β防御素在肺气虚证大鼠发病中的作用

安徽中医学院学报第２９卷第５期２０１０年１０月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦ

ＡＮＨＵＩＴＣＭ（５（）Ｉ．ＬＥＧＥＶ０１．２９Ｎｏ．５（）嚏２０１０４７

１３防御素在肺气虚证大鼠发病中的作用

程惠娟，汪长中，官

妍，王

艳，俞丽华

（安徽中医学院中西医结合临床学院，安徽合肥２３００３８）

［摘要］目的观察肺气虚证大鼠血清ｐ防御素和支气管灌洗液、肺匀浆ｐ：防御素水平的变化，研究ｐ防御素在肺气虚证大鼠发病中的作用。方法采用呼吸道生物被膜茵（铜绿假单胞茵）滴鼻法引起大鼠呼吸道慢性感染，辅以寒冷、疲劳刺激，诱导肺气虚证的发生。分别在大鼠感染后３，３０，１００ｄ观察肺组织病理学变化，酶联免疫吸附试验测定其血清８防御素，气管冲洗液、肺匀浆Ｂ。防御素水平。结果模型组大鼠在感染

后３ｄ，肺部急性感染明显，血清ｐ防御素、肺匀浆Ｂ：防御素水平显著升高；感染３０，１００ｄ时大鼠肺部显示慢

性感染，血清ｐ防御素和气管灌洗液、肺匀浆Ｂ。防御素水平显著降低（Ｐ＜０．０１）。结论气虚证的发病过程，发病急性期参与炎症反应，慢性期诱发或加重肺气虚证。［关键词］肺气虚证；８防御素；细茵生物膜；铜绿假单胞茵

［中图分类号］Ｒ２４１．６［文献标志码］Ａ［ＤＯＩ］ＩＯ．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２２１９．２０１０．０５．０１７

肺气虚证是以肺功能减退为主要特征的全身多系统、多脏器功能衰退综合征，是老年人死亡的第一位病因。为了更一瓮面地探明肺气虚发病的本质，笔者采用呼吸道生毛，被膜菌（铜绿假单胞菌）滴鼻法，辅以寒冷疲劳刺激引起大鼠呼吸道慢性感染，复制肺气虚证模型［１］，测定大鼠血清Ｂ防御素和气管、肺匀浆Ｇｚ防御素的动态变化，观察肺组织的病理学改变，研究８防御素在肺气虚证大鼠发病中的作用，及其与肺气虚证候的相关性。

１

Ｂ防御素参与了肺

文献［１］检测铜绿假单胞菌生物膜，扫描电镜确认（图１）。阴性对照组大鼠正常饲养，模型组大鼠以

１．６ＬＤ５０（约３．８×ｉ０９

ｃｆｕ／ｍ１）菌量浓缩至０．２

ｍｌ，

然后一次性滴鼻感染。滴鼻当天开始。隔天置入直径５０ｅｍ，高１００ｃｍ，水深４０ａｍ的桶内游泳１次，水温控制在９℃左右，游泳时间以大鼠头开始沉入水中为限，捞出大鼠后不予保温和擦干，每重复３次休息ｌ周，再继续上法刺激，直至动物处死［１］。

材料

１．１菌株铜绿假单胞菌从安徽中医学院附属医院呼吸道患者标本中分离得到并经本课题组鉴定。１．２实验动物

健康ＳＤ大鼠，６个月龄，雌雄随

机，体质量（２５０士１０）ｇ，由江苏省动物实验中心提供。实验动物生产许可证：ＳＣＸＫ（苏）２００２－０００２。动物正常饲养１周后，随机被分为阴性对照组和模型组，每组３０只，两组再被分成３，３０，１００测，每组１０只大鼠。１．３仪器和试剂

３１８一酶标仪：上海三科仪器有限

公司；９６孔平板：杭州生友生物技术有限公司；扫描电镜Ｓｉｒｉｏｎ２００：ＦＥＩ公司；血清Ｄ防御素酶联免疫吸附试验（ｅｎｚｙｍｅ

ｌｉｎｋｅｄ

ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ

ａｓｓａｙ，

ｄ

３个亚

图１扫描电镜下铜绿假单胞面生物膜（×２００００）

组，分别在感染后３，３０，１００ｄ处死以进行相关检

２．２模型复制后每天观察大鼠发病情况于感染

后３，３０，１００ｄ各组随机取１０只大鼠，腹主动脉取血后处死，无菌操作取出气管和肺，取右肺中叶相同部位肺组织１块，置１０％甲醛中固定２４ｈ，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，苏木精一伊红染色，光镜下观察肺组织变化。余肺按１ｍｌ／ｇ加９．０ｇ／Ｌ氯化钠注射液（ｎｏｒｍａｌＮＳ）制备肺匀浆，经１

５００

ｓａｌｉｎｅ，

ＥＬＩＳＡ）试剂盒：美国ＡＤＬ公司；ｐ２防御素ＥＬＩＳＡ试剂盒：美国Ｒ＆Ｄ公司。

２

ｒ／ｍｉｎ离心后取上清

方法

液。按１ｍｌ／ｇ加ＮＳ冲洗气管３次，获气管冲洗

按

液。按ＥＬＩＳＡ试剂盒说明书测定血清０防御素，气管冲洗液、肺匀浆Ｂ：防御素。

２．３统计学方法应用ＳＰＳＳ１１．０软件进行统计

学分析。连续型变量用“均数士标准差（芽士５）”表

２．１铜绿假单胞菌生物膜的鉴定及模型复制

基金项目：安徽省年度重点科研项目（０７０２１００３）作者简介：程惠娟（１９５３一），女，副教授，硕士研究生导师

４８

安徽中医学院学报第２９卷第５期２０１０年１０月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＡＮＨＵＩＴＣＭｃ０ＬＬ麒记ＶｂＬ

２９Ｎｏ．５０眈２０１０

示，两组间均数比较采用ｔ检验。

防御素水平比较感染后３ｄ模型组大鼠血清和肺３

结果

匀浆中Ｊ３：防御素水平显著高于阴性对照组（Ｐ＜３．１症状、体征观察模型组大鼠于实验后第４天０．０１）；气管冲洗液口２防御素水平低于阴性对照组出现“肺气虚”症状：咳嗽，呼吸急促，咳嗽声音逐渐（Ｐ＜Ｏ．０１）。感染后３０ｄ和１００ｄ模型组大鼠血清降低，精神萎靡，食欲减退，反应迟钝，懒动，体质量口防御素，气管冲洗液、肺匀浆ｐ。防御素均显著低于

增加缓慢，鼻部潮湿，有分泌物自口鼻流出，皮毛脱阴性对照组（Ｐ＜Ｏ．０１）。见表１。

落稀疏、少光泽。阴性对照组无上述症状出现，表现为活泼好动、反应灵敏、食欲正常、皮毛光泽度好，呼吸平稳，体质量增加明显［１］。

３．２病理学检查大体标本肉眼所见：阴性对照组大鼠两肺大小正常，色泽正常，外表光滑弹性良好；模型组大鼠两肺体积增大，黯红偏紫有点状苍白，弹性差。

光镜下检查：阴性对照组大鼠肺组织结构正常，气管及各级支气管上皮完整（见图２Ａ）。３ｄ模型组急性炎症明显，肺组织明显出血（见图２Ｂ）；３０

ｄ

和１００ｄ模型组大鼠支气管壁有较多淋巴细胞浸

润，严重者支气管黏膜上皮细胞脱落，杯状细胞增生，管壁平滑肌增厚，致支气管壁增厚，管腔狭窄（图

Ａ：阴性对照组肺组织结构正常；Ｂ：３ｄ模型组急性炎症２Ｃ、图２Ｄ）。

明显；Ｃ：３０ｄ模型组慢性炎症；Ｄ：１００ｄ模型组慢性炎症

３．３

各组血清ｐ防御素及气管冲洗液、肺匀浆ｐ：

图２各组肺组织病理照片（苏木精一伊红染色，１０×４０）

表１

各组大鼠血清Ｂ防御素及气管冲洗液、肺匀浆ｐｚ防御素水平比较（王±ｓ，ｎｇ／ｍ１）

与同时点阴性对照组比较，＊＊Ｐ＜Ｏ．０１

４讨论种古老的宿主防御机制。哺乳动物防御素是抵御外生物被膜菌铜绿假单胞菌是慢性呼吸道感染最来微生物入侵的重要物质，是一类由１８～４２个氨基常见的机会致病菌，细菌的生物膜是细菌分泌的多酸组成的酸性阳离子抗菌肽。

糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等将其自身包绕其中形成Ｂ防御素主要分布在脊椎动物的皮肤、黏膜等的膜样物。生物膜内细菌处于休眠状态，对外界诸上皮组织，构成机体抵御外界侵袭的第一道化学屏如药物等抵抗力强。由于细菌处于休眠状态，感染障。大量研究表明，呼吸道上皮细胞分泌抗菌肽在进入静止期。在一定环境下膜内细菌又可以释放成天然免疫防御微生物入侵方面起重要的作用，尤其为游离菌，引起感染发作，发作期铜绿假单胞菌通过是Ｂ。防御素在细菌或者脂多糖的诱生下表达。防其菌毛在新的部位再形成生物膜，感染再进入静止御素对Ｇ＋和Ｇ一菌、真菌、包膜病毒及分枝杆菌等期。通过铜绿假单胞菌产生生物膜使感染呈现周而都有广谱杀伤作用，是上皮组织天然的化学复始、迁延不愈的特点，复制大鼠肺气虚模型一般体防御屏障。

征符合２００２年《中药临床研究指导原则》肺气虚证随着研究的深入，人们发现防御素不仅抵御外诊断标准，并有实验证明模型组大鼠易乏力，反复感来微生物入侵，还参与获得性免疫和免疫损伤。国染致体质量增加缓慢［１］。

外有学者观察到有活性的抗菌多肽在炎症过程中对

防御素是生物在长期进化过程中保留下来的一

机体的作用并不完全是抗菌杀菌，它们被释放入细

安徽中医学院学报第２９卷第５期２０１０年１０月ＪＯＵＲＮＡＬ

ＯＦＡＮＩ－ｎｆｌＩＴＣＭＯＯＬＬＥＧＥＶｏＬ２９Ｎｏ．５

Ｏｃｔ．２０１０

４９

胞外基质的早期尚可发挥其增强宿主防御功能，但很快出现细胞毒性和趋化现象，造成机体损伤［２］。防御素可诱导上皮细胞释放中性粒细胞趋化因子ＩＬ～８和中性粒细胞活化蛋白７８，它们又间接地提高中性粒细胞在炎症位点的募集和活化［３］，Ｚｈａｎｇ症和呼吸功能不全。

肺功能恶化时伴随人Ｂ：防御素的减少，严重的疾病可导致口防御素减少，并继发宿主防御缺陷［５］。

本实验结果和文献报道一致。感染３ｄ时，模型组大鼠在铜绿假单胞菌的诱生下肺黏膜上皮细胞过量产生ｐ。防御素，从而募集和趋化炎症细胞，发挥细胞毒作用，导致急性炎症的出现。肺组织Ｂ：防御素释放入血使得血清８防御素同时增高。３０ｄ和

１００

Ｈ

利则气道涩。”《素问 评热病论篇》谓：“邪之所凑，其气必虚。”由于肺功能减退导致肺气虚证大鼠气短、气促、易乏力，这和肺气虚证的表现是相符的，也为揭示肺气虚的本质提供了科学的理论根据和实验依据。

参考文献：

Ｆ１］程惠娟，汪长中，王艳，等．呼吸道生物被膜菌致肺气虚

大鼠模型的研制［Ｊ］．上海中医药大学学报，２００９，２３

（３）：３８－４１．

等ｎ１在小鼠的气管内给予防御素可导致急性气道炎

［２３

Ｈｉｅｍ

ｔｏｒｙ

ｓｔｒａ

ＰＳ．Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓａｎｄｃａｔｈｅｌｉｅｉｄｉｎｓｉｎｉｎｆｌａｍｍａ—

ｌｕｎｇｄｉｓｅａｓｅ：Ｂｅｙｏｎｄａｎｔｉｍｉｅｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｂｉｏ—

ｅｈｅｍＳｏｃＴｒａｎｓ，２００６，３４（２）：２７６－２７８．

ａ１．Ｎｅｕ—

［３３

Ｖａｎ

ｔ

ＷＳ，ＭａｎｎｅｓｓｅＬＳＰＧ，ＷａｎＳＭＡＧＡ，ｅｔ

ｒｏｐｈｉｌｄｅｆｅｎｓｉｎｓｓｔｉｍｕｌａｔｅｔｈｅｒｅｌｅａｓｅｏｆｅｙｔｏｋｉｎｅｓｂｙ

ｃｅｌｌｓ：Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｂｙｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ

ａｉｒｗａｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ

ｄ时。模型组大鼠感染进入慢性期，随着肺组织［Ｊ］．１ｎｆｌａｍｍ［４］Ｚｈａｎｇ

ｆｅｎｓｉｎｓ

Ｒｅｓ，２００２，５１：８－１５．

损伤和肺功能逐渐减退，肺黏膜上皮细胞产生的Ｂ防御素也随之减少。因此，感染３０ｄ和１００ｄ时模型组大鼠血清ｐ防御素，气管冲洗液、肺匀浆８：防御素显著低于阴性对照组。６防御素的降低，使得慢性感染期肺气虚大鼠呼吸道失去了化学屏障，不能抵抗外来病原体的侵入，表现为易患呼吸道感染，血清８防御素的降低提示机体整体抗感染能力也是降低的。《诸病源候论 卷之十三 气病诸候》认为：“肺主于气，邪乘于肺则肺胀，胀则肺管不利，不

Ｈ。ＰｏｒｒｏＧ，ＯｒｚｅｅｈＮ，ｅｔａ１．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｄｅ—

ｍｅｄｉａｔｅ

ａｃｕｔｅ

ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ａｎｄ

ｌｕｎｇ

ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｄｏｓｅ－ｒｅｌａｔｅｄＬｕｎｇ（；ｅｌｌ

ｆａｓｈｉｏｎ［Ｊ］．ＡｍＪ

Ｐｈｙｓｉｌｏ

ＭｏｌＰｈｙｓｉｏｌ，２００１，２８０（５）：Ｉ．９４７一Ｉ．９５４．

ａ１．Ｂｅｔａ－ｄｅ—

ｐａ

［５］Ｃｈｅｎ

ＣＩ，Ｓｃｈａｉｌｅｒ－ＢａｌｓＳ，ＰａｕｌＫＰ，ｅｔ

ｆｅｎｓｉｎｓａｎｄＬＩ。３７ｉｎｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒｌａｖａｇｅｆｌｕｉｄｏｆｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｙｓｔｉｃ４５’５０．

ｆｉｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．ＪＣｙｓｔＦｉｂｒｏｓ，２００４，３：

（收稿日期：２０１０—０３—１７）

ＲｏｌｅｏｆＢｅｔａ－ｄｅｆｅｎｓｉｎｉｎＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＬｕｎｇ－ｑ／ＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｍｅｉｎＲａｔｓＣＨＥＮＧＨｕｉ－ｊｕａｎ，Ｗ．ＡＮＧＣｈａｎｇ－ｚｈｏｎｇ，ＧＵＡＮＹａｈ，ＷＡＮＧ

（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｎｈｕｉ

ＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＡｎｈｕｉＨｅｆｅｉ

２３００３８，Ｃｈｉｎａ）

ｃｏｎｔｅｎｔｓ

Ｙａｎ，ⅢＬｉ—ｈｕａ

ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌ

Ｉ－Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｓｅｒｕｍ

ｏｆ

ｐ－ｄｅｆｅｎｓｉｎ，ａｎｄｔｈｅ

ｌｅｖｅｌｓ

ｏｎ

ｏｆ＆－ｄｅｆｅｎｓｉｎ

ｌｕｎｇ—ｑｉｄｅｆｉ—

ｉｎｂｒｏｎｃｈｉａｌｌａｖａｇｅｆｌｕｉｄａｎｄｌｕｎｇｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ，ａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆ１３－ｄｅｆｅｎｓｉｎｃｉｅｎｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅｉｎｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓｗｉｔｈｃｏｌｄ

ｓｔｒｅｓｓ

Ｎａｓａｌｄｒｉｐｏｆｂｉｏｆｉｌｍｂａｃｔｅｒｉａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｃｏｍｂｉｎｅｄ

ｔｏ

ａｎｄｅｘｈａｕｓｔｉｖｅｓｗｉｍｍｉｎｇｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄ

ｄｅｖｅｌｏｐｌｕｎｇ—ｑｉｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｈｉｓ—

ｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｌｕｎｇｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄ３，３０，１００ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｗａｓｕｓｅｄ

ｔｏ

ａｓｓａｙｔｈｅｓｅｒｕｍｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｐ—ｄｅｆｅｎｓｉｎ，ａｎｄｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆ［３ｚ－ｄｅｆｅｎｓｉｎｉｎ

ｂｒｏｎｃｈｉａｌｌａｖａｇｅｆｌｕｉｄａｎｄｌｕｎｇｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓｓｅｒｖｅｄｉｎｍｏｄｅｌ

ｒａｔｓ

Ａｎｏｂｖｉｏｕｓｌｙ

ｃｏｎｔｅｎｔｓ

ａｃｕｔｅ

ｐｕｌｍｏｎａｒｙｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗａｓｏｂ—ａｎｄｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆ

３ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｓｅｒｕｍ

ｏｆ

ｆｔ－ｄｅｆｅｎｓｉｎ

６２－ｄｅｆｅｎｓｉｎ

ｉｎ

ｌｕｎｇｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｈｒｏｎｉｃｐｕｌｍｏｎａｒｙｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄ３０，１００ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ｔｈｅｓｅｒｕｍｌｙ

ｃｏｎｔｅｎｔｓ

ｏｆ

ｐ－ｄｅｆｅｎｓｉｎ

ａｎｄｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆ

６２－ｄｅｆｅｎｓｉｎ

ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ—

ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ／３－ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ

ｗｅｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｌｕｎｇ—ｑｉｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ；ｉｔｐａｒ—

ａｃｕｔｅ

ｔｉｃｉｐａｔｅｓｉｎｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅａｃｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｄｒｏｍｅｄｕｒｉｎｇｃｈｒｏｎｉｃｐｈａｓｅ．

ｐｈａｓｅ，ａｎｄｉｎｄｕｃｅｓａｎｄａｇｇｒａｖａｔｅｓｌｕｎｇ—ｑｉｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎ—

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｌｕｎｇ—ｑｉｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ；１３－ｄｅｆｅｎｓｉｎ；Ｂｉｏｆｉｌｍ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ

β防御素在肺气虚证大鼠发病中的作用

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：

程惠娟， 汪长中， 官妍， 王艳， 俞丽华， CHENG Hui-juan， WANG Chang-zhong，GUAN Yan， WANG Yan， YU Li-hua

安徽中医学院中西医结合临床学院,安徽,合肥,230038安徽中医学院学报

JOURNAL OF ANHUI TRADITIONAL CHINESE MEDICAL COLLEGE2010,29(5)

参考文献(5条)

1.Chen CI;Schaller-Bals S;Paul KP Beta-defensins and LL37 in bronchoalveolar lavage fluid ofpatients with cystic fibrosis[外文期刊] 2004(1)

2.Zhang H;Porro G;Orzech N Neutrophil defensins mediate acute inflammatory response and lungdysfunction in dose-related fashion 2001(05)

3.Van WS;Mannesse LSPG;Wan SMAGA Neutrophil defensins stimulate the release of cytokines by airwayepithelial cells:Modulation by dexamethasone 2002

4.Hiem stra PS Defensins and cathelicidins in inflammatory lung disease:Beyond antimicrobialactivity 2006(02)

5.程惠娟;汪长中;王艳 呼吸道生物被膜菌致肺气虚大鼠模型的研制[期刊论文]-上海中医药大学学报 2009(03)

本文链接：/Periodical_ahzyxyxb201005017.aspx

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/4fa1.html