发酵工程与设备

发酵工程与设备

第一章绪论

生物技术作为21世纪高新技术的核心，对人类面临的食品、资源、健康、环境等重大问题发挥越来越大的作用。大力发展生物技术及其产业已成为世界各国经济发展的战略重点。

一．发酵工程的主要内容

发酵工程（Fermentation Engineering）属于生物技术的范畴，生物技术又称生物工艺学，最初是由一位匈牙利工程师Karl.Ereky于1917年提出的。当时他提出的生物技术这一名词的涵义是指甜菜作为饲料进行大规模养猪，即利用生物将原料转化为产品。现在的生物技术的定义为：生物技术是应用自然科学及工程学原理依靠生物催化剂的作用将物料进行加工以提供产品或社会服务的技术。因此，生物技术是一门综合性多学科技术，他涉及的基础学科有生物学、化学和工程学。下图为生物技术与基础学科关系的示意图。它逐渐成为与生物学、生物化学、化学工程等多学科密切相关的综合性边缘学科。

现代生物技术作为一门新兴的高科技术产业，它的生命力在于他对社会经济和发展的各个方面都带来了极大冲击和影响。

发酵工程是指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的技术。

发酵工程由于涉及到生物催化剂，因而与化学反应有关。由于生物技术的最终目标是建立工业生产过程为社会服务，因而该生产过程可称为生物反应过程（亦称为生化反应过程）。

在发酵技术中一般包括微生物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利用固定化酶，固定化细胞所做的反应器加工底物（即有生化催化剂参加），以及培养加工后产物大规模的分离提取等工艺。主要是在生物反应过程中提供各种所需的最适环境条件。如酸碱度、湿度、底物浓度、通气量以及保证无菌状态等研究内容。

二、发酵工程的发展历史

生物技术的发展和利用可以追溯到1000多年（甚至4000多年）以前如酒类的酿造。而人类有意识地利用酵母进行大规模发酵生产是在19世纪。当时进行大规模生产的发酵产品有乳酸、酒精、面包酵母、柠檬酸和蛋白酶等初级代谢产

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物。19世纪中叶，法国葡萄酒的酿造者在酿酒的过程中遇到了麻烦，他们酿造的美酒总是变酸，于是，纷纷祈求于正在对发酵作用机制进行研究的巴斯德。巴斯德不负重望，经过分析发现，这种变化是由乳酸杆菌使糖部分转化为乳酸引起的。同时，找到了后来被称为乳酸杆菌的生物体。巴斯德提出，只要对糖液进行灭菌，就可以解决这个问题，这种灭菌方法就是流传至今的巴斯德灭菌法。

巴斯德关于发酵作用的研究，从1857年到1876年前后持续了20年。否定了当时盛行的所谓“自然发生说”。他认为“一切发酵过程都是微生物作用的结果。发酵是没有空气的生命过程。微生物是引起化学变化的作用者”。巴斯德的发现不仅对以前的发酵食品加工过程给以科学的解释，也为以后新的发酵过程的发现提供了理论基础，促进了生物学和工程学的结合。因此，巴斯德被称为生物工程之父。

到了20世纪初，人们发现某些梭菌能够引起丙酮丁醇的发酵，丙酮是制造炸药的原料，随着第一次世界大战的爆发刺激了丙酮丁醇工业的极大发展。虽然现在竟争力更强的新方法已逐步取代了昔日的发酵法。但它是第一个进行大规模工业生产的发酵过程，也是工业生产中首次采用大量纯培养技术的。这一工艺获得成功的重要因素是排除了培养体系中其他有害的微生物。这在19世纪末，20世纪初，是相当先进的生物技术。因此，可以说，巴斯德是生物工程初始阶段的开拓者。

1929年Flemming爵士发现了青霉素，从此生产技术产品中增加一大类新的产品—抗生素。1929年，英国科学家弗来明在污染了霉菌的细菌培养平板上观察到了霉菌菌落的周围有一个细菌抑制圈，由于这种霉菌是青霉菌，所以弗来明把这种抑制细菌生长的霉菌分泌物叫青霉素。可是他的提取精制，在当时无法做到，弗来明只好忍痛割爱，放弃研究。

10年以后，第二次世界大战的战火越烧越旺，大量伤员急需抢救，英国的一些科学家恢复了弗来明的工作，竟戏剧性的获得了成功。当时，英国本土已经战火弥漫无法试制，美国承担了青霉素的试制任务。要生产这种药物，必须要有一种严格的、将不需要的微生物排除在生产体系之外的无菌操作技术，必须要从外界通入大量的空气而又不污染杂菌的培养技术，还要想方设法从大量培养液中提取这种当时产量极低的较纯的青霉素。美国的科学家和工程师齐心协力，攻克

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许多难关，到1942年终于正式实现了青霉素的工业化生产。这一伟大成就拯救了千千万万挣扎在战争死亡线上的人们。这是生物工程第一次划时代的飞跃。在这一飞跃中，作为生物技术核心的发酵技术已从昔日的以厌氧发酵为主的工艺跃入深层通风发酵为主的工艺。这种工艺不只是通通气，而与此相适应的有一整套工程技术，如1、大量无菌空气的制备技术，2、中间无菌取样技术，3、设备的设计技术等等。因此，我们说这是生物工程技术的一次划时代飞跃。尽管后来开发了许多新产品，如数以千计的抗生素、多类氨基酸、不同用途的酶制剂等，就根本来说，青霉素投产后的半个多世纪中，深层培养技术没有出现质的改变。

20世纪40年代，以获取细菌的次生代谢产物—抗生素为主要特征的抗生素工业成为生物发酵工业技术的支柱产业。

20世纪50年代，氨基酸发酵工业又成为生物技术产业的又一个成员。实现了对微生物的的代谢进行人工调节，这又使生物技术进了一步。

20世纪60年代，生物技术产业又增加了酶制剂工业这一成员。

70年代，为了解决由于人口迅速增长而带来的粮食短缺问题，进行了非碳水化合物代替碳水化合物的发酵，如利用石油化工原料进行发酵生产，培养单细胞蛋白，进行污水处理，能源开发等。

80年代以来，随着重组DNA技术的发展，可以按人类社会的需要，定向培养出有用的菌株，这为发酵工程技术引入了遗传工程的技术，使生物技术进入了一个新的阶段。

纵观生物技术的发展历史，我们可以知道，生物技术在经历了漫长的以传统工艺技术为主体的时期以后，正向系统的理论和实际应用相结合的方向发展，即奠定了可靠的理论和实践基础，也为今天和今后相当长时期生物技术的产业化准备了条件。

三、发酵工程的特点

在研究用微生物（生物催化剂）进行某种物质生产时，大体上有两种研究方式：一种是各种酶水平上研究微生物细胞内（外）的生物化学反应，如大量摇瓶在实验室里观察限制反应速率的因素和最适的培养方法，这可以认为是一种小规模的研究形式；另一种是大规模的研究形式，即过程放大。利用小型和中型反应器（培养罐）进行培养试验，并进一步在工业规模上研究生产物的分离和精制方

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法，以确定在细胞水平上的综合的最适培养条件。

一般化学工业的放大，可以说仅需对其放大原理给予充分的研究就足够了。而在发酵技术的放大方面，则需要由小试放大到中试逐步进行探讨。实验室进行的小规模发酵所获得的最适条件的各种参数，能否在工业规模生产使用的一百多立方到数百立方，也同样保证其最适条件，那就是不是轻而易举的事了。这是发酵工程的一个基本特点。例如，从摇瓶试验到各种规模的反应器试验，即使培养液的成分、温度、pH值等参数各种条件完全相同，并且微生物的活性及其培养过程与各个装置之间有着必要的相互关联，但一般情况下，反应结果可能完全不一致。尽管目前已有生物传感器，可以迅速准确地就位监测罐内、塔内或反应器中的反应过程，也有微机处理帮助大大提高了自动化调控的能力，而这些先进装置确实是保证在最适条件下进行发酵的有利武器，但如何保证大规模发酵在最适条件下进行，仍是一个值得研究的课题，它不仅涉及到发酵设备的工程问题，也与各类生物细胞的生理生化特性相关。

一般生物反应过程由四个部分组成。

（1）材料的预处理

包括原材料的选择，必要的物理和化学方法加工，此过程是为提供微生物细胞可以生长和产物形成的基本原料，即培养基的制备过程，包括其配制和灭菌等。（2）生物催化剂的制备

生物反应的催化剂—酶基本上是由微生物产生的。因此，要选择高产、稳定、高效、容易培养的菌株，并以此菌株再经过多次逐级扩大培养后达到足够的数量并具有理想质量的微生物培养液作为“种子”接到反应器中。也可以利用固定化酶或固定化细胞，这就要通过一定的固定化技术来制备。

（3）生物反应器及反应条件的选择与监控

生物反应器是进行生物反应的核心设备，生物反应主要是在生物反应器中进行的，它为微生物细胞或酶提供合适的反应条件以达到细胞增殖或产品形成的目的。反应器的结构、操作方式和操作条件对反应原料的转化率、产品质量和产品成本有着密切关系。根据发酵周期长短、培养条件等，可采取间歇式操作、多级反应器串联的连续操作等。同时反应参数的检测与控制对生物反应过程的顺利进行也是十分重要的。

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（4）产品的分离纯化

这一工序也叫下游加工程序，其目的是用适当的方法和手段将含量较低的产物从反应液中提取出来（指胞外产物）或从细胞中（指胞内产物）提取出来，并加以精制以达到规定的质量要求。包括物理方法、化学方法、生物方法等。生物反应过程主要有这样一些特点：

a．采用可再生资源作为主要原料，因而原料来源丰实，价格低廉，过程中废物的危害性较小，但由于原料的成分复杂，往往难以控制会给产品质

量带来一定的影响。

b．由于采用的是生物催化剂，反映过程一般在常温常压下进行。但生物催化剂易受环境的影响和杂菌的污染，因而很易失活，难以长期使用。

c．与一般化工产品相比，其生产设备比较简单，能耗较低。但某些生物反应由于其特殊性质而使反应基质浓度和产物浓度均不能太高，这是因为

微生物细胞或生物酶受底物浓度或产物浓度的抑制或不能耐高渗透压所

致，不仅使反应器体积增大，而且也加大了提取的困难，因而反应器生

产效率较低。

d．尽管生物反应过程成本低，应用广，但反应极为复杂，较难检测与控制。

反应液中杂质多，给分离提纯带来了困难。

四. 生物反应过程的分类

随着生物技术的发展，生物反应过程的种类和规模都在不断的扩大。目前已进行工业生产的主要有酶催化反应过程，微生物反应过程和废水的生物处理过程。

1.酶催化反应过程

采用游离酶或固定化酶为催化剂时的反应过程。生物体中所进行的反应几乎都是在酶的催化下进行的。工业生产中所用的酶，或是经提取分离得到的游离酶，或是固定在多种载体上的固定化酶。

2.微生物反应过程

采用活细胞为催化剂时的反应过程。这既包括一般的微生物发酵反应过程，也包括固定化细胞反应过程和动植物细胞的培养过程。

3.废水的生物处理过程

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它是利用微生物本身的分解能力和净化能力，除去废水中污染物质的过程。废水生物处理过程与微生物反应过程虽然都是利用微生物的反应过程，但与后者相比废水的生物处理具有以下特点：

a)是由细菌等菌类、原生动物、微小原生动物等各种微生物构成的混合培养

系统。

b)几乎全部采用连续操作系统。

c)微生物所处的环境条件波动大。

d)反应的目的是消除有害物质而不是代谢产物和微生物本身。

五、生物化学工程的基本内容

生化工程是运用化学工程的原理和方法将生物技术的实验室成果进行工业开发的一门学科。其原理与方法是指用以解决生产过程中有关化学反应、原料处理和产物的分离、能量的传递、设备的设计与放大、过程的控制和优化等一系列工程技术问题。

在生物化学反应过程的上游加工中最重要的是生物催化剂（包括菌株、酶及其固定化）的制备，因此必须掌握生物催化剂的生理生化特性和培养特性，解决大规模种子培养或固定化生物催化剂的制备以及如何将其在无菌状态下接入生物反应器中等问题。

上游加工中还包括原材料的物理和化学处理、培养基的配制和灭菌等问题，这里包括有物料破碎、混合和输送等多种化工单元操作以及热量传递、灭菌动力学和设备等有关工程问题。

生物反应器是整个生物反应过程的关键设备。它是为特定的细胞或酶提供适宜的生长环境或进行特定的生化反应的设备，它的结构、操作方式和操作条件与产品的质量、产量和能耗有着密切的关系。生物反应器存在着物料的混合与流动、传质与传热等化学工程问题；存在着氧和基质的供需和传递、发酵动力学、酶催化反应动力学、发酵液的流变学以及生物反应器的设计与放大等一系列带有共性的工程技术问题；同时还包括生物反应过程的参数检测和控制。有关这一中游加工过程的工程问题已发展成为生化工程的重要学科分支—生物反应工程。

生物反应过程的下游是对目的产物的提取与精制。这一过程是比较困难的。这是因为一方面生物反应液中的目的产物的浓度是很低微的。例如，浓度最高的

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乙醇仅为10%左右，氨基酸不超过8%，抗生素不超过5%，酶制剂不超过1%，胰岛素不超过0.01%，单克隆抗体不超过0.0001%；另一方面因为反应液杂质常与目的产物有相似的结构，加上一些具有生物活性的产品对温度、酸碱度都十分敏感，一些作为药物或食品的产品对纯度、有害物质都有严格的要求。总之，下游加工过程步骤多，要求严，其生产费用往往占生产成本的一半以上。

生物技术研究的主要目标是最大限度地提高上游处理、发酵与转化、下游处理这三个步骤的整体效率，同时寻找一些可以用来制备食品、食品添加剂和药物的微生物。从20世纪60~70年代起，生物技术的研究主要集中在上游处理过程、生物反应器的设计和下游的纯化过程方面，这些研究使发酵过程的检测、生物反应体系的检测技术和有效的大量培养微生物的技术及相关仪器方面都有了很大的发展。目前，这些仪器已经可以用于生产各种不同的产品。

在利用微生物生产商品的整个过程中，生物转化这个环节往往是最难优化的。通常用于大规模生产的培养条件往往不是自然条件下微生物的最佳生长条件。因此，人们一般通过化学突变、化学诱变或者紫外线照射来产生突变体，从而改良菌种、提高产量，传统的诱导突变和选择的方法在发酵生产中获得了较大的成功。多种抗生素的大量生产过程就是这种方法的成功例证。

但是通过传统的方法提高产量的幅度是非常有限的，如果一个突变了的菌株某一组分合成太多，那么其他一些代谢物的合成就会受到影响，因此这反过来又会影响微生物在大规模发酵过程中的生长。传统的诱变和选择的方法过程繁琐、耗时过长、费用极高，需要筛选和检测大量的克隆。另外，用传统的方法能提高微生物一种已有的遗传性质，并不能赋予这种微生物以其他遗传特性。总的来说传统的改良菌种的生物技术还仅仅局限在化学工程和微生物工程的领域内。随着DNA重组技术的出现和发展，这种情况发生了根本性的改变。

现代生物技术的发展主要体现在下列几方面：

1、基因操作技术日新月异，不断完善。新技术、新方法一经产生就迅速的通过

商业渠道出售此项技术并在市场上加以应用。

2、基因工程药物和疫苗研究与开发突飞猛进。新的生物治疗制剂的产业化前景

十分光明，21世纪整个医药工业将面临全面的更新和改造。

3、转基因动物和植物取得重大突破。现代生物技术在农业上的广泛应用作为生

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物技术的“第二次浪潮”在21世纪将全面展开，给农业畜牧业生产带了新的飞跃。生物技术对农业的总贡献率大于70%，功能性食品在营养学上起着革命性的变化。

4、阐明生物体（目前主要有人类、水稻、拟南芥等）基因组及其编码蛋白质的

结构和功能是当今生命科学的一个主流方向。目前已有多个原核生物及一个真核生物（酵母）的基因组序列被全部测定。与人类重大疾病相关的基因和与农作物产量、质量、抗性等有关基因的结构与功能及其应用研究是今后一个时期研究的热点和重点。

5、基因治疗取得重大进展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。估计在本

世纪初，恶性肿瘤、爱滋病的防治可望有所突破。（基因治疗对象：遗传病、恶性肿瘤、艾滋病、乙肝、代谢性病、心血管病等）

6、蛋白质工程是基因工程的发展，它将分子生物学、结构生物学、计算机技术

结合起来，形成一门高度综合的学科。

7、国际上信息技术的飞速发展渗透到了生命科学领域，形成了引人注目、用途

广泛的生物信息学。全球通讯网络的日益扩大和完善也大大加速了生物技术的研究、应用和开发。

现代生物技术在近20年的发展中受到了各方面人士的普遍关注，更有许多专家将21世纪称为生命科学的世纪，将现代生物技术产业称为21世纪的朝阳产业。一方面是由于现代生物技术发展迅速，用途广泛；另一方面是由于现代生物技术具有其他技术所无法比拟的优越性，即可持续发展。面对人口膨胀、资源枯竭、环境污染等一系列直接关系到整个人类生死存亡的严重问题。，人们越来越深刻的认识到了发展具有可持续发展的新技术、新产业的必要性和紧迫性。由于生物技术是以生物（动物、植物、微生物、培养细胞等）为原料生产产品的，因此其原料具有再生性，同时利用生物系统生产产品产生的污染物很少，对环境的破坏性很小或几乎没有，重组微生物甚至还可以消除环境中的污染物。鉴于生物技术产业的以上特点，清洁、经济的生物技术必然会在21世纪获得更大的发展。

六、如何学习《发酵工程与设备》

以微生物的生命活动为基础的发酵工业正为人类的健康和生产实践服务，生

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产了大量的抗生素、酶制剂、氨基酸、维生素、蛋白质以及其他有用产品。为了在今后实际工作中对提高发酵工程的生产效率和创立新的发酵过程有所认识，我们必须运用生物化学、微生物学等已学过的知识，详细了解和掌握发酵条件下的微生物新成代谢的规律和整个反应过程所涉及的各个条件及作用，对微生物各种反应做定量的动力学方面初步研究以控制微生物生命活动的途径，在此基础上，学习和掌握微生物代谢过程中的物质传递机理；同时，认识和了解整个生物反应过程中的设备结构和计算、形式各异的反应器的结构和特点，即在这门课程中，对微生物发酵工业中培养基灭菌、空气除菌、反应动力学数学模型的建立、发酵设备的结构、通气搅拌功率计算和设备放大、设备选型及设计方法进行较为全面的分析和讲解，并在讲解中列举部分实例和有关生化工程设计数据。

另外，要结合有关工艺、技术、设备等方面的知识认真准备和操作实验，做到理论联系实际，便于今后能够较快较好的适应工作。

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第二章菌种的扩大培养

菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。

工业规模的发酵罐体积越来越大，目前已达到几十立方米至几百立方米。若按5～10％的接种量计算，就要接入几立方到几十立方米的种子。这单靠试管里的种子直接接入是不可能达到必需的数量和质量的，必须从试管中的微生物菌种逐级扩大为生产使用的种子。这是一个从实验室制备到车间生产的过程。然而，菌种种类不同，生产产品品种不同，其生产方法和生产条件均有所差别，如营养、温度、酸碱度、氧等条件。因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛和数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，会使发酵生产周期缩短，设备利用率提高，对杂菌的抵抗能力增加，对发酵生产起到了关键性的作用。所以种子质量的好坏至关重要。

种子必须具备的条件：①菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐中能迅速生长；②生理性状稳定；③菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要求；④无杂菌污染（不带杂菌）；⑤生产能力稳定。

第一节种子制备

种子制备过程可分为两大阶段（如图）：

a、

b、

①实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等

或液体摇瓶培养。

②生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养。

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第 11 页 2013-4-22 一． 实验室种子制备

在砂土管或冷冻干燥管内保藏的菌种以无菌的方式接至适合的斜面培养基上，培养成熟后挑选正常的菌落再接一次试管斜面。对那些产孢能力强、孢子发芽生长繁殖快的菌种可以采取在固体培养基上培养的方法，孢子可直接接入种子罐，从而简化了操作，减少了操作步骤，同时也减少了染菌的机会。例如生产青霉素的产黄青霉菌，采用大米或小米作为固体培养基，取一定量装入250ml 茄子瓶中进行灭菌，米粒含水量一定要控制好，米粒不能粘也不能散，灭菌冷却后接入孢子悬浮液，在25～28℃ 培养4～14天。培养期间，还要经常翻动，保持通气均匀。培养结束后，或接入种子罐，或以真空抽去水分至10％以下，于4℃冰箱中保存备用。

对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌，产卡那霉素的卡那链霉菌都是以摇瓶液体培养法。孢子接入含液体培养基的摇瓶中，在摇床上恒温振荡培养，生长出的菌丝体作为种子。

不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌属，短杆菌属，以32℃培养18～24小时的斜面移入250ml 茄子瓶斜面培养基上，或摇瓶培养基上，32℃培养，12小时后可接入种子罐。

生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂培养基斜面上，4℃ 冰箱保藏。3～4个月移种一次，再接种至10ml 麦芽汁试管中，25～27℃ 保温培养2～3天后，扩大至含250ml 麦芽汁的500ml 三角瓶或含500ml 麦芽汁的1000ml 三角瓶中。25℃培养2天，再移至含5～10L 麦芽汁的卡氏罐中，15～20℃ 培养3～5天，再接入发酵罐，因是好氧性菌（菌体增殖期间），所以要通气。具体流程如下：

二． 生产车间种子制备

实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子罐进行扩大培养。种子罐培养一方面使菌种获得足够的数量，另一方面种子罐中的培养基更接近发酵罐培养的醪液成分和培养条件，譬如通无菌空气，搅拌形式等等，以使菌体适应发酵环境。

种子罐的接种方法一般根据菌种种类而异。孢子悬浮液一般用微孔接种法接种，摇瓶悬浮液种子可在火焰保护下接入种子罐，也可以用差压法接入。种子罐之间或种子罐与发酵罐之间的移种，主要用差压法，通过种子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降为零，因为无压会引起染菌。

1. 种子罐级数的确定

种子罐的级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，这要根据菌种生长的特性、孢子发芽速度和菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。对于生长快的细胞，种子用量的比例少，即需要的接种量少，所以相应的种子罐也少。如谷氨酸生产中，茄子瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于32℃培养7～10小时，菌体浓度达到108～109个/ml，即可作为种子接入发酵罐，这称为一级种子罐扩大培养，也可叫作二级发酵。生长较慢的菌种，如青霉素生产菌，就需要二级种子罐扩大培养，也可称为三级发酵。一般50m3发酵罐都采取三级发酵。如果是实验室的中试（5～30L），可以通过直接孢子或菌体接入罐中发酵，即一级发酵。

种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于控制，而且可以减少多次移种可能发生的染菌机会。当然，也要考虑尽可能地延长菌体在发酵罐中生产产物的时间，缩短种子增殖的非生产时间，提高发酵罐的生产率（产物/ml·h）。

此外，种子罐的级数的减少也可通过改善工艺条件，改变种子培养条件，加速菌体的增殖。

2. 接种种龄和接种量

①接种龄：

接种龄是指种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。在种子罐中，随着培养时间的延长，菌体量增加，基质消耗和代谢产物积累，菌体量不再增加，逐渐老化。因此，选择适当的种龄接种量是一个至关重要的因素。接种龄一般以菌体处于生长旺盛期，即对数生长期最合适。如果种子过于年幼。接入发酵罐后，会出现前期生长缓慢，整个发酵周期拉长，产物开始形成的时间推迟，而过老的种子也会出现使生产能力下降而使菌体自溶的现象。

对于不同菌种，不同产品品种，不同工艺条件，其接种龄也不相同，具体的生产，接种龄要进行多次试验，从发酵产品产量的多少，即产率大小来确定最适接种龄。

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②接种量

接种量指的是移入的种子悬浮液体积和接种后培养液体的体积的比例。抗生素的工业生产，大多数发酵的最适接种量为7～15％或更多。啤酒生产发酵的接种量为5～10％，谷氨酸发酵接种量仅为1％。

接种量大小取决于生产菌的生长繁殖速度。大接种量可以缩短发酵罐中菌体数达到高峰的时间，可以提早形成产物。这是因为种子液中含有胞外水解酶类，种子量大，酶量也多，有利于对基质的作用和利用，同时菌体量多，占有绝对生长优势，可以相对减少杂菌的污染生长机会。但接种量太大，也会造成菌体生长过速，溶氧跟不上，从而影响产物的合成。

3. 种子质量的判断

由于菌种在种子罐中的培养时间较短，使种子的质量不容易控制，因为可分析的参数不多。一般，在培养过程中要定期取样，测定其中的部分参数来观察基质的代谢变化以及菌体形态是否正常。例如酒精酵母的种子罐，一般定时测酸度变化、还原糖含量、耗糖率、镜检等，镜检内容包括测酵母细胞数、酵母出芽率、酵母形态（整齐、大小均匀、椭圆形或圆形）、是否有杂菌等。

三．影响种子质量的因素

1．原材料质量

生产过程中有时会出现种子的质量不稳定现象，这主要是由于原材料的质量不一致造成的。有些原材料如麸皮，是用来配制产孢子斜面培养基的。制备霉菌培养基的大米、小米等会因产地、品种、加工方法及颗粒大小不同而使孢子质量受到影响；蛋白胨、琼脂的质量、水质的硬度、污染程度等对生产均会产生不同程度的影响。

2．培养条件

培养条件对种子质量的影响最直观，最显著。如培养温度高于或低于种子的培养温度范围，会使菌种生长过快或过慢，造成菌体过早衰老自溶或拉长培养时间，而影响生产。所以要控制菌体的培养温度在最适的范围内。湿度对产孢子的菌种影响很大，这一湿度是指培养基的湿度，有时也包括空气湿度。如制白酒酒曲时，空气湿度会影响曲中各种不同微生物的生长。在生产抗生素菌种时，孢子就会受湿度的影响而使其生长快慢不一。通气量对于好气性菌体的生长和质量是

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一个很重要的影响因素。有些菌种的通气量甚至可能影响到它们的代谢途径。如酒精酵母，在通入足够的空气时会利用培养基中的糖合成自身细胞物质，而在通气不足或完全不通气时，则使糖代谢进入无氧代谢（EMP）途径，合成酒精成分。青霉素的菌种在培养时必须通过足够的空气，否则就会影响他们的数量和活力，从而减少发酵液的产率。所以不同的菌种，对通气量的要求是不同的。

3．斜面保藏时间

斜面的保藏时间对菌种的质量具有一定的影响。如抗生素中土霉素生产菌的孢子斜面在培养4天后放入4℃冰箱保藏，在7～8天时就开始自溶了，而培养了5天后再冷藏，20天都未发生自溶。此外，冷藏时间过长会使菌体的活力下降。

第二节种子质量的控制措施

种子质量的优劣是通过它在发酵罐中所表示的生产率体现的。因此必须保证生产菌种的稳定性，在种子培养期间保证提供适宜的环境条件，保证无杂菌浸入，从而获得优良的种子。

1.菌种稳定性的检查

生产中所用的菌种必须保持稳定的生产能力，不能有变异种。尽管变异的可能性很小，但不能完全排除这一危险。所以，定期检查和挑选稳定菌株是必不可少的一项工作。方法是：将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中，逐级稀释，然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落接入三角瓶进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用。

这一分离方法适用于所有的保藏菌种，并且一年左右必须做一次。

2．杂菌检查

在种子制备过程中，每移种一次都需要进行杂菌检查。一般的方法是：显微镜观察，或平板培养试验，即将种子液涂在平板培养皿上划线培养，观察有无异常菌落，定时检查，防止漏检。此外，也可对种子液的生化特性进行分析，如取样测其营养消耗速度、pH变化、溶氧利用情况、色泽、气味是否异常等等。

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第三章灭菌

在生物化学反应中，特别是对各种微生物的培养过程中，要求在没有任何杂菌污染的情况下进行，而生物反应系统中又常常有比较丰富的营养物质，极易滋生杂菌，从而使生物反应受到破坏，产生的不良后果一般为：

1. 使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。

2. 杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降。

3. 有些杂菌会分解产物，使生产失败。

4. 杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常。

5. 如发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。

正因如此，大多数培养过程要求必须在严格无菌的条件下培养，必须对生产设备及参与反应的所有介质（生产菌除外）进行灭菌处理。

第一节灭菌的方法

灭菌，是指用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中所有生命物质的过程。常用方法如下：

（1）化学药剂灭菌：

某些化学药剂能与微生物细胞物质发生反应而具有杀菌作用。如甲醛、氯（或次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐（如新洁尔灭）等。因化学药剂也会与培养基中的一些成分产生作用，而且加入培养基中后不易去除，所以化学药剂灭菌不用于培养基灭菌。

（2）射线灭菌

紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子能起到灭菌的作用。波长为2.537×10-7的紫外线有灭菌效果。但由于其穿透力低，所以只用于表面消毒和空气消毒。X射线和由Co60产生的γ射线也可灭菌。

（3）干热灭菌

160℃保温 1 h。主要针对必须保持干燥的实验器具或材料（培养皿、接种针、固定化细胞用的载体材料等）。

（4）湿热灭菌

湿热灭菌为最基本的灭菌方法，因为蒸汽穿透能力强，且在冷凝时放出大量

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第 16 页 2013-4-22 的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀灭微生物。但如果利用蒸汽直接通入培养基中加热灭菌，应考虑扣除冷凝水的体积，否则会降低培养基的浓度。湿热灭菌一般是在120℃维持20～30 min 。

（5） 过滤除菌

这是利用过滤方法阻拦微生物达到除菌的目的。工业上利用此方法制备无菌空气。在产品的提取中，也可用过滤的方法（如超滤）处理料液，以得到无菌产品。

第二节 培养基灭菌

1. 微生物的死亡速率

在培养基湿热灭菌时，其中微生物受热死亡的速率是与残存的微生物数量成正比的。即

kN dt

dN =- 其中N ：培养基中的活菌个数

t ：时间

k ：比死亡速率

开始灭菌时，即0=t 时，培养基中活菌数为0N 。 积分上式：dN N N N ?

01＝－?t kdt 0 kt N N -=0

ln 或 kt e N N -=0 N 为经过时间t 残留的活菌数。 若以0

N N 为纵坐标，t 为横坐标作图，结果为一直线，其斜率为k -。如下图为大肠杆菌在不同温度下的残留曲线。

k值越大，表明微生物越容易死亡。

2. 培养基灭菌

培养基的灭菌有分批法和连续法两种。分批灭菌是将配制好的培养基放入发酵罐中，通入蒸汽，使培养基和所有设备一起灭菌。这一过程也称为实罐灭菌。连续灭菌是在配制好的培养基向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却，完成整个灭菌过程。连续灭菌时间短，灭菌温度一般高于分批灭菌，所以可减少对营养物质的破坏，灭菌效果优于分批式，但灭菌设备较复杂，投资大，而且所有设备须事先进行空罐灭菌，如发酵罐、加热器、维持罐、冷却器等。

第三节空气除菌

微生物在繁殖和好氧性发酵过程中都需要氧，而用纯氧是没有必要的。一般是以空气作为氧源，被通入发酵系统。但空气中含有多种微生物，这些微生物一旦随着空气进入发酵系统，它们也会大量繁殖，不仅消耗大量的营养成分，还可能产生各种各样的代谢产物，影响和破坏发酵的正常进行，危害极大。因此，空气必须经过除菌后才能通入发酵液。空气除菌过程是需氧发酵过程的一项十分重要的环节。除菌的方法很多，这里着重介绍过滤除菌。

一．空气过滤除菌流程

空气过滤除菌流程是按生产对无菌空气的要求，根据空气的性质制定的。此外，也要从吸气环境的空气条件和所采用设备的特性综合考虑后设计。

对一般要求的低压无菌空气，可直接采用鼓风机增压后进入过滤器，经过一至二次过滤除菌制得。如无菌室、超净工作台等的无菌空气就是采用这一简单流程。一般深层通风发酵，除了要求无菌空气具有必要的无菌程度外，还需具有一

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第 18 页 2013-4-22 定的压力，这即是比较复杂的空气除菌流程。

1．空气除菌流程的要求

空气应具有一定的压力，过滤器要高效，设备尽量采用新技术，流程尽可能简化，降低动力消耗，工人操作简便，运转费用低。设备中要用无油润滑，否则有油雾，影响过滤效率。

2．流程分析

空压机→冷却→分油水→总过滤器→分过滤器

由于不同地区气候条件不同，发酵工厂使用的空气除菌流程有所不同。过滤器要达到高效率，就应该维持一定的气流速度，并且不能受空气中油、水的干扰。气流速度可以控制，但要除去油分和水分，则需要一系列的冷却、分离、加热等设备来保证空气的相对湿度在50～60%。

一般的过滤器用棉花和活性炭制成，活性炭夹在棉花中间。

以下为典型的设备流程

（1） 高空采风、两次冷却、两次分油水、适当加热流程（如图）

这是比较完善的空气除菌流程，对各种气候环境条件都能适应。分离水分效率较高，并能使空气在达到较低的相对湿度时进行过滤，提高了过滤效率。此流程的特点是：两次冷却、两次分油水、适当加热。空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却至20～25℃，经分水后加热到30～35℃，因为温度升高，相对湿度下降。

空气中的水蒸汽分压与同温度下的饱和水蒸汽压之比为相对湿度或相对湿含量：

s w p p =? w p —空气中水蒸汽分压（Pa ）

s p —同温下水的饱和蒸汽压（Pa ）

第 19 页 2013-4-22 每1 kg 干空气中可含有水蒸汽的kg 数为空气的湿含量或绝对湿含量。若G g kg 干空气含有G w kg 水蒸汽，则其湿含量为 ??

? ??-=-?===干空气Kg Kg p P p p P p M M p M p M G G X w w w w g w g g w w g w 622.0 P —空气总压强

g p —干空气的分压强

此式与上式合并得 s

s p P p X ??-=622.0 例1：某除菌流程，空气压力为4 atm （表压），要求空气加热到35℃时，相对湿度2?=60%，问第二级冷却器应至少把空气冷却到多少度？（假设冷却后的空气中不含水雾）

解：查表得35℃时空气中的饱和水蒸汽分压2s P =5619Pa ，加热前冷空气的相对湿度1?=100%，加热前后空气湿含量没有发生变化，21X X =，加热前后压力不变。

2

222211111622.0622.0s s s s p P p p P p ????-=-? 122211P p P p s s ??=

21P P =

2211s s p p ??=∴

%1001=?

337156196.0221=?==∴s s p p ?(Pa)

查水蒸汽分压表得知26℃水的蒸汽压力为3371Pa ，即第二级冷却器至少应把空气冷却到26℃。

(2) 冷热空气直接混合式空气除菌流程（如图）

此流程适用于中等湿含量的地区。它的特点是：可省去一级冷却和分离

第 20 页 2013-4-22 设备及空气再加热设备，简化了流程，使冷却水用量也降低了。压缩空气从贮罐出来分两路，一部分进冷却器，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合，使混合后的空气温度为30～35℃，相对湿度为50～60%。

例2． 吸入的空气251=t ℃，1　?=80%，冷却后2t =25℃，2?=100%，混合后

3t =35℃，3?=60%，计算混合比（1P =1 kg/㎝2，32P P ==4 kg/㎝2）

。 解：吸入空气的湿含量

1

11111P 622.0s s p p X ??-?=0165.00323.08.010323.08.0622.0=?-??=（kg 水蒸汽/kg 干空气） 冷却分水后空气湿含量

2

22s222 p 622.0s p P X ??-?=051.00323.0140323.01622.0=?-??=(kg 水蒸汽/kg 干空气) 混合空气的湿含量：

3

33333622.0s s p P p X ??-?=0054.00573.06.040573.06.0622.0=?-??=(kg 水蒸汽/kg 干空气) 设未处理的空气百分比为Y

则

()3211X X Y Y X =-+

%32

123=--=X X X X Y (3) 高效前置过滤除菌流程

上述的流程都能降低低空气的相对湿度，改善过滤器的过滤条件。为了提高空气的无菌程度，也可以采用高空采风，因为高度越高，空气中微生物含量越少。一般情况下，每升高10米，空气中微生物含量减少一个数量级。所以一方面可进行高空吸风，另一方面也可以采用高效的前置过滤方法，即在压缩机前设置一台高效过滤器，这样便可降低过滤器负荷（即多次过滤），达到空气除菌的要求。

第 21 页 2013-4-22 前置过滤器可采用泡沫塑料（即静电除菌）、超细纤维纸为过滤介质，并串联试用。

二． 对数穿透定律

1． 对数穿透定律

通过滤层杂质数是随滤层厚度的增加而减少的，即 N K dl

dN 1=- 1K ：过滤常数或除菌常数。 ?N

N N 01dN =-1K ?L

dl 0

ln N N =-L K 1

0N N =L K e 1- 0N 和N ：一定体积的空气在除菌前后的总菌数（个）

L ：过滤介质厚度（m ）

滤层不能太厚，否则过滤阻力太大；过滤器直径不能太大，否则棉花添料不易填均匀，容易在某一地方形成短路。 穿透率：o

N N P =为穿透滤层的微粒数与原有微粒数的比值。 如果要求每1000次使用周期中只允许有一个杂菌通过，即经过滤后要求无菌度310-=N ，则

θ

θ19

131033.360500010V V P --?=??= 其中

假设原有颗粒数为5000 (个/3m )

θ为分批发酵的时间或过滤器的无菌周期（h ）

1V 为通风量（min 3m ）

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