从文献作者提供的质粒中扩增GRP78新设计的PCR引物 - 图文

基本步骤：

1. 2. 3. 4. 5. 6.

收集拟扩增片段基因的基本信息；

样品扩增目的，与样品性质、数量、样品制作或处理方式，如制作标准曲线； 设计、合成、稀释与保存引物；收集扩增片段长度、扩增温度与时间条件； 普通PCR扩增条件的优化，凝胶电泳证实； 定量PCR条件的设计与标准曲线的制备；

溶解曲线、标准曲线等的判读与应用、标准曲线制备；

7. 改成相对定量测定，相对于内参基因以后的待测基因表达水平变化。

基础 1 X RXN （15 ul体系），除1 ul样标外的溶剂预混 Sense（10uM）: 0.5ul Antisense（10uM）: 0.5ul 2 X PCR mix (东洋纺，含SYBR)7.5ul

H2O (天根): 5.5ul

总体积： 14.0 ul

2 X PCR mix(东洋纺，含SYBR和ROX，产品号：QPK-201)。注释：ROX用于校正加样枪加样体积等（例如master mix液体加样体积）是否各孔之间是否一致。

标准品及待测样品

1，GRP78表达质粒实际含量，配制成质粒含分别16、8、4、2、1、0 pg/ul； 2，待测人肝HepG2 cDNA（总RNA 500 ng/ul, 吴逸园提供）。

质粒pcDNA3.1/GRP78标准品

储备液pcDNA3.1/GRP78质粒标准品纯度（OD260/280=1.89，浓度200ng/ul，由张立娟提供）。

取定量质粒DNA标品,将其稀释成400pg/ul,稀释方法如下：

取2ul质粒DNA（200ng/ul）,加入1ml蒸馏水稀释成400pg/ul的稀释品A，再从稀释品A中取出1ul,加入24 ul蒸馏水，稀释成16pg/ul成稀释品B；再从5ul的稀释品B及其以后浓度组中依次取出5ul，再对倍稀释成8、4、2、1pg/ul五浓度，各浓度组实际可用溶液体积各4ul。 浓度 pg/ul 储备或 上级液 加水ul 移取后 剩余ul 应用 400 2ul储备 998ul 999ul 标品A 16 1ul应用 24 20 标品B 8 标品C 4 标品D 2 标品E 1 5ul标品A 5ul标品B 5ul标品C 5ul标品D 5 5 5 5 5 5 5 10 标准系列共计5组，再加上阴性对照NTC和1个待测样品（cDNA），如果每个浓度组做2次平行，总共应有14个PCR样品或标准，加上1个备份，故应准备×15 RXN预混。

实际预混 Master Mix×15 RXN的制备：

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15 X RXN （15 ul体系），除样标外的溶剂预混

Sense（10uM）: 0.5ul×15 7.5 Antisense（10uM）: 0.5ul×15 7.5 2 X PCR mix (天根，含SYBR) 7.5ul×15 112.5

H2O (天根): 5.5ul×15 82.5

总体积： 210ul

标准曲线各管加入量如下（共计14）： cDNA 标准品A 标准品B 标准品C 标准品D 标准品E NTC 水或样 1ul 0ul 0ul 0ul 0ul 0ul 1ul 标准 0ul 1ul 1ul 1ul 1ul 1ul 0ul Master mix 14ul 14ul 14ul 14ul 14ul 14ul 14ul pg/ul 拷贝量 16 2E7 8 1E7 4 5E6 2 2.5E6 1 1.25E6 0 0 NTC 阴性对照；cDNA待测样品。

仪器 ABI 7300 PCR仪器上96孔板样品排布

实时PCR仪器ABI 7300参数设置

软件7300systemSDS software与仪器 ABI 7300

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一、在仪器联机软件7300systemSDS software中打开新文件，并设置 分析方法：Absolute quantitification 支架：96 well plate 模板: blank doculment Run model: standard 7300 Administor：lizaiquan

在well inspector窗口中，添加检测器SYBR，点击添加ROX，点击添加样品孔板格式，出现以下样品孔板反应框，关闭检测器。

二、在setup的plate中设立96孔板样品单元格内容及其孔的位置布局 Std1 F3F4 Std2 E3E4 Std3 D3D4 Std4 C3C4 Std5 B3B4 NTC F5F6 cDNA E5E6

按上述96孔各孔位置依次输入各单元内，打开各孔选定的检测器样品名称，选定探针种类，报告荧光GRP78-SYBR；该孔任务（作为标准或者对照或者样本）或样品类型（分别可选STD, NTC或cDNA）和模板拷贝数量或浓度数值（选项内容限标准品或对照孔）。

Use F3 F4 E3 E4 Detector SYBR SYBR SYBR SYBR Reporter Quencher Task STD1 STD1 STD2 STD2 Quantity 16 16 8 8 Color

三、在instrument状态中设立PCR反应条件（PCR传统的三步反应） 三步反应法PCR。盖子温度设定110 C。 清除前面一个60C循环，然后设置95 C 5min（归一化阶段），循环阶段（95C15sec；55C20sec；72C30sec），加入一个自动默认的溶解曲线条件，再后是保温阶段；最后设置循环阶段的总循环次数40cycle；

将样品反应体积由默认的50 ul改为 15ul。

将数据采集时间自动定在第二阶段（循环阶段）的第三步末尾，变性温度60C5min期间）； 将上述条件储存在文件save按钮，保存GRP78STDCURVE0308.SDS

样品盖盖儿后离心，确认将样品放置到PCR仪器相应孔内，点击start运行PCR循环。运行全长时间为扩增时间与融解实验时间的总和。

将软件菜单转换在Instrument状态，监控PCR进行到什么时候。

程序结束后，点击disconnect按钮，然后save-file，保存实验结果数据。 四、在Result状态中报告分析结果

将实验数据文件切换到Result状态，结果报告中显示有波谱曲线、成分曲线、扩增曲

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线、融解曲线和标准曲线。

以下各种图形都可以是PCR96孔板各孔反应的集合，也可以是某一孔的反应，取决于对选区的范围大小。分析秩序是波谱曲线、成分曲线、融解曲线、标准曲线和扩增曲线。最后从报告结果中获得样品CT值或绝对量拷贝数的具体数据。

检查或分析溶解曲线等结果。

作标准曲线图，机器会自动给出标准曲线图。

如果没有出现CT值时，应用凝胶电泳证实条带情况，也许会出现多一条带，要考虑重做。 根据标准曲线图，确立标准曲线浓度范围，并查找样品cDNA实际含量值。

实时PCR反应管凝胶电泳对扩增DNA片段再证实

PCR产物试管内上样前与LB之间的混合表，点样10 ul Lane 编码 1 标A 10 2 标A 3 10 3 标B 3 10 4 标B 3 10 5 标C 3 10 6 标C 3 10 7 标D 3 10 8 标D 3 10 9 标E 3 10 10 标E 3 10 11 NTC 12 NTC 13 cDNA 14 cDNA 6XLB 3 上样 凝胶上样模式图 M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 标准曲线制作 实际电泳图照片 贴图处

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