基因工程复习题

期末考试题型： 一、符号题(10’) 二、填空题(20’) 三、选择题(15’) 四、名词解释(15’) 六、问答题（25’） 七、实验设计分析（15‘） 符号题:

cccDNA ocDNA scDNA lDNA ELISA

PAGE PCR RT-PCR I-PCR BAC YAC

RFLP RAPD AFLP SSRP……

名词解释：

基因工程/重组DNA技术是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程

聚合酶——是一类能够合成DNA或RNA分子的酶。

回文结构：双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列。 基因库 基因组文库 cDNA文库

核酸内切酶、限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶 、核酸外切酶 、末端脱氧核苷酸转移酶、

课程总结

第一章

1. 基因工程诞生的理论基础和技术基础

理论基础——1、DNA是遗传物质；2、DNA双螺旋结构；3、中心法则\和遗传密码 技术突破——1、限制性内切酶；2、DNA连接酶；3、载体；4、感受态体系； 5、琼脂糖凝胶电泳；6、DNA测序技术

2．基因工程的基本过程

3. DNA体外重组的开创性实验

第二章

1. 核酸限制性内切酶的命名原则、类型及主要特性

2. 常用的DNA聚合酶的特性和用途以及探针的标记原理

3. 核酸外切酶 、反转录酶、DNA修饰酶、末端脱氧核苷酸转移酶的功能及用途

第三章

1. 理想的基因克隆载体应具有的条件

2. 各类载体的基本结构、特点及容载量

第四章

1. 目的基因的获取方法及优缺点

2. 基因库、基因组文库、 cDNA文库的区别

3.构建基因组文库的基本过程

4.一个理想的基因文库应具备的质量标准 第五章

1．连接目的基因与载体的方式

2. 外源基因导入真核细胞的方法

3. 重组DNA导入大肠杆菌的方法及影响转化率的因素

4. Southern blotting、Northern blotting、western blotting、菌落原位杂交筛选的特点

与区别

5. 重组体克隆的筛选和鉴定方法,蓝白斑筛选法、酶联免疫吸附测定（ELISA）的原理

第六章

1. 原核表达载体的类型及其组成结构

1. 非融合型表达载体

2. 分泌型表达载体

3. 融合蛋白表达载体系统----pGEX系列

2. 提高原核细胞表达水平常用的方法

选择强启动子序列，如tac 等

调整S-D序列与AUG间的距离（一般为5-9bp。）

3. 改变起始密码下面的几组密码子（UAU或CUU能提高翻译的起始效率。）

4. 增加mRNA的拷贝数和稳定性（在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列”能防止mRNA受到35’外切酶的攻击。）

5. 减轻宿主细胞的代谢负荷（合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。）

（1）诱导表达（将宿主生长代谢与外源基因表达分开。一般采用温度诱导或药物诱导） （2）表达载体诱导复制（将宿主的生长与载体的复制分开。当需要宿主大量生长时，抑制载体的复制。当宿主大量生长后，再诱导载体的复制，增加拷贝数。）

6. 提高表达产物的稳定性（1）设计成融合蛋白（2）降低宿主菌自身蛋白酶的活性（3）表达分泌蛋白

3. 酵母表达系统的优缺点

（1）优点

①对其遗传学和生理学的研究比较深入。 ②小量培养和大规模反应器中都能生长。 ③已经分离出很强的启动子。 ④有翻译后的加工。

⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯化。 ⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不需要宿主的安全性检验。 （2）缺点

①表达量普遍低。

②常常发生质粒丢失。

③重组蛋白常常超糖基化（每个N-寡糖链上含有100多个甘露糖；正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-13个甘露糖。） ④分泌困难。（分泌型蛋白有时会留在壁膜间隙。）

第七章

1. 探针的分类

核酸探针的种类

根据标记物不同分为：

放射性探针 非放射性探针

根据探针的来源和核酸性质的不同分为： DNA探针 RNA探针 cDNA探针 寡核苷酸探针

2. PCR技术的原理、影响因素及应用

影响因素：1. DNA聚合酶 2. 引物（primer) ①位置②引物的长度③引物的碱基序列④引物的碱基组成⑤引物的Tm值⑥引物的浓度⑦简并引物⑧套嵌引物（nested primers) 3. 模板（template) ① 纯度② 模板的量 4. dNTPs

5. Mg 2+ 的浓度

6. PCR反应系统其他成分 7. 扩增反应程序 ：①变性：90~95℃，30~60s ②退火：40~60℃， 30~60s 退火温度↓ ——特异性↓——退火时间↑ ③延伸：72℃，1min（≦2kb，35～100 nt/s ） ④循环次数：25－40.。 循环次数↑ —— 产物量↑ 平台效应：循环次数太多时，反应后期,正确产物生成停止。

PCR技术的应用：1. 扩增某一段DNA 2. 基因的体外诱变 3. 基因组的比较研究

3. 酵母双杂交的原理及系统组成

一、双杂交原理——结构域（Domain）合作

许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成。

双杂交原理——X基因和Y基因产物的相互结合，导致reporter gene表达。Reporter gene表达就可说明X基因产物于Y基因产物能结合。

二、双杂交系统组成

1. 双杂交体系的穿梭质粒（融合表达载体）

2. 宿主菌（ 删除基因组中的内源野生型GAL4基因。使酵母菌只能利用载体表达的GAL4蛋白。）

3. 报告基因（reporter gene）（GAL4的效应基因是his3/lacZ/Ura3。）

4. 提高PCR扩增产物特异性的的措施

思考题：

PCR反应出现非特异性扩增，可采取哪些措施来改进？ ①提高退火温度，减少退火时间； ②降低引物及TaqDNA酶浓度； ③降低Mg2+的浓度。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/4z5t.html