WB-自己总结

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WB实验步骤

1. 组织样品制备

⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液,肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温,快速匀浆。

⑵裂解后,将裂解液移1.5ml 离心管中,(若有组织残渣可继续冰上振荡30min);然后4℃、12000rpm离心20min,取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20 ℃保存(-80℃长期保存)。12000g离心,4℃,2min。

⑶取少量上清进行定量。

⑷将所有蛋白样品调至等浓度,充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好,剩余溶液(溶于1×loading buffer)可以低温储存,-70℃一个月,-20℃一周,4℃ 1~2天,每次上样前98℃,3min。 2. 蛋白定量

2.2.1制作标准曲线

(1)从-20℃取出浓度为1μg/μl的BSA(牛血清白蛋白,蛋白标准品),室温融化后,备用,使各个孔的终体积为20ul。 BSA浓度(μg/μl) 0 BSA(μl) PBS(μl) BSA含量(μg) 0 20 0 0.025 1 19 0.5 0.050 2 18 1 0.100 4 16 2 0.200 8 12 4 0.300 12 8 6 0.400 16 4 8 0.500 20 0 10 (2)根据样品数量(每样200μL),按50体积BCA试剂A+1体积BCA试剂B(50:1)配制适量 BCA工作液,充分混匀(刚开始混合时可能会有浑浊,但混匀后浑浊就会消失,BCA 工作液在室温 24 小时内稳定);

(3)向各孔中各加200μl BCA工作液;

(4)迅速把酶标板放在震荡器上震荡30s混匀,然后37℃孵箱孵育30min,然后在 562nm 下比色测定,以蛋白含量(μg)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线; 2.2.2蛋白样品测定

(1)首先将样品做一定比例稀释(最好测定前多做几个梯度,一开始可稀释10倍:Protein/PBS=2/18μL),以确定好最佳样品浓度;

(2)将稀释好的样品加入到96 孔板中,使样品稀释液总体积为20μL,每个浓度重复2-3次;

(3)加入BCA工作液200μL,充分混匀,37℃孵箱孵育30分钟(注:若使用温箱孵育时,应注意防止水分蒸发);

(4)以标准曲线0号管做参比,用酶标仪测定562nm处的吸光度值;(注:由于移液器在取小量时的误差较大,标准线前面的点可能不是很准确,所以尽可能的让样品点落在标准曲线的后 1/2部分);

(5)根据所测样品的吸光值,在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量(μg),除以样品

稀释液总体积(20μL),乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位:μg/μL)。 3. 蛋白样品上样前处理

(1)首先,调整蛋白样品的浓度,使各个实验组、空白组和Model组蛋白浓度保持一致,并使其在后续的上样中,每孔样品所含的蛋白总抽提物在20-40μg左右; (2)蛋白变性:5×SDS上样缓冲液20μL+1M二硫苏糖醇(DTT)10μL+适量纯水统一成浓度为1 μg/μL的蛋白样品混匀;

(3)样品混匀后,PCR仪上98℃变性5min(或70℃加热5-10min),简短离心,取上清,-20℃短期或-70℃长期保存。 3蛋白电泳

3.1制胶(聚丙酰胺凝胶,PAGE胶)

聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白,PAGE胶是由两种化合物聚合而成的,即丙烯酰胺(acr)和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis),聚合需加入过硫酸铵及 DMAP 或 TEMED,凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量(%T))和交联度(%C),T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%,其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)。丙烯酰胺总量增加,则孔径减小,

5%C构成最小的孔径,任何的%C增加或降低,孔径都增加,凝胶的百分浓度组成需两个参数,丙烯酰胺(acr)和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).的总量百分浓度(w/v)。

不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度(参考下表),原则上高分子量蛋白用低浓度胶,低分子量蛋白用高浓度胶分离。

蛋白分子量(kDa) 4-40 12-45 10-70 15-100 25-200 凝胶浓度(%) 20 15 12.5 10 8 (1)玻璃板蘸洗洁精轻轻擦洗,用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里烘箱烘干;

(2)玻璃板对齐后放入夹中卡紧,卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶)。

(3)分离胶(10%) 超纯水 30%Acr/Bic 1.5 mol/L Tris ·HCl(pH8.8) 10%SDS 10%AP(过硫酸胺) TEMED 1块 3.08ml 2.475ml 1.875ml 75μl 37.5μl 3.75μl 2块 6.16ml 4.95ml 3.75ml 150μl 75 μl 7.5 μl a、加 TEMED 后立即混匀灌胶:快速在右上角斜灌(注:可用10ml枪吸取5ml 胶沿玻璃放出。最后几滴不注入以免产生气泡),使胶面与把手齐平。

b、灌胶后立即加水,枪平放,快速均匀缓慢注水(注:灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速度;操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡;加水液封时要很慢,否则胶会被冲变型)。

c、当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固,就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

(4)浓缩胶(4%)

试剂用量

H2O 2.7mL 30?r/Bis 0.67mL 1.5MTris/HCl(PH 8.8) 0.5mL 10%SDS 0.04mL 10% APS 0.04mL TEMED 0.004mL

浓缩胶配好后迅速沿右上角灌封,迅速插入梳子(水洗晾干),水平插入后等1h(注:由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出)。 3.2电泳

(1)给灌好的胶上方梳子部分冲少量双蒸水,然后双手对称轻轻将梳子拔出,再用蒸馏水冲洗梳孔,将孔内水分排净。将夹子松开取出玻璃板放入电泳槽中(小玻璃板面向内,大玻璃板面向外;若只跑一块胶,另一边需垫塑料板)。先向两块板间注入1 ×电泳液至玻板上缘,然后电泳液在外盒亦加1/4;

(2)测完样品蛋白含量后,计算含20-40μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中,加入 5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×SDS(注:上样总体积一般不超过15μl,加样孔的最大限度可加30μl 样品);

(3)样品混匀后PCR仪95℃加热5min,迅速冰上冷却,4℃ 12000r×30s 瞬时离心; (4)上样:用微量进样器吸取样品,插入加样孔缓慢加入,防止样品溢出(加下一样品前在电泳液中洗涤3 次,防止交叉污染);

注:a、插入加样孔缓慢加入,防止样品溢出;加下一样品前在电泳液中洗涤3次,防止交叉污染;

b、样品体积=(20-40μg)/蛋白浓度,不足部分以裂解液补充; c、显影Marker(红色)2μl +3μl(5×上样buffer);

(5)电泳:盖好电极盖(红-红,黑-黑),设置为恒压80V,电泳约 30min,各样本跑至积层胶末端(浓缩胶和分离胶的分界面)后,调节电压至160V,继续电泳约90min,待

溴酚蓝前沿距电泳槽底部1cm时,停止电泳。 2.5 转膜 2.5.1 准备

(1)转一张膜需准备6张7.0~8.3cm的滤纸+1张7.3~8.6cm的硝酸纤维素膜;

注:a、切滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜;

b、将切好的硝酸纤维素膜置于纯水浸2h才可使用,操作方法是:用镊子捏住

膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里,要使膜浮于水上,只有下层才与水接触,这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿,若膜沉入水里,膜与水之间形成一层空气膜,这样会阻止膜吸水);

(2)在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜;

(3)将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动); 2.5.2转膜

(1)裁剪12张同等大小的转膜专用滤纸和4张纱布:将①2张纱布、②4张滤纸浸泡于PH10.4的Anode bufferⅠ中;将③2张滤纸浸泡于PH10.4的Anode bufferⅡ中;将④6张滤纸和⑤2张纱布浸泡于PH9.4的Gathode buffer中;将凝胶从电泳槽内取出,切割至合适大小并剪角标识,先浸泡纯水10秒,再浸泡在PH9.4冰冷的Gathode buffer中孵育5min;将PVDF膜,先放入20%甲醇中浸泡活化1-2min,再于冰冷的电转液中浸泡至少5min;

(2)切胶:要先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬,撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板(撬时一定要小心,玻板很易裂)。 除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上,用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。

(3)按照以下顺序:正极板、纱布①×1张、滤纸②×2张、滤纸③×1张、PVDF膜(剪角标识)、凝胶、滤纸④×3张、纱布⑤×1张、负极板,整齐叠放,小心清除叠层中的气泡;

(4)将夹子放入转移槽中,要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。电转移时会产热,在槽的一边放一块冰来降温。一般用 60V 转移2 h或40V 转移3 h(注:视

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