乳酸脱氢酶酶活力测定

实验六 乳酸脱氢酶酶活力测定 及紫外吸收法测定蛋白质含量

目的要求

(1) 掌握LDH活性测定原理；

(2) 学习用比色法测定酶活性的方法。

实验原理

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH，EC.1.1.1.27, L－乳酸：NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。

LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为

简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值得改变，定量测定酶的含量。本实验测定LDH活力，基质液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下，加入一定量酶液，观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中LDH单位。定量测定蛋白质含量即可计算比活力（U/mg）。

利用上述原理，改变不同第五则可测定相应脱氢酶反应过程中A340nm的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油－3－3磷酸脱氢酶等，适用范围很广。

试剂和器材

一、试剂

50m mol/L pH6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液母液：

A: 50 m mol/L K2HPO4: 称K2HPO41.74g加蒸馏水溶解后定容至200ml。 B: 50 m mol/L KH2PO4: 称KH2PO43.40g加蒸馏水溶解后定容至500ml。 取溶液A 31.5ml ＋ 溶液B 68.5ml, 调节pH至6.5。置4℃冰箱备用。

10m mol/L pH 6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液用上述母液稀释得到。现用现配。 0.1mol/L pH 7.5磷酸盐缓冲液, 用上述母液稀释得到。现用现配。

NADH溶液：称3.5mg纯NADH置试管中，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液1ml 摇匀。现用现配。

丙酮酸溶液：称2.5mg丙酮酸钠，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液29ml, 使其完全溶解。现用现配试剂。

二、 材料

动物肌肉、肝、心、肾等组织。

三、 器材

组织捣碎机，紫外分光光度计，恒温水浴，移液管(5ml, 0.1ml), 微量注射器（10ul）。

操作方法

一、 制备肌肉匀浆

称取20g 兔肉, 按W/V=1/4比例加入4℃预冷的10m mol/L Ph6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液，用组织捣碎机捣碎，每次10s，连续3次。将匀浆液倒入烧杯中，置4℃冰箱中提取过夜，过滤后得到组织提取液。

二、 LDH活力测定

试验时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。取2只石英比色杯，在1只比色杯中加入0.1m mol/L pH 7.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液3ml，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零；另一只比色杯用于测定LDH活力，依次加入丙酮酸钠溶液2.9ml, NADH溶液0.1ml，加盖摇匀后，测定340 nm光吸收值（A）。取出比色杯加入经稀释的酶液10μl，立即计时，摇匀后，每隔0.5min 测A340nm，连续测定3min，以 A对时间作图，取反应最初线性部分，计算A340nm/min减少值。加入酶液的稀释度（或加入量）应控制 A340nm/min下降值在0.1－0.2之间。

三、 数据处理

计算每毫升组织提取液中LDH活力单位

LDH活力单位（U）/ml 提取液 ＝（A340nm/min?稀释倍数）/ （酶液加入量（10μl）?10-1

提取液中LDH总活力单位＝LDH活力（U）/ml ? 总体积

注意事项

（1）实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，则应贮存在－20℃冰箱。

（2）酶液的稀释度及加入量应控制A340nm/min下降值在0.1－0.2之间，以减少实验误差。 （3）NADH溶液应在临用前配制。 思考题：

1. 简述用紫外分光光度法测定以NAD+为辅酶的各种脱氢酶测定原理。

实验之二：紫外吸收法测定蛋白质含量

实验原理

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。

此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。

此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。

一 、试剂：

[1] 标准蛋白质溶液：任选一种。

（1）牛血清清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配制成浓度为1毫克/毫升（mg/mL）的溶液。

（2）卵清蛋白质溶液：将约1克卵清溶于100毫升0.9%氯化钠溶液中，离心，取上清液，按微量凯氏定氮法测其蛋白质含量，用0.9%氯化钠溶液稀释至蛋白浓度为1毫克/毫升。

[2] 待测蛋白质溶液：浓度为1毫克/毫升左右的溶液。

二、器材：

[1] 紫外分光光度计 [2] 吸量管 [3] 试管和试管架

操作方法

下面介绍四种紫外吸收法： 1. 280nm的光吸收法

因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。

测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。 许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1

1cm）有文献数据可查，根据此光

％

吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A11cm）值（即蛋白质溶

％

液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1吸收系数。

蛋白质浓度 = (A280?10 )/ A1 (? 1%浓度?10mg/ml)

例：牛血清清蛋白 ： A1

溶菌酶 ： A1

若查不到待测蛋白质的A1

％

％％

％

％

1cm,λ

称为百分吸收系数或比

1cm,280nm (mg/ml)

1cm=6.3 (280nm)

1cm=22.8 (280nm)

1cm

值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量

相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。 标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂： 管号 BSA（1.0mg/ml） H2O A280

用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1 2. 280nm和260nm的吸收差法

核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：

纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 ? 1.8

纯核酸的光吸收比值： A280/A260 ? 0.5

含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。

蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)

％

1 0 5.0 2 1.0 4.0 3 2.0 3.0 4 3.0 2.0 5 4.0 1.0 6 5.0 0 1cm,280nm

此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。 3. 215nm与225nm的吸收差法

蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。

用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 ?g/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：

吸收差?= A215 －A225

以吸收差?为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。

本方法在蛋白质浓度20~100?g/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）

2SO4以及

0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙

酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。 4. 肽键测定法

蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500?g/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。

进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。

本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。

思考题

1、本法与其他实验测定蛋白质含量法相比，有何缺点及优点？ 2、若样品中含有核酸类杂质，应如何校正实验结果？

参考文献

1、Boyer, Rodney F. Modern experimental biochemistry 1986, 55-59页 2、蔡武成、袁厚积主编：生物物质常用化学分析法，1982年，93~99页 3、张龙翔、张庭芳、李令媛等编著，生化实验方法和技术，1981年，164~169 页，高等教育出版社

4、Bradford M.Anal Biochem ,72,248(1976)

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/4uef.html