发酵工程讲义 - 图文

长江大学生科院生物技术系 《发酵工程》讲义

第一章 绪论

教学目的：了解发酵工程的意义及组成，我国发酵工程的发展现状； 掌握微生物发酵的纯培养技术和深层培养技术的相关内容及发酵工程发展历史上的五个转折点；掌握发酵工程的产业化及其发展前景。

教学重点、难点：微生物发酵的纯培养技术和深层培养技术；发酵工程的产业化及其发展前景。

1.1 发酵工程的意义及组成

传统生物技术：抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等。

现代生物技术：基因工程菌发酵，基因工程药物、疫苗及抗体生产。 发酵工业范围：了解

发酵工程与现代生物技术的关系

发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。它是应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。 由于它以培养微生物为主，故又称为微生物工程。 发酵工程的组成：从广义上讲，由三部分组成，上游工程、发酵工程、下游工程 上游工程：- genetics, cell ?（遗传学、细胞学）

- inoculum development（菌种培养）

-media formulation（载体表达） -sterilization（灭菌技术）

- inoculation（接种技术）

下游工程：- product extraction, purification & assay（产品分离、纯化及检验）

- waste treatment（废物处理） - by product recovery（产物回收）

发酵的定义：

1.传统发酵

发酵（fermentation）最初是来自于拉丁语“发泡”（ferver）这个词，是指酵母作用于果汁或发芽的谷物时产生二氧化碳的现象。

2.生化和生理学意义的发酵 指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。

3.工业上的发酵

泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程。 发酵过程的组成部分：

典型的发酵过程可划分成六个基本组成部分： （1）繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定； （2）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；

（3）培养出有活性、适量的纯种，接种入生产容器中；

（4）微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵罐中生长； （5）产物分离和精制；

（6）过程中排出的废弃物的处理。

1.2 发酵工程的发展历史

发酵现象→酿造食品工业→非食品工业→青霉素发酵→抗生素工业→氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵）→基因工程菌发酵→动物细胞大规模培养→植物细胞大规模培养→藻类细胞大规模培养→转基因动物

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（1）传统的微生物发酵技术——天然发酵 （2）第一代微生物技术—纯培养技术的建立

1675年荷兰Anthony Leeuwenhoek(列文虎克1632~1723)用自制的显微镜，观察到了微生物，包括细菌和酵母。

1857年法国的Louis Pasteur(巴斯德1822~1895)第一次证明酒精发酵是由活酵母引起的，各种不同的发酵产物是由不同的微生物产生的。被誉为微生物学的鼻祖，发酵学之父。

1897年德国Eduard Buchner(毕希纳1860~1917)将酵母细胞磨碎，得到的酵母汁加糖（蔗糖）能产生二氧化碳和酒精，从而阐明了微生物发酵的化学反应本质——酶催化。

1905年德国Rober Koch(柯赫1843~1910) 首先发明了固体培养基，得到了细菌纯培养物，建立了微生物纯培养技术，为发酵工程的建立起了关键作用。

纯培养技术的建立，开创了人为控制发酵过程的时期。这一时期的产品有：酵母、酒精、丁醇、有机酸、酶制剂等，主要是一些厌氧发酵和表面固体发酵产生的初级代谢产物。 （3）第二代微生物发酵技术—深层培养技术

1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究

表面培养：1升扁瓶或锥形瓶，内装200mL麦麸培养基。 ─── 40u/ml 1943年深层培养：5m3 ─── 200u/ml 当今：100m3─200m3 ─── 5-7万u/ml

青霉素发酵能成功的原因，主要是解决了两大技术问题： 通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。

抗杂菌污染的纯种培养技术：无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。 ●随后链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素等抗生素相继问世，形成了抗生素工业。伴随其兴起诞生的大型发酵罐，为发酵工程的发展提供了关键设备。

●20世纪50年代，日本人最早引进“代谢控制发酵技术”用于氨基酸发酵，氨基酸发酵工业得到快速发展； ●20世纪60年代，出现了石油发酵，如以石油为原料生产饲料酵母、柠檬酸、水杨酸等。

（4）第三代微生物发酵技术——微生物工程

● 1973年美国Boyer和Cohen首先在实验室实现了基因转移，为基因工程开启了通向现实的大门，此后很快在全世界各国的研究人员不但构建高产量的基因工程菌，还使微生物产生出它们本身不能产生的外源蛋白质，而且很快形成了基因工程产品，如胰岛素、生长激素、细胞因子、疫苗、单克隆抗体等。

值得一提的是，1973年人类通过基因工程手段构建了第一个“工程菌”，用它生产出了人生长激素释放抑制因子。

发酵工程发展的转折点：

第一个转折点：食品工业 →非食品工业 第二个转折点：青霉素发酵 → 抗生素工业 第三个转折点：代谢控制发酵 第四个转折点：发酵原料的改变 第五个转折点：基因工程引入发酵

1.3 我国发酵工程产业化现状及前景

1、发酵工程产业化的重要环节

发酵工程产业化就是将有关应用微生物的科学研究成果转化为发酵产品，并投向市场的过程。 三个环节：投产试验、规模化生产和市场营销。

2、我国发酵工程的发展现状

我国发酵工程经过长期发展已有一定基础，并一直持续快速发展。目前其产品涉及医药、保健、农药、食品、饲料、有机酸等方面。

中国的酿酒业，距今已有数千年的历史渊源。

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白酒：是我国特有的、具有悠久历史的传统酒种。

黄酒：是我国最古老的酒种，据史料记载已有6000年左右了。

葡萄酒：1892年华侨张弼士在烟台建立酿酒公司，这是我国第一个新型的葡萄酒酿造厂。目前我国葡萄酒工厂已有近八十家。2003年葡萄酒年产量约34万吨。

啤酒：1900年我国最早的啤酒厂于哈尔滨建成。2001年产量达到2200万吨左右。步入新世纪后，形成了青啤、燕京、华润“三强”鼎立。

在医药方面，抗生素得到迅猛发展，1998年抗生素产量达到33486 t，其中青霉素的产量居世界首位。其他生化药物中，初步形成产业化规模的有干扰素、白细胞介素、乙型肝炎疫苗等。

在农药方面，生物农药品种达85种，主要有苏云金芽孢杆菌（Bt）、井冈霉素、赤霉素等。其中井冈霉素的产量居世界首位。

在食品与饲料方面，作为三大发酵制品的味精、柠檬酸、酶制剂的产量也有很大增加，如味精产量22.3万吨（1990年）增加到71.3万吨（2001年），其生产和消费居世界第一；还有柠檬素的生产和出口也居世界第一。 在保健品方面，中国已能生产多种氨基酸、核酸、维生素等。 但是，也存在诸多问题。

中国发酵水平与国际先进水平的差距： ① 多数工厂规模小、效益低； ② 生产技术水平比较低； ③ 产品品种单一，结构不合理； ④ 应用的深度和广度不够；

⑤ 技术装备和检测手段落后，自动化水平低； ⑥ 综合利用和环境治理差。

3、发酵工程的发展前景

①基因工程的发展为发酵工程带来新的活力。

②新型发酵设备的研制为发酵工程提供先进工具。

③大型化、连续化、自动化控制技术的应用为发酵工程的发展拓展了新空间。 ④生态型发酵工业的兴起开拓了发酵的新领域。 ⑤再生资源的利用给人们带来了希望。

1.4 本课程的教学目的和内容

1、本课程的教学目的 2、教学内容

第一章 绪论 (4学时)

第二章 菌种的来源 (4学时)

第三章 发酵培养基 (4学时)

第四章 发酵工业的无菌技术 (4学时) 第五章 种子的扩大培养 (4学时)

第六章 抗生素发酵生产工艺(2学时)

第七章 啤酒发酵生产工艺(4学时) 第八章 氨基酸发酵生产工艺(2学时) 第九章 发酵过程控制 (12学时)

第二章 菌种的来源

教学目的：了解工业化菌种的要求以及一些工业化生产菌介绍；了解菌种分离的一般过程；掌握土样采集应注意的问题，菌种的分离方法；掌握优良菌种应具备的基本特性和菌种的选育。

教学重点、难点：土样采集应注意不同的土壤特点、地理和气候条件，土样的采集方法； 生化反应分离法；

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诱变育种。

第一节 工业化菌种的要求及已工业化产品生产菌介绍

一、工业化菌种的要求

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能在廉价原料制成的培养基上生长，且大量高效地合成产物； 遗传性能要相对稳定；

菌种改造的可操作性要强； 抗噬菌体及杂菌污染能力强；

? 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）； ● 发酵条件如温度、pH、溶解氧等易控制。

二、已工业化产品生产菌介绍

1、抗生素生产有关的微生物 2、氨基酸生产有关的微生物

50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点。

代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。 3、食品酶制剂生产有关的微生物

利用微生物来进行酶制剂生产是19世纪日本人用曲霉通过固体培养生产他卡淀粉酶，而大规模工业化生产则始于20世纪40年代末日本用深层发酵法生产α—淀粉酶。

第二节 自然界中目的微

生物的分离

一、菌种分离的一般过程

标本采集 → 预处理 → 富集培养 → 菌种分离（初筛、复筛）→ 性能鉴定 → 菌种保藏

二、微生物材料的标本采集

一般通过以下途径获得菌种： ①向菌种保藏机构索取有关菌株；

②由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等；

③从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶产生菌。

自然界中微生物极其丰富，土壤是微生物最集中的地方，所以土壤样品往往是采集的首选目标。 土样采集应注意以下问题：

A、不同的土壤特点

因土壤组成、有机物浓度、pH等条件的不同，微生物的种群分布会非常不同。如菜园和农田常以细菌和放线菌较多（偏碱）；果园树根土壤中酵母菌含量较高（偏酸）；动植物残骸及腐殖土中霉菌较多；根瘤菌多在豆科植物根系土壤中分离；分解石油的微生物常在油田和石油炼油厂附近的土层中分布最多。 B、地理和气候条件

南方和北方，一年四季。许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方。秋季采土样最为理想。

采土样的方法：南方，用取样铲，将表层5cm（阳光直射，蒸发量大水分少，而且受紫外线照射）左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10～30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。

C、微生物的生理特性

Ｄ、极端环境条件下采样分离

极端微生物的采集。

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三、标本的预处理

提高菌种分离的效率。表2-2（P31）

四、目的微生物富集的一些基本方法

? 富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。

富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基或创造有利生长条件，使目的微生物数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离得到所需要的菌株。

? 富集的基本方法： 1、控制营养；（如以唯一碳源或氮源作底物） 2、控制培养条件，如pH、温度、通气量等； 3、抑制不需要的种类

五、菌种分离

1、常规分离法：划线法、稀释法和涂布法

2、生化反应分离法：透明圈法、变色圈法、抑菌圈法、生长圈法

透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，这样能分解该底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈。

圈的大小可初步反映该菌株利用底物的能力，完全可以作为菌种初筛的判断标准。如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶及核酸酶产生菌的分离，产有机酸菌的初筛。

例1：分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为惟一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株。

例2：分离某种产生有机酸的菌株时，在培养基中添加碳酸钙。

变色圈法：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。

例：分离果胶酶产生菌，用含0.2%果胶为唯一碳源，菌落长成后加入0.2%的刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现降红色的变色圈。

抑菌圈法：若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落的周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，被鉴别出来。

常用于抗生素产生菌的分离。工具菌的选择是关键，工具菌采用抗生素的敏感菌。

生长圈法：常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素等产生菌。其工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株，由于得到所需的营养，凡是目的微生物周围便会出现一个混浊生长圈。

第三节 菌种选育

目的：防止菌种退化；解决生产实际问题；提高生产能力；提高产品质量；开发新产品。

优良的生产菌种应具备的基本特性： （1）菌种细胞的生长活力强； （2）生理性状稳定；

（3）纯、具有抗噬菌体感染的能力；

（4）稳定高产与目标产品性质相近的副产物及其他产物少； （5）能采用价格便宜，来源广泛的原料，并且转化效率高。

方法：自然选育、诱变育种、细胞工程育种（杂交育种、原生质体融合育种）、基因工程育种等。 一、自然选育

定义：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。 自然突变有两种情况：

一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。

为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。

自然选育在工业生产上的意义：

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/4dyt.html