免疫组化

免疫组织化学 第一节 概 述

1、概念：免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，是应用免疫学及组织化学的原理，对组织切片中的某些化学成分进行原位显示的技术。

采用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测，检测相应的目的抗原（或抗体）,并进行定位、定性和定量分析。

实际上该法是以免疫学方法取代化学方法的一种特殊的组织化学染色技术。 免疫组织化学技术的出现和发展给传统病理学带来了一场革命，使纯形态的病理学发展成为了形态与免疫信号相结合的现代病理学。其技术应用20多年来对临床病理诊断产生了深刻的影响，目前已成为了病理诊断中不可缺少的、最重要的辅助手段。 2、发展史

3、免疫组织化学的临床应用

适用于蛋白水平上组织的抗原或抗体检测。凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。 主要用于常规石蜡切片难以完成的疑难肿瘤的诊断

（1）对肿瘤的组织起源进行鉴别诊断，确定转移性恶性肿瘤的原发部位 （2）对肿瘤的良恶性进行综合判断

（3）对肿瘤进行进一步的病理分型和分期

（4）发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定 （5）为临床提供治疗方案的选择

（6）癌基因蛋白、肿瘤激素受体及生长因子的检测对肿瘤预后的判断 （7）癌基因蛋白检测可用于肿瘤病因及发病机理的研究 4、免疫组化实验所采用的组织和细胞标本

组织标本：包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片 细胞标本：包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片

5、免疫组化实验所用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。 6、免疫组织化学的全过程包括： （1）抗原的提取与纯化；

（2）免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化； （3）将显色剂与抗体结合形成标记抗体； （4）标本的制备；

（5）免疫细胞化学反应以及呈色反应； （6）观察结果。

7、免疫组织化学的技术分类

（1）根据染色方式：① 贴片染色 ② 漂浮染色

（2）根据Ag-Ab结合方式分为：① 直接法 ② 间接法 ③ 多层法 （3）按标记物的性质分为： ① 免疫荧光技术（免疫荧光法） ② 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、 ABC法）③ 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法） ④放射免疫自影法

8、标记物

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（1） 必要性 （2）常用标记物：① 荧光素 ② 酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶 ） ③ 生物素（Biotin） ④ 铁蛋白金（主要应用于免疫电镜 ） ⑤其他：如同位素

第二节 免疫组化技术

一、免疫组化所需仪器设备 二、免疫组化所需试剂 PBS（磷酸盐）缓冲液 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液 3%过氧化氢溶液 DAB显色系统

0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0） 1mol/L的TBS缓冲液 酶消化液

3%甲醇-H2O2溶液 封裱剂 TBS/PBS

三、组织的前期处理 （一）固定

取材后组织（1.0×1.4×0.4cm）推荐固定时间4～18小时。

组织固定不够的原因：固定时间不够；固定液浓度不够；固定液用量不够；大标本或有包膜的组织不切开固定

固定时间较长的标本，可通过加强修复增强染色效果。 （二）烤片

烤片的温度不宜过高：烤片的时间不宜过长。烤片温度过高不仅会引起切片细胞收缩，而且对组织内抗原的保存有一定的影响，尤其是细胞核阳性的抗原；但时间太短(少于20分钟)，容易造成脱片。推荐烤片温度及时间：50℃～60 ℃ ，烤2～4小时。

四、免疫组化操作流程 （一）脱蜡和水化

凡是石蜡切片必须经过二甲苯脱蜡，各级乙醇至水洗的过程。二甲苯和各级乙醇必须保持一定纯度，不能混入其他杂质成分，而使染色受到影响。 组织切片的脱蜡步骤应彻底，否则无论进行哪种染色都会发生困难。脱蜡时间要充分，若溶蜡剂使用过久应及时更换以免效率降低，若室温过低，可将溶蜡剂置于温箱中进行脱蜡。 （二）抗原修复

组织固定、脱水、透明、浸蜡、烤片，阻断剂、甲醇、抗原暴露及修复过程中用的蛋白酶、酸、缓冲液等各种理化因素，都会使抗原受到影响，导致抗原决定簇不同程度的破坏甚至完全破坏，丧失原有的抗原性。

抗原修复(Antigen retrieval ，AR)是指石蜡切片免疫组化染色前用酶、表面活性剂或微波、金属盐等对被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原进行暴露和修复，使抗原性得到一定程度恢复的过程。抗原修复有利于抗原抗体结合，提高阳性检测率。

不同的抗原可选择最佳修复方式：不修复：可直接加一抗；热修复：水浴、

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微波、高压；酶消化：胃酶、胰酶、蛋白酶K、XXV酶；双暴露：先热处理后酶消化或先酶消化后热处理。 （三）免疫组织化学染色 1、染色方法有：

（1）直接法：荧光素直接标记在特异性的抗体（一抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上），荧光显微镜下观察→检测抗原。

（2）间接法：荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体），显色后镜检。

（3）非标记Ab桥法：―桥法‖是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。分单桥法和双桥法。

（4）PAP法（ Peroxidase anti—peroxidase method，过氧化物酶—抗过氧化物酶法）： 是桥法的改良，既先形成PAP复合物→抗原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物。

（5）ABC法（ Avidin—biotin—peroxidase Complex method，亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法）

（6）SP或SAP法（ Streptavidin/peroxidase or strepta-vidin/alkaline

phosphatase，过氧化物酶标记的链霉卵白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色）：是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO 。

（7）蛋白A-金法（Protein-A gold method）：多用于电镜。

（8）双重组化染色法：应用双重免疫组织化学激素可在同一张切片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原。

（9）免疫金—银染色法Immunogold—silver staining IGSS） 五、免疫组化染色步骤 （一）酶标抗生物素蛋白链菌素-生物素（lablled strptavidin biotin ,LSAB或S-P法）

1.将已制作好的组织切片进行脱蜡和水化（冷冻切片和细胞涂片不用脱蜡）； 2. PBS洗2次各5 min； 3. 3%双氧水阻断10 min； 4.PBS洗2次各5 min；

5.抗原修复（有些抗体无需修复）； 6. PBS洗2次各5 min； 7.滴加Ⅰ抗孵育1 h(37℃); 8.PBS洗3次各5min；

9.滴加Ⅱ抗孵育15～30 min； 10.PBS洗3次各5 min；

11. 加HRP标记的抗生物素蛋白链菌素孵育15～30 min； 12. PBS洗3次各5 min；

13. DAB显色1～5分钟，镜下掌握染色程度； 14. PBS冲洗10 min；

15. 苏木精复染1～2 min，盐酸酒精分化； 16. 自来水洗10 min；

17. 脱水、透明、封片、镜检。 （二）ABC法

1．切片脱蜡至水，入PBS 洗3次/15分钟。

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2．封闭内源性过氧化物酶。用新配置的0.3％H2O2 （在PAS或0.05 Tris-HCl缓冲液PH7.6中或甲醇中）室温，30 min。

3．水洗，入PBS，洗三次，每次5min。

4．减少非特异性着色。用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物血清！），室温，30min。

5．滴加第一抗体，4℃过夜或室温5min~1 hour。 6．0.1MPBS，洗三次，每次5min。 7．滴加第二抗体，室温15min~ 60min。 8．0.1MPBS 洗净，洗三次，每次5min。 9．滴加ABC复合物，室温15min~60min。 10．0.1MPBS 洗三次，每次5min。

11．0.05M Tris –HCl 5~10分钟，此步可省略。

12．DAB-H2O2 显色：用0.01％H2O2的DAB溶液，室温5~30分钟，随时镜检（DAB用时新配）

13．自来水洗净。

14．用Mayer 苏木精或0.5％甲基绿，复染胞核（可不染）。 15．常规脱水、透明、封固、镜检。 结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。 （三）EnVision二步法（ELPS法 ）

1．将已制作好的组织切片进行脱蜡和水化； 2. 水洗，PBS洗3次各5 min； 3. 抗原修复（有些抗体无需修复）； 4. 3%双氧水阻断10 min； 5. PBS洗2次各5 min；

6. 滴加Ⅰ抗放入孵育盒中冰箱4℃过夜或37 ℃孵育1 h; 7. 第二天将孵育盒取出在室温平衡1h；

8. 每张切片分别以PBS冲洗后，再放入切片缸内PBS洗3次各5min； 9. 滴加EnVisionⅡ抗孵育15～30 min； 10. PBS洗3次各5 min；

11. DAB显色3～5分钟，镜下掌握染色程度； 12. 自来水冲洗；

15. 苏木精复染1～2 min，盐酸酒精分化； 16. 自来水洗10 min；氨水返蓝； 17. 脱水、透明、封片、镜检。 （四）细胞免疫组织化学染色

1.将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2×104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行细胞免疫组织化学染色鉴定。 2. PBS清洗标本3次各2 min。 3. 4%的多聚甲醛固定15分钟；（冷甲醇：丙酮1：1） 4.空气干燥5min。

5. PBS清洗标本3次各2 min。

6. 0.5%Triton X-100( DPBS配)孵育1次20 min。 7. PBS清洗标本3次各2 min。 8. 3%H2O2孵育15 min。

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9. PBS清洗标本3次各2 min。

10. 封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液）20min。

11.一抗孵育（PBS配，滴度1：200，湿盒）4℃过夜或37 ℃ 60 min。 阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS 12. PBS清洗标本3次各5 min。

13.二抗工作液湿盒中孵育37 ℃ 30 min。 14. PBS清洗标本5次各2 min。

15. DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约10~15min。 17. 蒸馏水或自来水洗1次5 min。（可放六孔板内，再将孔板放在饭盒等内，自来水下冲洗）

18. 苏木素复染10min。 19. 自来水洗5min。 20. 树胶封片。

六、免疫组化染色基本技术及注意事项

1. 实验计划 2. PBS洗涤技术 3.加过氧化氢 4.孵育盒的制作 5.加封闭液 6.关于抗体 7.加SABC

8 .光镜控制显色方法 9. 苏木素复染

10. 脱水、透明、封片、镜检 11. 防止脱片

12. 染色失败的弥补

七、对照组和染色结果的评价

（一）必须设置相应的阳性和阴性对照试验。

（二）对染色结果的判断应持慎重态度，正确辨认特异性染色和非特异性染色

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