WB-自己总结

WB实验步骤

1. 组织样品制备

⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。

⑵裂解后，将裂解液移1.5ml 离心管中，（若有组织残渣可继续冰上振荡30min）；然后4℃、12000rpm离心20min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20 ℃保存（-80℃长期保存）。12000g离心，4℃，2min。

⑶取少量上清进行定量。

⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。 2. 蛋白定量

2.2.1制作标准曲线

（1）从－20℃取出浓度为1μg/μl的BSA（牛血清白蛋白，蛋白标准品），室温融化后，备用，使各个孔的终体积为20ul。 BSA浓度（μg/μl） 0 BSA(μl) PBS(μl) BSA含量(μg) 0 20 0 0.025 1 19 0.5 0.050 2 18 1 0.100 4 16 2 0.200 8 12 4 0.300 12 8 6 0.400 16 4 8 0.500 20 0 10 （2）根据样品数量（每样200μL），按50体积BCA试剂A+1体积BCA试剂B（50:1）配制适量 BCA工作液，充分混匀（刚开始混合时可能会有浑浊，但混匀后浑浊就会消失，BCA 工作液在室温 24 小时内稳定）；

（3）向各孔中各加200μl BCA工作液；

（4）迅速把酶标板放在震荡器上震荡30s混匀，然后37℃孵箱孵育30min，然后在 562nm 下比色测定，以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线； 2.2.2蛋白样品测定

（1）首先将样品做一定比例稀释（最好测定前多做几个梯度，一开始可稀释10倍：Protein/PBS=2/18μL），以确定好最佳样品浓度；

（2）将稀释好的样品加入到96 孔板中，使样品稀释液总体积为20μL，每个浓度重复2-3次；

（3）加入BCA工作液200μL，充分混匀，37℃孵箱孵育30分钟（注：若使用温箱孵育时，应注意防止水分蒸发）；

（4）以标准曲线0号管做参比，用酶标仪测定562nm处的吸光度值；（注：由于移液器在取小量时的误差较大，标准线前面的点可能不是很准确，所以尽可能的让样品点落在标准曲线的后 1/2部分）；

（5）根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品

稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。 3. 蛋白样品上样前处理

（1）首先，调整蛋白样品的浓度，使各个实验组、空白组和Model组蛋白浓度保持一致，并使其在后续的上样中，每孔样品所含的蛋白总抽提物在20-40μg左右； （2）蛋白变性：5×SDS上样缓冲液20μL+1M二硫苏糖醇（DTT）10μL+适量纯水统一成浓度为1 μg/μL的蛋白样品混匀；

（3）样品混匀后，PCR仪上98℃变性5min（或70℃加热5-10min），简短离心，取上清，-20℃短期或-70℃长期保存。 3蛋白电泳

3.1制胶（聚丙酰胺凝胶，PAGE胶）

聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE胶是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，聚合需加入过硫酸铵及 DMAP 或 TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量（%T)）和交联度（%C），T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%，其中: a=双体(bis)的重量；b=单体(arc)的重量；m=溶液的体积(ml)。丙烯酰胺总量增加，则孔径减小，

5%C构成最小的孔径，任何的%C增加或降低，孔径都增加，凝胶的百分浓度组成需两个参数，丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).的总量百分浓度（w/v）。

不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表），原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。

蛋白分子量(kDa) 4-40 12-45 10-70 15-100 25-200 凝胶浓度(%) 20 15 12.5 10 8 （1）玻璃板蘸洗洁精轻轻擦洗，用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里烘箱烘干；

（2）玻璃板对齐后放入夹中卡紧，卡在架子上准备灌胶（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶）。

（3）分离胶（10％） 超纯水 30％Acr/Bic 1.5 mol/L Tris ·HCl（pH8.8） 10％SDS 10%AP（过硫酸胺） TEMED 1块 3.08ml 2.475ml 1.875ml 75μl 37.5μl 3.75μl 2块 6.16ml 4.95ml 3.75ml 150μl 75 μl 7.5 μl a、加 TEMED 后立即混匀灌胶：快速在右上角斜灌（注：可用10ml枪吸取5ml 胶沿玻璃放出。最后几滴不注入以免产生气泡），使胶面与把手齐平。

b、灌胶后立即加水，枪平放，快速均匀缓慢注水（注：灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度；操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡；加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型）。

c、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固，就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

（4）浓缩胶（4％）

试剂用量

H2O 2.7mL 30?r/Bis 0.67mL 1.5MTris/HCl(PH 8.8) 0.5mL 10%SDS 0.04mL 10% APS 0.04mL TEMED 0.004mL

浓缩胶配好后迅速沿右上角灌封，迅速插入梳子（水洗晾干），水平插入后等1h（注：由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出）。 3.2电泳

（1）给灌好的胶上方梳子部分冲少量双蒸水，然后双手对称轻轻将梳子拔出，再用蒸馏水冲洗梳孔，将孔内水分排净。将夹子松开取出玻璃板放入电泳槽中（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外；若只跑一块胶，另一边需垫塑料板）。先向两块板间注入1 ×电泳液至玻板上缘，然后电泳液在外盒亦加1/4；

（2）测完样品蛋白含量后，计算含20-40μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入 5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×SDS（注：上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加30μl 样品）；

（3）样品混匀后PCR仪95℃加热5min，迅速冰上冷却，4℃ 12000r×30s 瞬时离心； （4）上样：用微量进样器吸取样品，插入加样孔缓慢加入，防止样品溢出（加下一样品前在电泳液中洗涤3 次，防止交叉污染）；

注：a、插入加样孔缓慢加入，防止样品溢出；加下一样品前在电泳液中洗涤3次，防止交叉污染；

b、样品体积＝（20-40μg）/蛋白浓度，不足部分以裂解液补充； c、显影Marker（红色）2μl +3μl（5×上样buffer）；

（5）电泳：盖好电极盖(红-红，黑-黑)，设置为恒压80V，电泳约 30min，各样本跑至积层胶末端（浓缩胶和分离胶的分界面）后，调节电压至160V，继续电泳约90min，待

溴酚蓝前沿距电泳槽底部1cm时，停止电泳。 2.5 转膜 2.5.1 准备

（1）转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸+1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜；

注：a、切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜；

b、将切好的硝酸纤维素膜置于纯水浸2h才可使用，操作方法是：用镊子捏住

膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触，这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿，若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水）；

（2）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜；

（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动）； 2.5.2转膜

（1）裁剪12张同等大小的转膜专用滤纸和4张纱布：将①2张纱布、②4张滤纸浸泡于PH10.4的Anode bufferⅠ中；将③2张滤纸浸泡于PH10.4的Anode bufferⅡ中；将④6张滤纸和⑤2张纱布浸泡于PH9.4的Gathode buffer中；将凝胶从电泳槽内取出，切割至合适大小并剪角标识，先浸泡纯水10秒，再浸泡在PH9.4冰冷的Gathode buffer中孵育5min；将PVDF膜，先放入20%甲醇中浸泡活化1-2min，再于冰冷的电转液中浸泡至少5min；

（2）切胶：要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬，撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很易裂）。 除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。

（3）按照以下顺序：正极板、纱布①×1张、滤纸②×2张、滤纸③×1张、PVDF膜（剪角标识）、凝胶、滤纸④×3张、纱布⑤×1张、负极板，整齐叠放，小心清除叠层中的气泡；

（4）将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用 60V 转移2 h或40V 转移3 h（注：视

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