Protein A 、Protein G 与抗体的结合

Protein?A?、Protein?G?与抗体的结合

肃ProteinG是从G类Streptococci细菌中分离出来的胞壁蛋白，与多数哺乳动物的IgGFc段结合(包括：人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等)，分子量：25kDa。ProteinG可用于纯化不能与ProteinA很好结合的哺乳动物单抗和多抗IgG的纯化。相对于ProteinA，ProteinG对于大多数哺乳动物的IgG有着更高的亲和力，尤其是对于IgG的亚基，如人IgG3，小鼠IgG1和鼠IgG2a。与ProteinA不同，ProteinG不与狗IgG结合、不结合人IgM，IgD，或IgA。

?重组蛋白G(RecombProteinG)已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性结合。因此，它比天然蛋白G和蛋白A有更大的亲和力。可以代替二抗，广泛应用于免疫化学等领域。在亲和力、稳定性等方面好。

本产品将我公司自主设计和生产的新型重组蛋白G偶联到环氧活化的琼脂糖凝胶6B上，成为用于抗体分离纯化的亲和层析介质

?三、适用范围

ProteinA和ProteinG的相对结合强度

++++=强结合，++=中等结合，-=弱或不结

?四、缓冲液配制

建议采用磷酸缓冲液，洗脱后不影响下游的标记。

A缓冲液???1mol/L?Na2HPO4.12H2O(MW358.14)………………358.14g

?1500mMNaCll(MW68.08g/mol)…………………87.7g

??????????溶于1升水，滤膜过滤

?B缓冲液???1mol/LNaH2P04(MW156.01)………………………156.01g

溶于1

C?

??

D?

E?

??溶于1

?

??A?

1

2、以，再加900ml

3、将

4

5、用洗脱液E,洗脱3体积。

6、在洗脱液加入0.2体积中和缓冲液，以PH试纸确认溶液为中性。溶液太酸，会损伤抗体活性（中和缓冲液配制方法：A液77.4ml、B液22.6ml；两液混合成PH7.4的中和缓冲液

7、将分离纯化的IgG2a与对照品同时进行SDS-PAGE电泳分析。

8、用纯水流洗10个柱床体积，再用20%的乙醇流洗10个柱床体积，流速为2ml/min，

柱子置于+4~8℃环境中保存

?表三，25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制

IgG种属

2）.2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。

注：?所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normalmouseIgG，如无normalIgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouseIgG类型的抗体。通过和normalIgG和

ProteinA+GAgarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。

（3）.?免疫沉淀：

1）.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。

2）.再加入20微升充分重悬的ProteinA+GAgarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的ProteinA+GAgarose的量调整为40微升。)

3）.2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉ProteinA+GAgarose。

4）.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。

5）.完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高

6）.100

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