外周血细胞染色体培养操作

实验六 人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备

实验目的

1、了解人体外周血淋巴细胞短期培养的原理及方法。 2、初步掌握人外周血淋巴染色体的制备技术。 实验用品

1、器材：超净工作台（或无菌接种箱）、光学显微镜（附照相装置）、隔水式恒温培养箱、干燥箱、水平式离心机、冰箱、恒温水浴箱、高压蒸气消毒锅、真空泵（或电动吸引器）、10ml刻度离心管、10ml培养瓶（可用环磷酰胺药瓶代）、2ml注射器、吸管、滴管、试管架、三角烧瓶、染色缸、酒精灯、各种试剂瓶、载玻片、镊子、吸水纸、洗耳球、搪瓷盘、铝制饭盒、消毒用酒精棉球与碘酒棉球等。

2、材料：人外周血

3、试剂：RPMI l640培养液（含10~20％小牛血清）、碳酸氢钠（AR）、PHA、青霉素、链霉素、肝素、5％NaHCO3溶液、1mol／L HCl、三蒸水或双蒸水、0.075 mol／L KCl、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液，pH6.8的磷酸缓冲液。

实验原理

据测定，健康成年人体内的淋巴细胞总数约有500×109，其中约有2％在外周血中循环。在外周血的淋巴细胞中，以小淋巴细胞为主（每毫升血中的含量可达1~3×106个）。在通常情况下，它们都处于间期的G0或G1期，所以很难见到正在分裂的淋巴细胞。但是，Nowell（1960）发现，从芸豆（phaseolus vulgaris）中提取的能使红细胞凝集的物质一植物血球凝集素（phytohemagglutinin，PHA）可以刺激淋巴细胞进行有丝分裂。在PHA的作用下，处在G0期的淋巴细胞可转化成淋巴母细胞，重新进入增殖周期进行有丝分裂，当体外培养至72小时左右时，大多数淋巴细胞已处于第二增殖周期内，此时用有丝分裂的阻断剂秋水仙素（colchicine）处理细胞可使正在分裂的细胞都停止在中期，再经低渗、固定等处理，便可得到较多可供分析的中期染色体。

以外周血为材料制备淋巴细胞染色体标本具有取材方便，用血量少（0.3～1.0ml即可），培养简单等优点，故该方法在临床上已得到广泛的应用。

内容与方法

一、器材的清洗

1、培养用瓶的清洗；将培养瓶放入肥皂水中煮沸30分钟，并趁热刷洗瓶内，然后用自来水将皂液冲净，干后置硫酸一重铬酸钾洗液中浸泡24小时左右，从洗液中取出的小瓶立即用自来水充分冲洗15次，接着用蒸馏水冲洗5次，双蒸水冲洗3次，然后将小瓶倒立在铝饭盒中，置于烤箱将其烤干，最后盖上饭盒盖放入高压蒸气消毒锅中灭菌。其它玻璃器皿的清洗消毒与上述操作基本相同． 2、玻璃除菌滤器的清洗；新购置的玻璃除菌滤器先用肥皂水刷洗并用自来水冲洗干净；再将滤器安置在抽滤瓶上，倒满浓硫酸后进行抽滤，使浓硫酸全部通过滤板，然后用蒸馏水多次抽滤，使残留的酸全部除去，再用双蒸水滤过两次，置110℃烤箱中2小时（温度不要过高；以免使玻璃析出碱性物质）；取出后用牛皮纸包扎出入口置高压蒸气消毒锅中灭菌。抽滤过不含血清的培养液的滤器可直接用蒸馏水抽滤洗涤。但抽滤过血清或PHA的滤器必须用浓硫酸浸泡一天（将滤器中盛满浓硫酸，不加负压）后，再将剩余的硫酸抽完，然后用蒸馏水彻底冲洗。

3、橡胶瓶盖的清洗：橡皮塞清洗较简单；可直接放入肥皂水中煮沸30分钟，然后用自来水充分冲洗， 再用蒸溜水煮沸30分钟，取出后用蒸馏水、双蒸水、各冲洗两次，放入100℃烤箱中烘干，置饭盒中；高压灭菌备用。

4、载波片的清洗：新载玻片先用肥皂水逐一洗一遍，用自来水彻底冲洗干净，再逐一投入到95％的酒精中浸泡一夜（可在其中长期保存），用前一小时捞出，然后放入蒸馏水中置入冰箱预冷。

二、人微量外周血淋巴细胞培养

1、采血：用2.5ml一次性注射器抽取肝素使用液0.2ml；湿润针管，然后将多余的肝素排除。常规消毒被检查者肘部皮肤，从肘部静脉采血1毫升。 2、接种：在无菌室或超净工作台内按无菌操作将抽得的抗凝血分装于2个含培养液的培养瓶中（可将针头直接插入培养瓶的橡皮塞注入血液0.3～0.5 ml）。轻轻摇匀。

3、培养：将接种了人血的培养瓶放入隔水式恒温培养箱中，37℃培养72小时。

三、染色体标本的制备

l、秋水仙素处理：在收获细胞前3～4小时用lml注射器（装5号针头）加入浓度为5μg／ml的秋水仙素2滴，使培养液中的秋水仙素终浓度为0.05μg／ml。轻轻摇匀，放回培养箱中继续培养3~4小时。

2、终止培养（收获细胞）：取出培养瓶，用吸管将培养物混匀，并移至10ml刻度离心管内，平衡后放入离心机，以1000r／min离心8～10分钟，吸弃上清液。

3、低渗处理：往离心管中加入8ml 预温至37℃ 的0.075mol／L的KCl，用吸管混合均匀，置37℃恒温水浴箱中低渗25～30分钟（精确的低渗时间应自行摸索）

4、固定：

①预固定：低渗处理完成后，加入lml新配制的固定液并混合均匀，放入离心机，以1000r/min离心8～10分钟。吸弃上清液。

②固定：加入8ml固定液，用吸管将沉淀的细胞轻轻混合成细胞悬液，1000r／min离心8～10分钟。吸弃上清液。

③再固定：加入8ml固定液，用吸管轻轻吹打使细胞混匀，1000r／min离心8～10分钟，吸弃上清液。

5、制片：视离心管中沉淀（细胞）的多少加入0.2～0.4 ml左右的固定液，用吸管轻轻混成细胞悬液（混合后固定液呈少许乳白色即表示细胞浓度适当）。用吸管吸取细胞悬液以35cm高的距离滴至冷冻的载玻片上，每片滴2～3滴，立即对准玻片吹一口气以助细胞的分散并立即将玻片在酒精灯火焰上来回过几下（勿全烤干），空气中晾干。

6、染色：如果所制备的标本用于染色体的非显带分析，则将晾干的玻片标本用Giemsa染液（用1份Giemsa原液加9份pH6.8的磷酸缓冲液混合而成）染色5～10分钟。在自来水管下用细水轻轻冲洗晾干。

7、镜检：将所制备人染色体玻片放到显微镜下，先用低倍镜寻找染色体分散良好的中期分裂相转换油镜仔细观察（图6—1）。

图6—1 人染色体的中期分裂相（正常男性）

注意事项

1、培养箱的温度应严格控制在37土0.5℃，为了能精确有效地控温，在普通的隔水式恒温培养箱上可加装一个电子控温仪。

2、培养基的pH值应调整到7.0～7.2之间；偏酸时细胞发育不良，偏碱时细胞会出现轻度固缩。

3、在采血或接种时，注意不要使用太多的肝素，因为肝素过多会抑制淋巴细胞的转化，但也不宜太少，否则出现凝血现象。如果培养物中出现膜状凝块，可轻摇培养瓶使凝块散开。

4、注意盖紧培养瓶口，以免培养过程中培养液的pH值发生较大变化。如果培养液变黄，说明偏酸，此时可加入无菌的2％NaHCO3溶液或另加2～3毫升培养液进行调整。

5、PHA的质与量是人体淋巴细胞培养成败的关键，一般使用量为每毫升培养液200～300微克（市售10毫克安瓿装PHA用2毫升生理盐水稀释，每瓶培养物加0.2～0.3毫升）。由于不同来源和保存时间不同的PHA其效价会有差异，所以，精确的用量应自行摸索。PHA的量也不宜过大，否则会导致红细胞凝集。

6、所用的玻璃器皿都应十分洁净，各种试剂尽量选用分析纯的。 7、配制培养液等溶液所用的双蒸水宜用玻璃蒸馏器制备。

8、离心机最好用水平式的，速度宜用1000～2000r／min，如太高，沉降在管底的细胞团不易打散；太低，分裂相易丢失。如果低渗后离心速度过高，则会使分裂细胞过早破裂，在最后制成的标本中，完整分裂相过少。

9、秋水仙素的处理时间和使用浓度，应随实验的要求而异，若从能得到足够量的中期分裂相考虑，秋水仙素的处理时间宜长些，所用的浓度宜高些；但从能得到较为细长的染色体（分带方便）考虑，处理时间宜短些，所以浓度宜低些。应注意，秋水仙素用量过多或作用时间过长，会导致染色体过分收缩或着丝粒分离，甚至染色体破碎。

10、收获前的所有操作过程应保持高度的无菌概念，严防细菌和病毒的污染。 11、低渗时间的长短关系到染色体分散的好坏。如果低渗处理时间过长，细胞膜过早破裂，导致分裂细胞丢失；如果低渗处理时间不足，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析。所以精确的时间应自行摸索。 12、固定液应现配现用，固定应彻底，吹打要均匀，用力不要过猛，以避免细胞破裂，染色体丢失。制片中如发现染色体分散不佳，可重复固定或延长固定时间。

13、滴片时如玻片冷却不够或有油污会影响细胞和染色体的分散。要使染色体分散良好，还要注意细胞的浓度和滴片的技巧等。

14、、培养失败的常见原因： ① 培养瓶等器材未清洗干净； ② 培养用水不合要求； ③ pH值不合适； ④ 细菌污染； ⑤ PHA质量有问题；

⑥ 细胞免疫水平低下。如所采血液是细胞免疫水平低下患者或长期接受放疗、化疗后的患者的血液。

作业与思考

1、每人制备2～3张人淋巴细胞染色体标本。

2、在该实验中，PHA、秋水仙素有何作用。

3、在该实验中，若低渗不够或低渗过度对实验结果有什么影响？ 4、要制备出质量良好的人淋巴细胞染色体标本，需注意哪些问题？

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