HIV药代动力学

体外释药动力学研究-紫外分光光度

（1-；4-；5-；6-；8-；）体外释放研究方法包括：动态膜透析法；水平扩散池法；渗析扩散技术；反相渗析技术；超速离心法；超滤法；离心超滤技术等。 检测波长的确定

称取原料药适量，并用适当的稀释液稀释成适当的浓度，稀释液为空白，在200~400 nm波长范围内扫描，观察其吸收峰，从而确定检测波长； 释放介质的选择

分别考察其在不同释放介质(水、盐酸、PBS、KCl和NaCl)中的体外释药特征。 在各个释放介质中的释药参数 1、 标准曲线的测定

将标准品用不同的释放介质等比稀释成适当浓度的标准溶液，以吸收度A对浓度C进行线性回归处理，得浓度与吸光度的线性回归方程。 介质 水 PBS 盐酸 KCl NaCl 2、精密度实验

精密称取标准品适量，用各释放介质配制低、中、高（）三种浓度标准溶液，按上述方法测定吸收度A。一天内测定5次计算日内精密度；每天测定一次，连续测定五天，计算日间精密度。 3、回收率实验

精密量取标准溶液适量，用各释放介质配制低、中、高()三种浓度标准溶液，按上述方法测定吸收度A，计算回收率。 4、累积释药百分率测定

1）精密称取适量药物，照中国药典2005版二部附录XD第二法操作，在各个释放介质中，转速100 r/min，按预定时间每次取样5 mL，立即补加等量同质释放介质，在？？nm下测

方程 相关系数 1

定吸光度，代入标准曲线计算药物的释放百分率(Q)。并将各组数据两两组合计算f2(相似因子值)，比较其体外释药行为。其中，n指溶出的时间点，Rt 和Tt分别为参比和供试制剂在t时间点的累积溶出度，w 为权重系数(设为1）。

2）采用动态膜透析法进行体外释药实验。精密量取5mg样品置于透析袋中，将含药透析袋置于100ml释放介质中，温度为37±0.5℃，转速为100r／min，分别于0．5、1、2、4、6、8、12、24、36、60h定时从袋外缓冲液中取出3ml，立即补加等量同质释放介质。以磷酸缓冲液(pH6．8)为空白，于？？nm处测吸收度A，计算累计释放百分率(Q)。 5、在各个释放介质中释药动力学分析

将样品的释药行为进行释药数学模型拟合，拟合优度和数学释放模型（8-） 药品 样品 类型 零级动力学方程 一级动力学方程 Higuchi方程 Weibull方程

方程式 相关系数 2

体内药代动力学实验-高效液相色谱法

药物在体内的吸收及分布（1-；2-；3-；15-；16-；17-；） 药时曲线

药代动力学参数：根据试验中测得的各受试动物的血药浓度-时间数据，求得受试物的主要药代动力学参数。静脉注射给药，应提供t1/2（消除半衰期）、Vd（表观分布容积）、AUC（血药浓度- 时间曲线下面积）、CL（清除率）等参数值；血管外给药，除提供上述参数外, 尚应提供Cmax和Tmax（达峰时间）等参数，以反映药物吸收的规律。另外，提供统计矩参数，如: MRT （平均滞留时间）、AUC(0-t) 和AUC(0-∞ ) 等，对于描述药物药代动力学特征也是有意义的。 受试动物

小鼠，雌雄各半，体重20±2g，购买后适应性饲养48h。给药前12h禁食不禁水，以排除食物对药物吸收的影响。 溶液配制方案

1、小鼠口服给药溶液 准确称取样品适量，溶入生理盐水（或DMSO）。 2、小鼠静脉注射给药溶液 同上

3、对照品溶液 精密称取样品原料药10 mg，置于100 mL容量瓶中，加流动相配成浓度为 100μg?mL-1的储备液，再将储备液用流动相稀释为10、25、50、250、500、1000、和2500 ng?mL-1系列标准对照溶液，置4 ℃冰箱内保存待用。

4、内标溶液 精密称取标准品5mg，置于100 mL 容量瓶中配成浓度为50 μg?mL-1的储备液；用流动相稀释成浓度为25μg?mL-1的内标溶液，置4 ℃冰箱内保存待用。 给药方案

为保证最佳采样点，在正式试验前，选择2~3 只动物进行预试验，然后根据预试验的结果，审核并修正原设计的采样点。

给药前需要采血作为空白样品。为获得给药后的一个完整的血药浓度-时间曲线，采样时间点的设计应兼顾药物的吸收相、平衡相（峰浓度附近）和消除相。一般在吸收相至少需要2~3 个采样点，对于吸收快的血管外给药的药物，应尽量避免第一个点是峰浓度（Cmax）；在Cmax附近至少需要3 个采样点；消除相需要4~6 个采样点。整个采样时间至少应持续到3~5 个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10~1/20。

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1、单次给药

口服：给小鼠灌胃样品溶液，并与给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10 h，眼球取血，置于肝素化离心管中，3000 r?min-1离心分离取上清血浆，于 - 20 ℃冰箱中保存待测。

静脉注射：给小鼠静脉注射样品溶液，并与给药后0.08、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10 h，眼球取血，置于肝素化离心管中，3000 r?min-1离心分离取上清血浆，于 - 20 ℃冰箱中保存待测。

对血浆样品的测定按 “血浆样品预处理”项下操作，每日建立一条标准曲线，同时分析低、中、高(双样本)的质控样品，根据当日标准曲线计算各取样时间点的样品浓度和质控样品浓度，质控样品的相对偏差在±15 %之内时，当日数据方可接受。 2、多次给药

口服：连续5日给小鼠灌胃样品溶液，并于第1日，第5日分别采血（采样时间点为给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10 h）。眼球取血，3000 r?min-1离心分离取上清血浆，于 - 20 ℃冰箱中保存待测。 静脉注射：同上

注：多次给药需测定以下参数：

各个（和各组）受试动物首次给药后的血药浓度-时间数据及曲线和主要药代动力学参数。 各个（和各组）受试动物的3 次稳态谷浓度数据及平均值、标准差。

各个（和各组）受试动物血药浓度达稳态后末次给药的血药浓度-时间数据和曲线，及其平均值、标准差和曲线。

比较首次与末次给药的血药浓度- 时间曲线和有关参数。 各个（和各组） 平均稳态血药浓度及标准差。 色谱条件

样品的采集、保存及预处理

1、血浆样品的采集、保存及预处理（7-；2-；）

眼眶取血，肝素抗凝，3000 r?min-1离心分离取上清血浆，于 - 20 ℃冰箱中保存待测。 离心管中依次加血浆样品200 μL（对于浓度超出线性范围的样品，先用空白血浆稀释），水200μL，流动相100 μL，内标溶液50μL，磷酸盐缓冲液（pH7.4）200μL，旋涡1 min，旋涡3 min，在3000 r?min-1下离心10 min，取上清液，在40 ℃水浴中，氮气流吹干，再加

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入200μL流动相溶解，漩涡1 min，取20μL样品进样。 2、组织样品的采集、保存及预处理（15-；）

分别于给药后O．17，0．5，1．0，3．5 h取血后处死，立即解剖采集脑、心、肺、肝、脾、肾、卵巢（睾丸、附睾）等组织，组织用生理盐水冲净表面残留血液及内容物后，称重，-20℃冷冻保存。

分别取各组织加入1mL水匀浆，3000 r?min-1离心分离取上清。

离心管中依次加组织样品200 μL，水200μL，流动相100 μL，内标溶液50μL，磷酸盐缓冲液（pH7.4）200μL，旋涡3 min，在3000 r?min-1下离心10 min，取上清液，在40 ℃水浴中，氮气流吹干，再加入200μL流动相溶解，漩涡1 min，取20μL样品进样。 方法的专属性

1、空白血浆、空白血浆外加样品、空白血浆外加样品和内标、给药后血浆样品外加内标按“血浆样品预处理”项下方法操作处理后色谱图。检测血浆中的内源性杂质是否干扰药物及内标的测定。

取空白血清，除不加内标溶液并另外补加50μL流动相外，其余按“血清样品的处理”项下方法操作，获得空白样品的色谱图；将对照品系列溶液(相当血清浓度分别为2，2．5．2．5ng／mL)和内标溶液(200ng／mL)加入空白血清中，依同法操作，获得相应的色谱图；同法处理，得到小鼠给药后血清样品色谱图。

（（1-；）精密量取标准储备液lml置10ml容量瓶中，加流动相稀释定容，配成浓度约为1μg／ml的溶液，进样20μL，；取小鼠空白血浆，按血浆样品处理方法处理，进样20μL，得小鼠空白血浆色谱图，将一定量的标准储备液加入到小鼠空白血浆中，同法操作，得对照品色谱图。）

2、取空白组织匀浆上清液，除不加内标溶液外，其余按“组织样品的处理”项下方法操作，获得空白样品的色谱图；将对照品系列溶液和内标溶液加入空白组织样品中，依同法操作，获得相应的色谱图；同法处理，得到小鼠给药后组织样品色谱。检测组织中内源性物质是否干扰样品和内标的测定。 最低检测限

采用信号与噪音比方法，以？？nm为检测波长，把一系列已知低浓度标准品血样溶液与空白血样溶液处理后，分别进样20μL，记录色谱图。把此系列AZT标准品血样溶液的信号与空白血样的信号进行对比，以信号／噪音=3：1时的浓度为最低检测限，得最低检测限。 标准曲线（7-；）

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