3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖
更新时间:2023-09-28 02:27:01 阅读量: 综合文库 文档下载
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3,5-二硝基水杨酸比色法
----标准曲线的制作 1.实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖10257 RP麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
2.实验材料、主要仪器和试剂
2.1实验材料
主要用到这些实验材料:红曲黄色素发酵液、钠虑膜浓缩后红曲黄色素液、旋转蒸发后红曲黄色素液。
2.2主要仪器
本实验用到的实验仪器有:
1) 具塞玻璃刻度比色管:25mL×19; 2) 烧杯:100mL×4; 3) 三角瓶:100mL×1;
4) 容量瓶:100mL×3,50mL×3; 5) 刻度吸管:1mL×4;2mL×3;10mL×1; 6) 沸水浴; 7) 冰浴; 8) 扭力天平;
9) UV—2802SH型紫外可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;
2.3实验试剂
1) 1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL,混匀,4℃冰箱中保存备用。
2) 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂
将6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液,加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中备用。
3.实验步骤 制作葡萄糖标准曲线
取7支25mL具塞刻度试管编号,按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作
管 号
1mg/mL葡萄糖标准液
(mL)
蒸馏水 (mL)
DNS (mL)
葡萄糖含量 (mg)
光密度值 (OD540nm)
0 1 2 3 4 5 6
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
将各管摇匀,在沸水浴中准确加热5min,取出,冰浴冷却至室温,用蒸馏水定容至25mL,加塞后颠倒混匀,在分光光度计上进行比色。调波长540nm,用0号管调零点,测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标,葡萄糖含量(mg)为横坐标,做出标准曲线。
蒽酮比色法测糖
一 目的 掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法
二 原理 蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖
基及已糖醛酸起反应,反应后溶液呈蓝绿色,在620nm处有最大吸收。
本法多用于测定糖原的含量,也可用于测定葡萄糖的含量。
三 实验器材及试剂
马铃薯干粉
可调试移液器或移液管 可见分光光度计(723型) 电子分析天平 水浴锅
电炉子
蒽酮试剂:取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中,以80%H2SO4定容到1000ml,当日配制使用。 标准葡萄糖溶液(0.1mg/ml):100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中,定容到1000ml备用。 四、操作
1.制作标准曲线
取7支干燥洁净的试管,按表1顺序加入试剂,进行测定。以吸光度值为纵坐标,各标准溶液浓度(mg/ml
)为横坐标作图得标准曲线。
表1 蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作
沸水浴中准确煮沸10min,取出用流水冷却,室温放10min,于620nm处比色
葡萄糖浓度(mg/ml)
2.样品含量的测定
样品液的制作:
精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min(不时摇动)—→取出,
3000rpm离心10min(或过滤)—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形
瓶中—→再从中取出1ml,再定容到10ml的容量瓶中
样品液的测定:
(1)取4支试管,按照表2加样(加蒽酮时需要冰水浴5min冷却)
表2 蒽酮比色法定糖——样品的测定
(2)加样冷却完成后置沸水中煮沸10min,取出流水冷却放置10min,620nm处比色测量各管OD值。
(3)以1号试管作为调零管,2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。
3.结果计算:
C×V
w = ————×100%
m,
式中w:糖的质量分数(%)
C:从标准曲线中查出的糖质量分数(mg/ml)
V:样品稀释后的体积(ml)
m:样品的质量(ml)
一 目的 掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法
二 原理 蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖 基及已糖醛酸起反应,反应后溶液呈蓝绿色,在620nm处有最大吸收。
本法多用于测定糖原的含量,也可用于测定葡萄糖的含量。 三 实验器材及试剂 马铃薯干粉
可调试移液器或移液管 可见分光光度计(723型) 电子分析天平 水浴锅 电炉子
蒽酮试剂:取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中,以80%H2SO4定容到1000ml,当日配制使用。
标准葡萄糖溶液(0.1mg/ml):100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中,定容到1000ml备用。 四、操作 1.制作标准曲线
取7支干燥洁净的试管,按表1顺序加入试剂,进行测定。
以吸光度值为纵坐标,各标准溶液浓度(mg/ml )为横坐标作图得标准曲线。 表1 蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作
沸水浴中准确煮沸10min,取出用流水冷却,室温放10min,于620nm处比色 葡萄糖浓度(mg/ml) 2.样品含量的测定 样品液的制作:
精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min(不时摇动)—→取出,
3000rpm离心10min(或过滤)—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形瓶中—→再从中取出1ml,再定容到10ml的容量瓶中
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