斜面低温保藏法

斜面低温保藏法

此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法．操作简单，使用方便，不得特殊设备，操作时，将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以

后，转移至2-8℃冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有所不同，霉菌、放线菌及芽 胞的菌保存2--4个月，移种一次；酵母菌两个月移种一次，细菌最好每月移种一次。此法 的缺点是菌种容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，传代过多会使微生 物的性状和代谢发生变异，在传代过程中，污染杂菌的机会也较多。因此，此法仅能用于工 作用菌种的短期保藏，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，传代代数超过5代的菌种应 灭菌处理后抛弃。

xxx食品检测中心作业指导书

1.目的

规范实验室菌种的收集、使用、保管程序；确保实验室的安全。

2.范围

本管理细则适用于实验室菌种的使用和管理。

3.职责

3.1菌种保管员：按照本指导书做好菌种的收集、转种、使用、保存和发放以及销毁工作。 3.2科室负责人：负责监督菌种的使用及管理。

4.管理细则

本实验室保存的菌种仅包括一部分致病性较弱的三类细菌、一部分无致病能力的普通细菌和常见真菌。不包括病毒、螺旋体、衣原体、立克次体；保存的菌种主要用于各类培养基、检测试剂的性能测试和质量控制。 4.1在本实验室保管的菌种名

4.1.1保留工作菌种：大肠杆菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌50013、福氏志贺氏菌2a ATCC12022、副溶血性弧菌200904-1、金黄色葡萄球菌ATCC25923、表皮葡萄球菌ATCC12228溶血性链球菌23310、铜绿假单胞菌10211、普通变形杆菌，克雷伯氏杆菌，小肠结肠炎耶森氏菌ATCC 23715 、单核增生李斯特菌ATCC19111、 枯草芽胞杆菌ATCC6633b 、蜡状芽胞杆菌ATCC11778、白色念珠菌ATCC10231、酿酒酵母ATCC9763、 黑曲霉菌 、展青霉菌 、 黄曲霉菌。

4.1.2常规检测,科研分离得到的有保留价值的三类/四类菌种根据需要可继续保留；如果在食品中分离到二类/一类菌种,及时送上级单位进一步鉴定,并按规定立即销毁。本实验室不保存一类、二类菌种。 4.2 菌种的保管

4.2.1实验室菌种保存于专用的菌种室。

4.2.2菌种保管员及科室负责人双人双锁负责保管菌种。

4.2.3使用菌种需提出申请、经科室负责人批准后，向菌种保管员领用。

4.2.4菌种应按规定的时间定期转种，一般每转种3代做一次鉴定，如发现污染或变异应及时处理。

4.2.5保管人员工作变动时应作好交接工作。 4.3 菌种的使用和保存

4.3.1菌种的类别

4.3.1.1实验室内的标准菌种根据用途不同，分为储存菌种、传代用菌种和工作用菌种。 ①储存菌种：以冷冻干燥保藏为主，用于菌种的长期保存，一般是从菌种保藏中心或专业实验室购买得到的标准菌株，用符号S表示。一般可保存5年。

②传代用菌种：采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法，用于菌种的传代，用符号G表示。甘油冷冻管保藏法一般可保存2年；

③工作菌种：保存于半固体内或琼脂斜面培养基中，作为工作用菌种，用符号W表示。一般可保存1～2个月。

4.3.1.2实验室从样品中分离得到的菌株用符号Y表示。 4.3.2菌种的接收 菌种购到实验室后，应在菌种接收记录上填写所购菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。贴好标签后储存于-30℃以下。 4.3.3冷冻干燥菌种的恢复培养

按菌种保藏中心的要求进行恢复培养。中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)建议的方法如下：

①安瓿管开封：用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰将安瓿管顶端加热，滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂，用锉刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。 ②菌株恢复培养：用无菌吸管，吸取0.3-0.4ml适宜的液体培养基（如营养肉汤），滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，取约0.2ml菌体悬浮液，移植于指定的琼脂斜面/平板培养基上，剩余的菌液，注入指定的液体培养基内（3-4ml），然后在建议的温度下（一般培养温度32.5℃±2.5℃，18～24h）培养。

③注意事项：菌种活化前，请将安瓿管保存在5-10℃的环境下；某些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。 4.3.4菌种的传代

从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。按转种次数确定菌种的代数：

①冷冻干燥的菌种在液体培养基内恢复培养（第1代）后，转种至平板培养基上得到单 个纯菌落，此为第2代。菌种传代一般不超过5代。

②鉴定菌种后制甘油冷冻管 经菌种特性鉴定后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，此作为第2代传代用菌种（G2）；同时挑取纯菌落转接斜面，此菌种作为工作用菌种，为第3代（W3）。

③将第2代传代用菌种（G2）管冷冻保存（-30℃以下），将第3代工作用菌种（W3）以适当温度下培养适当时间后可用于实验。

④取一支冷冻保存的第2代传代用菌种（G2）转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成甘油冷冻管，为第3代传代用菌种（G3）；斜面培养基经适当温度下培养适当时间后可用作第3代工作用菌种（W3）。

⑤当工作用菌种代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如W3可直接转接为W4。

⑥按上述程序操作，直至G4转为W5为止，需重新开启安瓿，再重复上述操作程序保藏和使用菌种。

4.3.5菌种的保存方法 4.3.5.1甘油冷冻管保存法

甘油冷冻管保存法适用于保存传代用菌种，一般可保存2年。

①将待保存用菌种接种至平板或琼脂斜面，经37℃24～48h培养后，用无菌接种环轻轻刮 取菌苔，移至预先装有无菌蒸馏水的试管中，调整菌液浓度，使其等同于1单位麦氏比浊管。

②向已制备好的菌悬液中加入等体积，浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。 ③轻轻振摇，使10%甘油菌悬液充分混合，分装于无菌小试管中，在-30℃条件下贮存。 4.3.5.2液体石蜡覆盖保藏法

液体石蜡覆盖保藏法适用于保存传代用菌种，一般可保存3-6个月。 ①取纯化菌种穿刺接种于半固体培养基中，经37℃18～24h培养后，加无菌液体石蜡覆盖半固体表面（高度1厘米为宜）。

②石蜡油封存以后，放入4℃冰箱中保存，也可直接放在低温干燥处保藏。③肠道细菌、葡萄球菌一般可保存3-6个月；保存O1群和非O1群霍乱弧菌时宜放置室温阴暗处；保存副溶血性弧菌时，用含3.5%氯化钠半固体，宜放置室温阴暗处；保存葡萄球菌、链球菌可用10%血半固体。

4.3.5.3斜面低温保存法斜面低温保存法适用于保存工作用菌种，一般可保存1～2个月 取纯化菌种转接种于适宜的固体斜面培养基上，经37℃18～24℃培养后，用纸将管塞部分包扎好，放入4℃冰箱中保存，也可直接放在低温干燥处保藏。 4.4 菌种的实验室编号

编号原则：菌种名称+类别/传代次数-制备日期或接收日期，例副溶-G3-20081213。对于实验室从样本中分离得到的菌种，类别用Y表示，例副溶-Y3-20081213。

注：菌种名称使用中文简称，如“副溶血性弧菌”用“副溶”表示；“金黄色葡萄球菌”用“金葡”表示；“奇异变形杆菌”用“奇变”表示。 4.5 菌种的销毁

4.5.1 菌种销毁采用高压蒸汽灭菌：121℃，20分钟。

4.5.2 下列菌种需及时销毁处理：①发生污染或变异的菌种；②超过保存期限的菌种；③使用后的菌种。

5.记录表式

菌种接收记录表 菌种使用登记表 菌种销毁审批表 6.参考文献 6.1 戴光强． 医学继续教育系列丛书?卫生检验分册[M]．合肥：安徽科学技术出版社，2001.4． 6.2 管远志， 王艾琳，李坚管．医学微生物实验技术[M]．北京：化学工业出版社，2005．8． 6.3 王宏明．微生物检验技术操作规程与质量控制及检测数据分析处理实用手册[M]．北京：卫生科技出版社，2007.5．

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