微 生 物 实 验 教 案

微 生 物 实 验 教 案

第一部分 基础性实验

实验一 显微镜油镜的使用和细菌形态的观察

一、实验目的

以染色玻片及活菌为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。 二、显微镜油镜使用的原理

1普通光学显微镜的基本构造

（1）光学部分: 接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。它使检视物放大, 造成物象。（2）机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。2显微镜的放大倍数和分辨率（1）放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数

（2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：

D=λ/2n·sin(α/2 )

式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。

λ：可见光的波长（平均0.55μm） n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 a：镜口角（即入射角）。3油镜使用的原理

油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。三、实验材料

1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、盖玻片、接种环、酒精灯等。 2细菌三种形态的玻片染色标本。

3培养12-18h的枯草芽孢杆菌。四、实验方法与步骤 1染色细菌玻片的油镜观查

（1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 （2）调节光亮度。

（3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。

（4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。

（5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。

（6）绘出所观察到的细菌形态图像。

（7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。

（8）、用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去油镜头上的香柏油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。

2、活菌制片观察

取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养12-18h的枯草芽孢杆菌一小环，在水滴上反复涂抹至菌体充分分散，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分，按照油镜的使用步骤，观察草芽孢杆菌形态，边观察边绘图。 五、实验报告

油镜使用的原理 六、思考题

1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 2使用油镜时，为什么必须用镜头油？

3镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？ 七、实验注意事项

1不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。

2镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。

3观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。

4观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。

5拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 6显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。

实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色

一、实验目的

1学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法及革兰氏染色。 2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、实验原理 1 简单染色的原理

大多数微生物细胞质是带负电荷，简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料。染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。

2 革兰氏染色的原理

革兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁的通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。 三、实验材料

1大肠杆菌24h的斜面培养物。 2葡萄球菌24h的斜面培养物。

3简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）

4革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红） 5载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。 6显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。 四、实验方法和步骤

附表1细菌染色法分类

附表2 微生物染色常用染料

A酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。

B碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。

C中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。 D单纯染色：这类染料物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b）的染料1、简单染色

(1) 涂片:取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。

(2) 干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。 (3) 固定:于火焰上通过2—3次。

(4) 染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色１分钟。

（5）水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。 （6）干燥：空气中自然干燥或在酒精灯高处微微加热。 （7）镜检：在油镜下观察细菌形态。 2革兰氏染色

（1）涂片。

（2）初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。

（3）媒染：先用新配的卢哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。 （4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。 （5）复染：滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。 （6）镜检：观察染色结果。 五、实验报告

1 革兰氏染色的基本原理和意义 2 革兰氏染色成败的关键 六、思考题

1根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？ 2制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？

3做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？

4当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠?

实验三 细菌的鞭毛染色及其运动观察

一、实验目的

1学习并掌握细菌鞭毛染色的基本方法及观察细菌鞭毛的着生情况。 2用压滴法观察细菌的运动 3用悬滴法观察细菌的运动 二、实验原理

鞭毛是细菌的运动“器官”，一般细菌的鞭毛都非常纤细，其直径为0.01-0.02μm，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的沉淀作用，使染料堆积在鞭毛上，以加粗鞭毛的直径，同时使鞭毛着色，

在普通光学显微镜下能够看到。 三、实验材料

1 菌种：普通变形杆菌斜面菌种 2 鞭毛染色液：A液，B液。

3 0.01％的美蓝水溶液、无菌水，凹玻片、载玻片，盖玻片、香柏油、镊子、酒精灯、擦镜纸、二甲苯、吸水纸等。 四、实验方法

(一) 细菌鞭毛染色

1制片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取少许备用的菌苔，最好从菌落的边缘取菌苔，在载玻片的水滴中轻沾几下。将载玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。

2染色：涂片干燥后滴加A液染3-5分钟，用蒸馏水冲洗，或将残水沥干或用B液冲去残水（注意：一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景很脏）。洗净A液滴加B液后，将玻片在酒精灯上稍加热，使其微冒蒸汽且不干，一般染30-60秒钟。然后用蒸馏水冲洗，自然干燥。

3镜检：镜检时，如未见鞭毛，应在整个涂片上多找几个视野，有时只在部分涂片上染出鞭毛。菌体为深褐色，鞭毛为褐色。

注意点：染色成功的关键主要决定于：(a)菌种活化的情况，即要连续移种几次；(b)菌龄要合适，一般在幼龄时鞭毛情况最好，易于染色；(c) 新鲜的染色液。（d）制片时不能加热固定

（二）细菌运动的观察

1 压滴法

(1) 制备菌液：从幼龄普通变形菌斜面上，挑数环菌放入装有1-2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。

(2) 取2-3环稀释菌液于洁净载玻片个央，再加入一环0.01％的美蓝水溶液，混匀。 (3) 用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。

(4) 镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。

2 悬滴法

(1) 取洁净盖玻片，在四周涂少许凡士林。 (2) 在盖玻片中央滴一小滴菌液

(3) 将凹玻片的凹窝向下，使凹窝中心对准盖玻片中央的菌液，轻轻地盖在盖玻片上，使凹玻片与盖玻片粘在一起(注意液滴不得与凹玻片接触)。

(4) 小心将玻片翻转过来，使菌液正好悬在窝的中央。再用火柴棒轻压盖玻片四周使封闭，以防菌液干燥。

(5) 镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到悬滴的边缘后，再将菌液移至视野中央，换用高倍镜观察，注意细菌是如何运动的，它与分子布朗运动的不同。

五、实验结果和报告

1绘出你所观察到的细菌的形态及鞭毛着生情况。 2试描述你所观察的细菌有无运动性，是如何运动的？ 六、思考题

1制片时为什么不能加热固定？

2没有鞭毛的活细菌在光学显微镜下完全不动吗？真实地记录你观察到的现象，并进行解释。

3鞭毛染色的菌种为什么要先连续传几代，并且要采用幼龄菌种? 4根据你的实验体会，哪些因素影响鞭毛染色的效果?如何控制?

5试设计—实验，如何鉴别某种细菌是否能运功，是否有鞭毛，其鞭毛的着生位置。

实验四 细菌的芽孢、荚膜染色

一、实验目的

1掌握细菌的芽孢染色法。

2掌握细菌的荚膜染色法。 二、实验材料

1 枯草芽抱杆菌、褐球固氮菌的斜面菌种。

2 二甲苯、香柏油、蒸馏水、5％孔雀绿水溶液、0.5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)、绘图墨水(用滤纸过滤后备用)、95％乙醇、石炭酸复红染液。

3显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管(1x6.5cm)、烧杯(300mL)、滴管、试管夹、擦镜纸、吸水纸。 三、实验方法和步骤

（一）芽孢染色法 1方法1

(1) 取37℃培养18-24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。 (2) 于载片上滴入3-5滴5％孔雀绿水溶液。

(3) 用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4-5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。 (4) 倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 (5) 用0．5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)复染1min，水洗。 (6) 制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。 2 方法2

(1) 加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环培养18-24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。

(2) 加5％孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。 (3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中，加热15-20min。

(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火3次固定。

(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。

(6)加沙黄水溶液，染2-3min后，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。 (7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。 (二)荚膜染色法 1石炭酸复红染色

（1）取培养了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(不可用火焰烘干)。 (2)滴入1-2滴95％乙醇固定(不可加热固定)。 (3)加石炭酸复红染液染色1-2min，水洗，自然干燥。

(4)在载玻片一端加一滴墨汁，另取一张边缘光滑的载玻片与墨汁接触，涂成均匀的薄层，自然干燥。

(5)干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。2背景染色

（1）先加1滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。 (2)放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的菌液。

(3)干燥后用油镜观察。背景黑色，菌体较暗。在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。 四、实验报告 (一)绘图

1枯草芽孢杆菌的芽孢形态，芽孢的着生位置。 2褐球固氮菌菌体及荚膜的形态。

(二)试制片，但不进行染色，观察是否能看到芽孢和荚膜? 五、问题和思考

1为什么芽孢染色要加热？为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色? 2组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么?

3试设汁实验如何鉴定果一产芽孢菌株的芽孢形态、着生位置及所属分类地位。

实验五 放线菌的形态观察

一、实验目的

1辨认放线菌的基本结构：营养菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子的形态； 2用水封片法、玻璃纸法、印片法观察放线菌的形态特征。 二、实验材料

1细黄链霉菌的平皿培养物，棘孢小单孢菌的玻璃纸平皿培养物。 2 0.1％美蓝染色液、石炭酸复红染色液。

3盖玻片、载玻片、镊子、接种环、显微镜、涂布器、玻璃纸、打孔器。 三、实验方法和步骤

(一) 观察自然生长状态的放线菌

用镊子小心取出用插片法培养的细黄链霉菌皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦干净，然历将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。找出3类菌丝及其分生孢子，注意放线菌的基内曲丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。 (二) 水封片观察

取一滴美蓝染色液置于载玻片中央，将用搭片法培养的棘孢小单孢菌培养皿中的盖玻片取出，并将有菌的面朝下，放在载玻片上，浸在染色液中。制成水封片，

用高倍镜观察其中个分生孢子及其基内菌丝。 （三） 玻璃纸法的镜检观察

1直接玻璃纸观察 分别用细黄链霉菌和棘孢小单孢菌的玻璃纸制片观察。制片时，于载玻片上放一小滴蒸馏水，将含菌玻璃纸片小心剪下一小块，移至载玻片上，并使有菌面向上。在玻璃纸与载玻片间不能有气泡，以免影响观察。将制片于显微镜下观察，先用低倍镜观察菌的立体生长状况、再用高倍镜仔细观察。注意区分黄链霉菌的基内菌丝、气生菌丝和弯曲状或螺旋状的孢子丝。观察棘孢小单孢菌时注意把视野调暗，其基内菌丝纤细发亮，其单个分生孢子发暗，直接生长在基内菌丝长出的小梗上。

2 印片染色法观察 用镊子取洁净载玻片并微微加热，然后用这微热载玻片盖在长有黄链霉菌或棘孢小单孢菌的平皿并轻轻压一下，注意将载玻片垂直放下和取出，以防载玻片水平移动而破坏放线菌的自然形态，反转有印痕的载玻片微微加热固定，用石炭酸复红染色1min，水洗，晾干。用油镜观察。 四、实验结果和报告

l 绘图 玻璃纸法、水封片法、印片法及自然生长状态下观察的； 2 试比较细黄链霉菌与棘孢小单孢菌特征的异同。 五、问题和思考

l 在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝? 2用插片法和搭片法如何制备放线菌标本，其主要优点是什么?

实验六 霉菌的形态观察

一、实验目的

1 掌握微生物载玻片湿室培养方法。 2 曲霉、青霉、根霉、毛霉形态观察。 3 根霉假根的观察。 二、实验材料

1 产黄青霉、黑曲霉、黑根霉、总状毛霉等斜面菌种。

2 半固体PDA培养基、乳酸苯酚固定液、棉蓝染色液、20％甘油。

3 透明胶带、剪刀、培养皿、载玻片、门形玻棒搁架、盖玻片、圆形滤纸片、接种环。

三、实验方法和步骤

(一)霉菌的载玻片湿室培养

1准备湿室：在培养皿底铺一张圆形滤纸片，其上放一“门”形载玻片搁架，在搁架上放一块载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，外用纸包扎。经12l℃湿热灭菌30min后，置60℃烘箱中烘干，备用。

2取菌接种：用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子至湿室内的载玻片上，每张载玻片可接同一菌种的孢子两处。接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可(务必记住接种的位置)。

3 加培养基 用无菌细口滴管吸取少量融化约60℃的培养基，滴加到载玻片的接种处。培养基应滴得圆而薄，其直径约为0.5cm(滴加量一般以1/2小滴为宜)。

4加盖玻片 在培养基未彻底凝固前，用无菌镊子将皿内盖玻片盖在琼脂块薄层上，用镊子轻压。使盖玻片和载玻片间的距离相当接近，但不能压扁．否则不透气。

5 倒保湿剂 每皿倒人约3mL 20％的无菌甘油，使皿内的滤纸完全润滑，以保持皿内湿度。皿盖上注明菌名、组别和接种日期；此为制成的载玻片湿室，置28℃恒温培养3-5天。

(二)黑根霉假根的培养

将融化的PDA培养基，冷却至50℃倒入无菌平皿，其量约为半皿高度的1/2、冷凝后，用接种环沾取根霉孢子，在平板表面划线接种。然后将平皿倒置，在盖内放一无菌载玻片，于28℃培养2-3天后，可见根霉的气生菌丝倒挂成胡须状，有许多菌丝与载玻片接触，并在载玻片上分化出假根和匍匐菌丝等结构。

(三)镜检观察

1 湿室培养霉菌镜检载玻片 从培养16-20h开始，通过连续观察，可了解孢子的萌发、曲丝体的生长分化和子实体的形成过程。将湿室内的载玻片取出，直接置于低倍镜和高倍镜下观察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形态，重点观察菌丝是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特点，曲霉的足细胞，根霉和毛霉的孢子囊和泡囊孢子。

2 粘片观察 取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物取菌体，粘面朝下，放在染液上。镜检。

3假根观察 将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。只要用低倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。

4制成永久装片 把观察到霉菌形态较清晰，完整的片子，制成标本作较长期保存。制备方法是，轻轻揭去盖玻片，如果载玻片上有琼脂，仔细挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，盖上清洁盖玻片，在盖玻片四周滴加树胶封固。 四、实验结果和报告

绘制并标注镜几种霉菌镜检形态图 五、问题和思考

1 什么叫载玻片湿室培养，它适用于观察怎样的微生物，有何优点?

哚试剂后切勿摇动试管以免破坏乙醚层而影响结果。

4在糖发酵试验的培养管中装入倒置杜氏小管时，注意防止小管内有残留气泡。灭菌时适当延长煮沸时间可除去管内气泡。

实验九 培养基的配制

一、实验目的

1学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤 2学会实验室灭菌锅的使用方法 二、实验材料

1牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4.·7H2O。 2试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布。 3 灭菌锅 三、实验方法

(一)牛肉膏蛋白胨培养基的配制

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：

牛肉膏3g，蛋白胨10g．NaCl5g，琼脂15-20g，水1000mL，pH7.4-7.6。 1称药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

2加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。

3调PH：检测培养基的PH，若pH偏酸，可滴加1滴1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。

4过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。

5分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。

分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/4为宜，灭菌后垂直待凝。 6加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通汽的作用。要使棉塞总长约3／5塞人试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。

7包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

8灭菌：将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放人冰箱内暂存。

9摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜度的长度不超过试管总长度的1/2。

10无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24-48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱清洁的橱内，备用。 (二) 高氏1号培养基的配制

高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下： 可溶性淀粉20g，KNO31g、NaCl 0.5g、K2HPO4.3H2O0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4.7H2O0.01g，琼脂l5-20g，水1000ml，pH 7.4-7.6。

1 称量和溶解：先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

2 PH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 (三)马丁氏培养基的配制

马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：

K2HPO4.3H2O1g、MgSO4·7H2O0.5g、蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂15-20g，水1000ml，自然pH。

1称量和溶解：先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需要的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1％的水溶液，

在1000ml培养液中加人以上孟加抗红溶液3.3ml，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

2分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋自胨培养基配制。

3链霉素的加入：链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1％的溶液(配好的链霉素溶液保存扩-20℃)，在100mL培养基中加1％链霉素0.3mL，使每毫升培养基中含链霉素30ug。 四、实验结果和报告

记录本实验配制培养第的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。 五、问题和思考

1配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?

2培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？如何进行无菌检查，

3试设计实验对饮料进行无菌检查。 六、演示

1培养基的分装方法。 2试管斜面的搁置方法 七、注意事项

称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调PH时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。

实验十 土壤的稀释、分离、纯化及无菌操作技术

一、实验目的和内容

1学习从上壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。 2用稀释法分离细菌、放线茵和霉菌。 3用平板划线法分离微生物。

4学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。 二、实验材料

1金黄色葡萄球菌和普通变形菌斜面菌种。

2已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶。

3无菌培养皿12套、无菌EP管10支、土壤样品、天平、称量纸、药匙、试管架、记号笔、涂布器、1000ul移液器、200ul移液器、20ul移液器、1000ul枪头、200ul枪头、20ul枪头。

4无菌水(49.5mL、带玻璃珠) 1瓶、80％乳酸、10％酚液、95％乙醇。

三、实验方法 (一)土壤稀释分离

1取土壤：取表层以下5-10ml处的土样．放入灭菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。 2制备稀释液

(1)制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒人带玻璃珠的无菌水瓶中，振荡5-10min,使土壤充分打散，即成为10-2的土壤悬液。

(2)梯度稀释：用移液器吸10-2的土壤悬液100ul，放入装有900ul无菌水的EP管中，上下颠倒数次，即为10-3的稀释液，如此重复，可依次制成10-3-10-8的稀释液。 注意：每一个稀释度换用一支枪头。 3混菌法测定菌落数的方法

(1)细菌：取10-7、10-6两管稀释液各400ul，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒人以上培养皿中(装量以铺满皿底的2／3为宜)，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿平皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。倒平板时要注意无菌操作。 (2)放线菌：取10-5、10-4两管稀释液，在每管中加入10％酚液50ul，摇匀，静置片到，然后分别从两管中吸出400ul加入相应标号的平皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。

(3)霉菌：取10-2、10-3两管稀释液各400ul，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释险接两个平皿。在熔好的土豆蔗糖培养基中，每1000ul加入灭菌的乳酸10ul，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板。

4培养：将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28-30℃中温培养，细菌培养1-2d，放线菌培养5-7d，霉菌培养3-5d。可用于观察菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。 (二)平板划线分离微生物

1倒平板：按无菌操作要求，在火焰旁操作，取融化并冷却至不烫手的固体培养基(约50℃)，倒入无菌培养皿中，倒量以铺满皿底为限，平放桌上待其充分凝固，备用。

2划线分离：使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落。 3培养：方法同“土壤稀释分离” (三)斜面接种和穿刺接种 1斜面接种

（1）取新鲜斜面固体培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），

然后用无菌操作方法，把持接菌种接入以上新鲜培养基斜面中。

（2）接种的方法是，用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部。注意划线要轻，不可把培养基划破。 (3)接种后30℃恒温培养，细菌培养48h，放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存。 2穿刺接种

(1)取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记(写上菌名、接种日期、接种人等)。分别接入金黄色葡萄球菌和普通变形菌。

(2)接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种．然后从柱状培养基的中心穿入其底部(但不要穿透)、然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动。 (3)接种后30℃恒温培养，24h后观察，比较两种菌的生长结果。 四、实验结果和报告

1记录土壤稀释分离结果，并计算出每克土壤中的细菌、放线曲和霉菌的数量。 计算方法：选择长出菌落数30-300之间的培养皿进行计数，技以下公式： 总个数／g＝同一稀释度几次重复的菌落平均数x稀释倍数 2分别记录平板划线、斜面接种的结果，并自我评价。 3比较两种细雨穿刺按种的结果，并进行分析。 五、问题和思考

1在测定土壤微生物含量中，除混菌法外还可用什么方法? 2试设计实验，从土壤中分离出酵母菌，并进行计数。

3试设计实验，从水或者空气中分离微生物，并进行计数。六、注意事项 1一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。

2在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。 3放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。

实验十一 厌氧微生物的培养

一、实验目的

1 学习培养厌氧微生物的方法，了解厌氧微生物生长的特性。 2 掌握深层穿刺法厌氧培养丙酮丁醇梭菌的操作。 3掌握厌氧法培养丙酮丁醇梭菌及产气荚膜梭菌。 二、实验材料

1丙酮丁醇梭菌、产气荚膜梭菌。

2 RCM培养基(即强化梭菌培养基)、TYA培养基、玉米醪培养基、中性红培养基、明胶麦芽汁培养基。CaCO3，焦性没食子酸(即邻苯三酚)、Na2CO3，10％NaOH溶液，0.5％美蓝水溶液，6％葡萄糖水溶液，钯粒(A型)，NaBH4，K BH4，Na2HCO3，柠檬酸。

3 带塞或塑料帽玻璃管(直径18-20mm，长180-200mm)，100mL和250mL血浆瓶，20m1和50mL针筒，250mL三角瓶，试管，厌氧罐，厌氧袋(不透气的无毒复合适明薄膜塑料袋，14cmx32cm)，培养皿，真空泵，带活塞干燥器，氮气钢瓶。 三、实验方法和步骤 （一）深层穿刺厌氧培养法

此法操作简单，适用于一般厌氧微生物的活化和分离培养，但不能用于扩大培养。 1接种培养：将玻璃管一头塞上橡胶塞，装入培养基(RCM或TYA培养基)的高度为管长的2/3，套上塑料帽或橡皮塞，灭菌并凝固后，将丙酮丁醇梭菌用接种针穿刺接种，置37℃恒温箱中培养6-7d。

2 观察结果：观察菌落形态特征并制片，于显微镜下观察菌体的细胞形态，并记录结果。

(二)针筒厌氧培养法

此法适于活化厌氧菌和小体积的扩大培养。

1培养基制备：将灭菌的装合RCM或TYA培养基的血浆瓶放在沸水浴中加热10min，在瓶口胶塞上插上2枚针头排气，以赶出残留在培养基内的氧气。随后将血浆瓶从沸水浴中取出，再用氮气钢瓶中的高纯氮气(99.99％)通过胶塞上的一枚针头引入血浆瓶中，使血浆瓶内充满氮气，瓶内培养基在冷却过程中保持无氧状态。 2针筒装灌培养基：将灭菌的针筒接上针头经胶塞刺入血浆瓶中，先利用瓶内氮气的压力将针筒的推杆慢慢推开，待吸入一定体积的氮气后取下针筒，排尽针筒内的气体，按此重复操作3次，以排尽针筒内的残留空气而维持无氧状态。使血浆瓶口朝下倾斜，利用瓶内压力将培养液缓慢灌入针筒内，然后取下针筒，用经灭菌的带孔橡皮塞迅速把针筒头部塞住。

3接种培养：采用无菌操作以菌种液针筒将菌穿刺接入培养液针筒中，置37℃恒培养，用于菌种活化可培养16-18h，用于测定菌体生长可培养6-7d。 4观察结果：取菌制片观察。 四、实验结果和报告

1实验中选用厌氧培养法的培养结果。

2试比较以上厌氧培养方法的优缺点，并分析其成功的关键。 五、问题和思考

1请设计一个试验方案，如何从土壤中分离、纯化和培养出厌氧菌。

2试举例说明研究厌氧菌的实际意义。 六、注意事项

1培养需要CO2的厌氧菌时，须在厌氧小环境中供应CO2。

2选用干燥器、针筒、厌氧罐或厌氧袋时，应事先仔细检查其密封性能，以防漏气。 3已制备灭菌的培养基在接种前应在沸水浴中煮沸10min，以消除溶解在培养基中的氧气。

4针筒培养液刃天青指示剂出现红色，表明有残留氧气。厌氧袋和厌氧罐中美蓝厌氧度指示剂变成蓝色，表明除氧不够。

5产气荚膜梭菌为条件致病菌，防止进入口中和沾上伤口。

实验十二 环境条件对微生物生长的影响

一、实验目的

1了解营养元素的种类及含量对微生物生长的影响。

2了解氧气、温度、pH、盐等环境因素对微生物生长的影响。

二、实验原理

环境条件会影响微生物的生长，不同的微生物在生长时需要不同的环境条件。微生物按其对环境条件的需求可以分为好氧、厌氧微生物、嗜酸碱／中性微生物和中温／耐高温／耐低温微生物等多种类型。温度、酸碱度可以影响微生物细胞的稳定性及催化反应的酶的活性，从而影响微生物的活力和生长状况。微生物生长对渗透压也有要求，除了一些嗜盐微生物需要在有高浓度的盐存在的条件下才能生存外，一般微生物都只能在一定的盐浓度下生长。对好氧微生物来讲，氧气作为呼吸电子传递链的末端电子受体，是其生长所必须的。但对厌氧微生物来讲，由于氧的存在会使其体内产生具有破坏作用的自由基，氧气对这些微生物是一种有毒物质。因此，对于一个给定微生物必须通过多种试验来确定其最佳的生长条件。 三、实验材料

1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐杆菌。

2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、无碳无氮基础盐培养基、淀粉、葡萄糖、硫酸铵、硝酸钾。

3、仪器设备：721分光光度计、可控温摇床。 四、实验方法和步骤

（一）环境条件对微生物生长的影响 1通气条件对微生物生长的影响

（1）将牛肉膏蛋白胨液体培养基分装至250ml的三角瓶中，分装成30ml、50ml、100ml、

150ml和180ml装液量，共5瓶，121℃灭菌30min备用。

（2）将大肠杆菌按5%的接种量（种子液预先培养）接种上述培养基。 （3）将接种好的三角瓶置于200r/min的37℃摇床上培养8h。

（4）从不同装液量的摇瓶中取样，用721分光光度计测定其OD600的值，根据其浊度的大小可以判断微生物的生长情况，从而确定大肠杆菌在好氧培养时对氧气的需要量。 2 温度条件对微生物生长的影响

（1）将牛肉膏蛋白胨液体培养基分装至试管中，4ml／管，共12管，121℃灭菌30min备用。

（2）将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐杆菌按1%接种量接种液体试管培养基，每个菌种接种4管，分别标上20℃、28℃、37℃、45℃标记。

（3）按标记，将各试管置于相应温度的摇床中培养20h，转速为180r/min。

(4) 取出观察各菌的生长情况，并测OD600的值，确定每种微生物生长的最佳生长温度。 3 pH对微生物生长的影响

（1）将牛肉膏蛋白胨液体培养基分装至试管中，4ml／管，共12管，121℃灭菌30min备用。

（2）将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐杆菌按1%接种量接种液体试管培养基，每个菌种接种4管，分别标上pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0标记。

（3）将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐杆菌分别置于37℃、28℃和37℃的摇床中培养20h,转速为180r/min。

（4）取出观察各菌的生长情况，并测OD600，确定每种微生物的最佳生长pH。 （二）微生物的耐盐性

（1）在无碳无氮基础盐培养基中加入葡萄糖和硫酸铵，配置基础盐培养基，并加入NaCl,分别配置终浓度为0.2、0.5、1、2mol/L的含盐培养基。并分装试管。每个浓度梯度配9管，121℃灭菌，备用。灭菌后测pH，保证pH不低于7.0。

（2）将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐杆菌斜面种用生理盐水悬浮，分别按1%的接种量接种至不同盐浓度培养基中。每个梯度3个重复。

（3）将大肠杆菌、枯草的和芽孢杆菌、盐杆菌分别置于37℃、28℃和37℃的摇床中培养20h,转速为180r/min。

（4）取出观察各菌的生长情况，并测OD600，确定每种微生物的最高耐盐能力。 五、实验结果和报告

以柱状图形式记录上述环境因子对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐杆菌的影响。 六、问题与思考

1记录不同条件下大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐杆菌的生长情况。 2试从理论和实践上说明环境条件对微生物的影响。

第二篇 应 用 性 实 验

实验一、乳酸发酵与乳酸菌饮料

一、实验目的

1学习乳酸发酵和制作乳酸菌饮料的方法． 2从新鲜酸乳中进行乳酸菌的分离纯化 3乳酸发酵及检测。 4乳酸菌饮料制作。 5自制乳酸质量品尝。 二、实验材料

1嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌。

2 BCG牛乳培养基、乳酸菌培养基、脱脂乳试管、脱脂乳粉或全脂乳粉、鲜牛奶、蔗糖、碳酸钙。

3恒温水溶锅、酸度计、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶(200-280ml)、培养皿、试管、300mL三角瓶。 三、 实验方法和步骤 (一)乳酸菌的分离纯化

1分离：取市售新鲜酸乳或泡制酸菜的酸液稀释至10-5，取其中的10-4、10-52个稀释度的稀释液各0.1-0.2mL，分别接人BCG牛乳培养基琼脂平板上，用无菌涂布器依次涂布；或者直接用接种环沾取原液平扳划线分离，置40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。

2鉴别：选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8-24h，若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状(两种形状的菌种均分别选入)，革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代4-6次，最终选择出在3-6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。 (二)乳酸发酵及检测

1发酵：在无菌操作下将分离的1株乳酸菌接种于装有300mL乳酸菌培养液的500mL三角瓶中，40-42℃静止培养。

2检测：为了使于测定乳酸发酵情况，实验分2组。一组在接种培养后，每6-8h取样分析，测定PH值；另一组在接种培养24h后每瓶加入CaCO3 (以防止发酵液过酸使菌种死亡)，每6-8h取样，测定乳酸含量，记录测定结果。 (三)乳酸菌饮料的制作

1将脱脂乳和水以1:7-10(W／V)的比例，同时加入5％-6％蔗糖，充分混合，于80-85℃灭菌10-15min，然后冷却至35-40℃，作为制作饮料的培养基质。

2将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种菌的等量混合菌液作为发酵剂，均以2％-5％的接种量分别接人以上培养基质中即为饮料发酵液，亦可以市售鲜酸乳为发酵剂。接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的饮料发酵液重复分装3-5瓶，随后将瓶盖拧紧密封。

3把接种后的酸乳瓶置于40-42℃恒温箱中培养3-4h。培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。然后转入4-5℃的低温下冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中(pH 4-4.5)，凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。

4以品尝为标被评定酸乳质量，采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳，品尝时若出现异昧，表明酸乳污染了杂菌。 四、实验结果和报告

1在BCG牛乳培养基琼脂平板上乳酸菌的黄色菌落典型特征和镜检细胞学特征。 2已发酵的乳酸菌饮料凝乳情况观察。 3乳酸发酵过程、检测结果及结果分析。 4将发酵的酸乳品评结果记录于表中。 五、问题和思考

1发酵酸乳为什么能引起凝乳？

2为什么采用乳酸菌混合发酵的酸乳比单菌发酵的酸乳口感和风味更佳? 3试设计一个从市售鲜酸乳中分离纯化乳酸菌和制作乳酸菌饮料的程序。 六、注意事项

1采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型持征的黄色菌落，结合镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。

2制作乳酸菌饮料，应选用优良的乳酸菌，采用乳酸球菌与乳酸杆菌等量混合发酵，使其具有独特风昧和良好口感。

3牛乳的消毒应掌握适宜温度和时间，防止长时间采用过高温度消毒而破坏酸乳风味。 4作为卫生合格标淮还应按卫生部规定进行检测，如大肠菌群检测等。经品尝和检验的酸乳应在4℃条件下冷藏，可保持6-7d。

实验二、固定化枯草芽孢杆菌连续发酵生产α淀粉酶

一、实验目的

1学习制备固定化微生物活细胞的方法。 2了解固定化活细胞发酵连续产酶的特性。

3使用固定化细胞及利用玻璃管硫化床反应器连续发酵生产α淀粉酶。 二、实验材料

1 枯草芽孢杆菌。

2 产淀粉酶种子培养液、产淀粉酶发酵培养液、4%海藻酸钠溶液、0.05mol/LCaCl水溶液、0.2mol/L柠檬酸缓冲液（pH5.0）、无菌生理盐水（0.85%NaCl）。

3 玻璃管流化床反应器(直径3cm，高20 cm，管外套加循环水套)、空气滤器、空气流量计、恒流泵、磁力搅拌器、5L发酵罐、水浴锅、500mL三角瓶、试管、比色用带孔白瓷板。 三、实验方法和步骤

1菌体准备

在无菌操作条件下，将灭菌的种子培养液按每瓶100mL分装于500mL三角瓶中，将活化的枯草芽孢杆菌α淀粉酶菌株接种于以上培养液中，37℃120r／min振荡培养16h作菌种。按10％的接种量接种于装有无菌发酵培养基的5L发酵罐中。维持37℃搅拌培养至对数生长后期(约24h)，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次。将收集的菌糊用生理盐水以10g／100mL制成菌悬液。

2固定化细胞的制备

在37℃条件下，将菌悬液与经115℃灭菌30min的4％海藻酸钠溶液等体积混合，放在磁力搅拌器上保持低速搅拌。以细塑胶管连接恒流泵和菌体-海藻酸钠悬液，在恒流泵的输送下，菌体-海藻酸钠悬液经直径为2-3mm的玻璃滴管滴入低速而连续磁力搅拌的0.05mol/LCaCl水溶液中，然后转入4℃冰箱过夜。取出后经无菌生理盐水洗涤2次，制成直径约1mm的固定化枯草芽孢杆菌细胞胶珠，菌体包埋在海藻酸钙凝胶中，即制成固定化细胞。

3固定化细胞连续发酵生产α淀粉酶

先将玻璃管流化床反应器灭菌，然后在进气口连接空气流量计和空气过滤器。在水循环外套的入口处连接水浴锅和温水循环装置，使固定化细胞反应器温度维持在37℃。在玻璃管流化床反应器内装入70g固定化细胞胶珠。开启恒流泵后，发酵培养液便流加进入反应器，反应器中供给无菌空气。培养后的发酵液由反应器顶部流出，收集发酵液，于4℃冰箱保存，用于测定α淀粉酶活性。

4 α淀粉酶活性测定

对收集的发酵液，可直接进行α淀粉酶活性测定，也可经超滤浓缩5-10倍后测定浓缩液的酶活性。α淀粉酶活性测定程序如下：

（1）吸取1mL标准糊精液，转入装有3mL标准碘液的试管中，以此作为比色的标准管(或者吸取2mL转入比色用白瓷板的空穴内，作为比色标准)。

（2）在25 x 20cm试管中加入2％可溶性淀粉液20mL，加PH 5.0的柠檬酸缓冲液5mL，在60℃水浴中平衡约5min，加入0.5mL酶液，立即计时并充分混匀。定时取出1mL反应液于预先盛有比色稀碘液的试管内(或取出0.5mL加至预先盛有比包稀碘液的白磁板空穴内)，当颜色反应由紫色逐渐变为棕橙色，与标准色相同时，即为反应终点，记录时间。以

末发酵的培养液作为测定酶活性的空白对照液。

（3）计算淀粉酶活力

酶活力/U.mL-1=(60/t×20×20%×n)÷0.5

式中t为反应时间，n为酶稀释倍数，0.5是使用的酶液量（mL）。 四、实验结果和报告

1记录所收集发酵液的α淀粉酶活性，并根据测定结果阐述固定化细胞的产酶特点。 2试说明两粒包埋胶珠的平板活细胞计数结果及光学显微镜的观察结果。

五、问题和思考

1制备固定化细胞的操作中，重点应掌握哪几个技术环节?此法最适用于那类酶的生产， 2结合本实验学到的知识，试绘出利用固定化细胞连续生产胞外酶的流程图，并标明各部位。 六、注意事项

1将菌体-海藻酸钠悬液滴入CaCl溶液中时要逐滴滴入，不要连成线状，对CaCl溶液要低速轻轻的磁力搅拌，以形成均匀的胶珠。

2要控制培养基中磷酸盐的浓度，防止过高。流加的培养基要保持—定浓度的钙离子，以维持海藻酸钙凝胶的稳定性。

3测定α淀粉酶活性的可溶性淀粉和标准糊精液，要低温保存，注意防腐，其标准管应做到当天使用当天配制，并注意防腐和冰箱低温保存。

第三部分 综 合 性 实 验

微 生 物 的 诱 变 育 种

一、实验目的

以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。 二、实验材料

1米曲霉斜面菌种。

2豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5％酪蛋白。

3三角瓶(250mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。 三、实验方法和步骤

(一)出发菌株的选择及菌悬液制备

l出发菌株的选择：可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。 2菌悬液制备：取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3-5d活化。然后把孢子洗至装有100mL0.1mol/L PH 6.0的磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成孢子悬液，调其浓度为106-108个／mL，冷冻保藏备用。 (二)诱变处理

可用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。

1紫外线处理：打开紫外灯(30w)预热20min。取5mL菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射1min后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间。照射时间分别为15s、30s、1min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1-2h，然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。

2稀释菌悬液：按10倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.1mL加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2-3d。 (三)优良菌株的筛选

1初筛：首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40-50个，作为复筛菌株。

2平板复筛：分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至

周边分成8等份，1-7份中点种初筛菌株，第8份点种原始菌株，作为对照。培养48h后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进入摇瓶复筛阶段。

3摇瓶复筛：将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是：称取麦麸85g，豆饼粉(或面粉)15g，加水95-110mL(称为润水)，水含量以手捏后指缝有水而不下滴为宜，于500mL三角瓶中装入15-20g(料厚为1-1.5cm)，12l℃湿热灭菌30min，然后分别接入以上初筛获得的优良菌株，30℃培养，24h后摇瓶一次并均匀铺开，再培养24-48h，共培养3-5d后检测蛋白酶活性。 4蛋白酶的测定方法

(1)取样：培养后随机称取以上摇瓶培养物1g，加蒸馏水100mL或200mL)，40℃水浴，浸酶1h，取上清浸液测定酶活性。另取1g培养物于105℃烘干测定含水量。

(2)酶活性测定：30℃pH 75条件下水解酪蛋白(底物为0.5％酪蛋白)，每分钟产酪氨酸1ug为一个酶活力单位。计算公式为：

(A样品OD680值-A对照OD680值)×K×V／T×N K：标准曲线中光吸收为“1”时的酪氨酸微克数； V：酶促反应的总体积； t：酶促反应时间(min)； N：酶的稀释倍数。

5谷氨酸的检测：此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之一。

检测培养基：豆饼粉：麸皮=6:4，润水75％，12l℃湿热灭菌30min。

谷氨酸测定：于以上培养基中加入7%盐水（W/V），40-45℃水浴，水解9d后过滤，以滤液检测谷氨酸含量（测压法） 四、实验报告

1试列表说明高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果。 2你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改进? 五、问题和思考

1试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。 2为什么在诱变时要把菌悬液打散和培养一段时间? 六、注意事项

1紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。

2诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行，并在黑暗中培养。

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