第六章 工业微生物育种

第六章 工业微生物 诱变育种

诱变育种 是指利用物理或化学诱变剂处理均 匀分散的微生物细胞群，在促进其 突变频率显著提高的基础上，从中 挑选少数符合目的的突变株，以供 科学实验或生产实践使用。

从青霉素产量看诱变育种时间 1943 1943 1943 1945 1947 1955 1971 1977 目前 发酵单位(u/ml) 100 250 500 ~ 850 ~ 850 ~8000 ~ 2万 ~ 5万 5~10万

效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1 单位

诱变育种目的 提高有效产物的产量 改变菌种特性，提高产品质量 简化工艺条件 开发新品种

诱变育种的过程选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大试验

一、诱变育种的实验准备(一)诱变前对出发菌株的了解 1、区分不同菌落类型 2、出现不同菌落类型原因

出发菌株

(二)全面了解菌种特性和生产性能的关系(三)了解影响菌种生长发育的主要因素

1、培养基2、斜面培养基的制备技术

3、接种量4、温度

5、湿度6、药品和原材料质量

(四)了解菌种有效产物中的各种组分 在代谢合成过程中与培养条件的关系 (五)建立一个准确、简便、快速检测 产物的方法 (六)研究最佳的菌种保藏培养基和培 养条件

二、诱变育种的步骤及方法(一)选择合适的出发菌株

1、对一般菌株的要求 野生菌株对诱变剂敏感

最好选用来自生产中的自发突变菌株。 具有有利性状(如高产、生长速度快、营 养要求粗放、标记明显等); 可选用已发生过其他突变的菌株。

2、选择具有一定生产能力或某种特性的菌株 作为出发菌株 3、选择纯种做出发菌株

4、选择出发菌株应考虑其稳定性5、连续诱变育种过程中如何选择出发菌株

6、采用多出发菌株7、了解菌种代谢特点

(三)制备待处理的菌悬液1、选用单细胞或单孢子悬液(均匀、分散) 目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂； ②减少表型延迟现象(诱变后性状的分离 及退化现象) 同步培养(生理状态一致) 菌龄：对诱变剂最敏感时期 营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期

菌悬液的制备方法物理诱变：生理盐水配制

化学诱变：缓冲液配制菌悬液的浓度

酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL细菌，放线菌孢子：108个/mL 不产孢子真菌：采用幼龄菌丝，三种方法制。 制备原生质体作为诱变材料。

(四)诱变剂的选择及处理方法 1.诱变剂的选择(高效，简便)物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。 ( NTG——超诱变剂)

UV是最常用的一种诱变剂2、根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱

变剂 3、参考出发菌株原有的诱变谱系来选择诱变剂

4. 剂量的选择常以杀菌率来表示相对剂量(剂量-存活率曲 线) 最适剂量：既能扩大变异幅度，又能使变异向 正突变范围移动的剂量。(P103) 突变率随剂量的增加而提高，达一定程度后， 再提高剂量, 反而会使突变率下降。 正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现 在偏高剂量中。 常采用相对杀菌率为70-75%。

(五) 诱变处理方法 单因素处理或多因素的复合处理： ①同一诱变剂的重复使用； ②两种或多种诱变剂的先后使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用； ④紫外线光复活交替处理 ⑤诱变剂处理时间与诱变效应的关系

(六)影响突变率的因素 1、菌种遗传特性不同 2、菌体细胞壁结构不同 3、环境条件的影响 1)诱变前预培养 2)温度、pH、氧气等外界条件对诱变 效应的影响 3)菌落密度效应

(四) 中间培养(CM,培养过夜)目的：克服表型延迟 生理性延迟的原因: 当变异细胞由杂合状态变为 表型延迟(phenotypic lag):表型的改变落后于基因型改变的 纯合状态时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白 现象. 或酶仍然发挥作用,必须经过细胞多代分离后, 分离性延迟： 突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯 才能将这些非变异的酶稀释掉,最终达到变异后 合状态，表型才能表现出来。 生理性延迟： 由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能 应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过 分离性延迟的原因: 对数生长期中，单核细胞常 表现出来。 程。 出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱 变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上 ，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几 代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推 迟现象称为分离延迟现象。

(五)突变株的筛选1. 初筛(以量为主)方法需简便、快速

2步

初筛 复筛

(1)利用形态变异：需预先测定形态与产量的 相关性

(2)根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法(蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶); 抑菌圈法(抗生素); 变色圈法(柠檬酸)、显色圈(氨基酸); 沉淀圈法(外毒素 透明圈直径(H)/菌落直径(C):产量高低(初 筛指标)

(3)浓度梯度法(4)影印平板法

(5)琼脂块大通量筛选方法

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