月。

(三) 操作步骤

1. 样品的选取和制备选取有代表性的种子(带壳种子需脱壳)挑拣干净, 按四分法缩减取样, 取样量不得少于20克。将种子放于60～65℃烘箱中干燥8小时以上, 用粉碎机磨碎, 95%通过40目筛, 装入磨口瓶备用。

2. 称样称取0.1克试样两份(含氮1～7毫克), 精确至0.0001克, 同时测定试样的水分含量。

3. 消煮1 将试样置开25毫升凯氏瓶中, 加入加速剂粉末。除水稻为1克外, 其它均为2克。然后加3毫升硫酸, 轻轻摇动凯氏瓶, 使试样被硫酸湿润, 将凯氏瓶倾斜置于电炉上加热, 开始小火, 待泡沫停止后加大火力, 保持凯氏瓶中的液体连续沸腾, 沸酸在瓶颈中部冷凝回流。待溶液消煮到无微小的碳粒并呈透明的蓝绿色时, 谷类继续消煮30分钟,豆类继续消煮60分钟。

4. 消煮2 将试样置于50毫升凯氏瓶中, 加入0.5克加速剂和3毫升混液,在凯氏瓶上放一曲颈小漏斗, 倾斜在电炉上加热, 开始小火(用调压器将电压控制在175伏左右), 保持凯氏瓶中液体呈微沸状态。5分钟后加大火力(将电压控制在200伏左右)。保持凯氏瓶中液体连续沸腾, 消煮总时间, 水稻、高粱为30分钟, 其它均为45分钟。

注: 消煮中列入两种消煮条件, 经与国际谷物化学协会标准法(ICC)比较, t值测验均不显著, 准确度与精密度也基本一致,在具体工作中可根据实际情况取其一种。

5. 蒸馏消煮液稍冷却后加少量蒸馏水, 轻轻摇匀。移入半微量蒸馏装置的反应室中,用适量蒸馏水冲洗凯氏瓶4～5次。蒸馏时将冷凝管末端插到盛有10毫升硼酸指示剂混合液的锥形瓶中, 向反应室中加入40%氢氧化钠溶液15毫升(如采用消煮2的条件, 加10毫升即可)。然后通气蒸馏, 当馏出液体积约达50毫升时,降下锥形瓶。使冷凝管末端离开液面, 继续蒸馏1～2分钟, 用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均需流入锥形瓶中。

6. 滴定谷类以0.02mol/L, 豆类以0.05mol/L标准盐酸或硫酸滴定至锥形瓶中的溶液由蓝绿色变成灰紫色为终点。空白用0.1克蔗糖代替样品作空白测定。消耗标准酸溶液的体积不得超过0.3毫升。

(四) 结果计算

式中:

V2 滴定试样时消耗标准酸的体积(毫升)

V1 滴定空白时消耗标准酸的体积(毫升)

N标准酸溶液的浓度(mol/L)

K 氮换算成粗蛋白质的系数

W 试样重量(克)

X 试样水分含量

0.0140每毫摩尔氮的克数

平行测定的结果用算术平均值表示,保留小数后二位。

两份试样粗蛋白质的平行测定结果为15%以下时, 其相对相差不得大于3%；15%～30%进为2%；30%以上为1%。