USP34 61 非无菌产品的微生物检验：微生物计数检测

61 非无菌产品的微生物检验：微生物计数检测

简介

后面所提到的检测都是用于在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

设计这个实验旨在确定药物或制剂是否符合已建立的微生物质量要求规范。当用作上述目的时，可参考下面的说明，包括所取样品的量及以结果的解释。

该方法不适用于将微生物作为有效成分的产品。

可以运用包括自动化方法在内的替代微生物方法。但要求已被证明其等价于药典方法。

通用方法

在拟定的条件下进行试验，拟定的条件旨在避免待测产品的外在微生物污染。采取的避免污染的措施必须不影响任何测试中需要披露的微生物。

如果待测产品具有抗菌活性，尽可能取消或者解除这个活性。如果是用灭活剂，则它的效用和毒性情况必须说明。

如果表面活性物质作为检测样品，则它们对微生物的毒性和与灭活剂的兼容性应作说明。

计数方法

按照规定使用膜过滤法或者平板计数法。最可能数目法（MPN）是微生物计数法中精密度最差的方法。然而，对于特定的低生物负荷的产品组，可能是最适宜的方法。 方法的选择是基于如产品属性，微生物限度要求等因素进行选择的。 选择的方法必须进行大量的样品检测来判断是否符合规范。并建立其方法的适用性。

促生长实验，计数方法的适用性和阴性对照

总则

需建立有样品进行试验的条件下微生物测试的性能状况。

检验条件改变或样品改变时，因影响其测量结果，则应确定其适用性。

试验菌株制备

用标准的、稳定的试验菌株悬浮液或者将它们按以下步骤制备。因使用种子批培养保留技术（种子批技术），则用于接种的可用的微生物从原始的第一代开始继代培养不能超

过5代。且按照表1表所示将每一批细菌和真菌等试验菌株进行独立培养。

表1．试验菌的制备及应用 促生长 微生物 实验菌株的制备 总需氧微生物计数 酪蛋白大豆琼脂培养基或酪蛋白大豆肉汤培养基 30-35℃ 18-24h 酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基 ≤100CFU 30-35℃ ≤3天 总酵母菌和霉菌的计数 有样品的情况下，微生物计数方法的适用性 总需氧微生物计数 酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU 30-35℃ ≤3天 总酵母菌和霉菌的计数 金黄色葡萄球菌 ATCC6538 NCIMB9518 CIP4.83 NBRC13276 —— —— 酪蛋白大豆绿脓假单胞菌 琼脂培养基ATCC9027 或酪蛋白大NCIMB8626 豆肉汤培养CIP82.118 基 NBRC13275 30-35℃ 18-24h 酪蛋白大豆枯草芽孢杆菌 琼脂培养基ATCC6633 或酪蛋白大NCIMB8054 豆肉汤培养CIP52.62 基 NBRC3134 30-35℃ 18-24h 沙氏-葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基 20-25℃ 2-3天 酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基 ≤100CFU 30-35℃ ≤3天 酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基 ≤100CFU 30-35℃ ≤3天 酪蛋白大豆琼脂培养基 ≤100CFU 30-35℃ ≤5天 —— 酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU 30-35℃ ≤3天 —— —— 酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU 30-35℃ ≤3天 —— 白色念珠菌 ATCC10231 NCPF3179 IP48.72 NBRC1594 沙氏-葡萄糖琼脂培养基 ≤100CFU 20-25℃ ≤5天 酪蛋白大豆琼脂培养基 ≤100CFU 30-35℃ ≤5天 沙氏-葡萄糖琼脂培养基 ≤100CFU 20-25℃ ≤5天 沙氏-葡萄糖琼脂培养基或酪蛋白大豆黑曲霉 马铃薯葡萄培琼脂培养基 ATCC16404 养基糖琼脂培≤100CFU IMI149007 养基 30-35℃ IP1431.83 20-25℃ ≤5天 NBRC9455 5-7天，或直到获得好的芽孢 沙氏-葡萄糖琼脂培养基 ≤100CFU 20-25℃ ≤5天 酪蛋白大豆琼脂培养基 ≤100CFU 30-35℃ ≤5天 沙氏-葡萄糖琼脂培养基 ≤100CFU 20-25℃ ≤5天 使用pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液或者pH7.2磷酸缓冲溶液来制备实验所用的菌悬液。对于曲霉孢子菌悬液，可以将0.05%的聚三梨醇酯80加入到缓冲溶液中。且应在2小时或2-8℃条件下24小时内应用。稀释曲霉或者枯草杆菌的新鲜营养细胞悬浮液得到稳定的孢子悬浮液，然后取适宜体积的孢子悬浮液用于试验接种。这个稳定的孢子悬浮液可在2-8℃的条件下，验证时间内保存。

阴性对照

为了验证试验条件，使用选择的稀释剂代替供试品进行试验，它不能有微生物生长。在产品检测中也要有阴性对照。如果阴性对照失败，应进行调查。

培养基的促生长

测试每一批制备好的培养基，和由脱水制备或者按成分制备每一批培养基。

按表1所示，在酪蛋白大豆肉汤培养基和酪蛋白大豆琼脂培养基中接种少量微生物菌种（不超过100个菌落形成单位），且每一种菌都单独使用培养基。在沙氏-葡萄糖琼脂培养基上接种菌种少量微生物菌种（不超过100个菌落形成单位），每一种菌都单独使用培

养基。按表1所示的条件下培养。

对于固体培养基，获得的生长结果不得超过由标准接种而来的计算值的两倍范围。对新制备的菌种，微生物的生长状况应与以前测试过的、经批准的培养基的微生物作比较。对于液体培养基，其与以前测试过的、经批准的培养基比较有清晰可见的微生物生长，那么液体培养基被认为是可试用的。

样品存在时计数方法的适用性

样品的制备

根据被测样品的物理特征选用合适的样品制备方法。如果以下描述的方法都不行，则应开发新的替代方法。

水溶性产品——用pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液或pH7.2的磷酸盐缓冲溶液或酪蛋白大豆肉汤培养基溶解、稀释测产品（通常1：10的稀释）。必要时，调节pH在6-8.之间；用同一稀释剂稀释成更高倍数的稀释液。

水不溶性非脂肪产品——用pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液或pH7.2的磷酸盐缓冲溶液或酪蛋白大豆肉汤培养基将产品制成悬浮液（通常1：10）。可将表面活性剂如1g/ml的聚三梨醇酯80加入到悬浮液中以增强可湿性差的的物质的悬浮。必要时，调节pH在6-8.之间；用同一稀释剂稀释成更高倍数的稀释液。

脂肪性产品——通过无菌膜过滤将样品溶解于十四酸异丙酯中，或者将产品与最少需要量的无菌聚三梨醇酯80或者其他非抑制性无菌的表面活性剂混合。必要时，加热至不超过40℃，对于特殊产品不超过45℃。充分混匀，必要的时候在水浴锅中保温。加入足量的预先温热的稀释剂制成原始产品1：10的稀释溶液。混匀后，应尽量缩短其保温时间以免形成乳胶。用含有合适浓度的聚三梨醇酯80或其他非抑制性无菌的表面活性剂得相同稀释剂稀释成更高倍数的悬浮液。

液体或固体喷雾剂——无菌条件下，转移产品至薄膜过滤器中或者其它灭菌容器中待进一步取样。取容器中所有的量或规定量用于检测。

贴剂——撕开贴剂的保护层（‘露出内衬’），胶贴面朝上放置在灭菌玻璃或者塑料托盘上。用无菌多孔材料如无菌纱布盖住胶贴面，以防止贴剂黏在一起，然后将贴剂放入含有灭活剂如聚三梨醇酯80或卵磷脂的稀释剂中，剧烈振荡至少30min。

接种和稀释

将一定体积的微生物悬浮液加入到按上述准备好的样品和对照溶液（不含检测样品）中，其结果不能超过100个的菌落形成单位。且其微生物悬浮液的接种体积不能超过稀释样品体积的1%。

为了测定样品中的微生物回收率，应用准备好的样品的最低稀释剂进行试验，如果其产品具有抗菌活性或溶解性差时，应找其他可可用的方法替代。如果不能避免样品中微生物出现生长抑制时，则微生物的悬浮液应在中和、稀释或过滤后加入。

抗菌活性的中和/除去

按“接种和稀释”中的方法稀释样品和按“产品存在时微生物的回收率”中的方法培养样品得到的微生物数与对照组中的微生物数作比较。

如果生长被抑制（减少超过2倍量），那么对计数试验进行修改并对结果进行验证。修改的方法可以为，例如：

（1）增加稀释剂或培养基的用量；

（2）在稀释剂中加入指定的或者通用中和剂； （3）薄膜过滤；

（4）将上述措施相结合。

中和剂——中和剂可用于中和药物的抗菌活性（表2），它们可以在所选择的稀释剂或培养基灭菌前加入。使用时，应通过有中和剂而无样品的空白对照来表明其中和剂对微生物的效力和毒力。

表2-常见的干扰物质的中和剂 干扰物质 可用的中和方法 戊二醛，有机汞制剂 亚硫酸氢钠（亚硫酸钠） 酚醛树脂，醇，醛，山梨酸酯 稀释 醛 甘氨酸 季铵化合物（QACs），羟基苯甲酸，2-双胍类 卵磷脂 季铵化合物（QACs），碘，羟基苯甲酸 聚山梨酯 汞制剂 巯基醋酸酯 汞制剂，卤素，醛 硫代硫酸盐 EDTA（乙二胺四醋酸盐） 镁离子或者钙离子 如果找不到适宜的中和方法，则可将分离微生物失败的原因归因于产品的微生物活性。此信息表示产品不太可能被特定种类微生物污染。然而，产品可能只抑制某些特定的微生物，而不抑制另外的、没有包括在试验菌株内的微生物或者不具有代表性的微生物。然后，用最高稀释倍数的样品做微生物的生长和具体验收标准兼容性测试。

有样品时微生物的回收率

对于每一个列出的微生物都必须进行单独的试验。只计算试验菌的生长数量。 薄膜过滤——使用有标称孔径不超过0.45μm的膜进行过滤。应选择细菌截留率不受被测样品的组分影响的过滤材料。对列出的每一种微生物都个单独使用一个过滤器。

按照“样品制备”、“接种和稀释”和“抗菌活性的中和/除去”中所述准备的样品取 适量(一般为产品的1g量，如预期的cfu较大时，可以取少量)至膜过滤器，用适宜体积的稀释液冲洗膜过滤器。

对于总需氧菌数的测定(TAMC)，转移过滤后的膜至酪蛋白大豆琼脂培养基平板上。对于测定酵母菌和霉菌的总数（TYMC)，转移过滤后的膜至沙氏-葡萄糖琼脂培养基平板上。根据表1定义的培养上述培养基，并进行计数。

平板计数法——平板计数法要求每种培养基至少配制两个以上，结果用平均计数法计算。

倒板法——用直径为9厘米的培养皿，加入1ml的按照“样品制备”、“接种和稀释”和“抗菌活性的中和/除去”中所述准备的样品和15~20ml的酪蛋白大豆琼脂培养基或者沙氏-葡萄糖琼脂培养基，其培养基的温度不超过45℃。如果使用较大的培养皿，可以适当增加培养基的用量。对于每一个表1中列示的微生物，至少制备两个培养皿。并按照表1所述进行培养。每个培养基按算术平均计数，并计算最初接种的cfu值。

表面扩散法——在直径为9cm的培养皿中，加入15-20ml 45℃左右的酪蛋白大豆琼脂培养基或者沙氏-葡萄糖琼脂培养基，固化。假如使用较大的培养皿，可以适当增加培养基的用量。在层流空气流柜或者培养箱内干燥平板，对于在表1中所列示的每种微生物至少制两个平板。然后取不少于0.1ml按“样品制备”、“接种和稀释”和“抗菌活性的中和/除去”中描述准备的样品到培养基表面上涂布。按“倒板法”所描述的培养和计数。

4-5-4-3．最可能数目法（MPN）

MPN的精密度和准确度小于膜过滤法和平板计数法。特别是模具枚举法得到的不可靠的结果。由于这个原因MPN法是好氧微生物测定的保留方法，在没有其它方法可用的情况下可用。假如使用的方法是合理的，按照如下所述进行。

准备一系列至少3个顺序的产品的十倍稀释液如4-5-1至4-5-3所述。从每个稀释水平，3等分1g或者1ml用于接种3个装有9-10ml大豆酪蛋白消化肉汤培养基的试管。如果有必要，表面活性剂例如吐温80或者抗生素抑制剂可能被加入到介质中。因此，假如3个水平的稀释液被制备，要接种9个试管。

所有试管的接种在30-35℃下进行不超过3天的时间。如果结果读取较为困难或者由于被测产品的性质而不确定 ，在同样的肉汤培养基内次培养，或者在大豆酪蛋白消化肉汤中相同温度下培养1-2天，使用此结果。从2.6.12.-4.测定每g或者每ml被测产品中最有可能的微生物数量。

结果和诠释

当验证“膜过滤法”或者“平板计数法”的适用性时，其任意一个试验菌株的试验结果的平均值应在按“接种与稀释”定义制得的无样品参与的对照组获得的数值的2倍范围内。当验证MPN法时，其接种所得的计算值应在对照组测试结果的95%的置信区间内。 如果所用方法中的任意一种或多种微生物测得结果不符合上述准则，则选择与标准最接近的方法和实验条件用于产品检测。

产品检测

检验量

除非另有规定，取10g或者10ml的产品用于检测。对于液体或者固体喷雾剂，抽取 10个容器的样品。对于贴剂，取样10贴。

如果满足以下条件的活性物质可以减少其检验量：每个剂量（如：片剂，胶囊剂，注射剂）的总量不超过1mg或每g/每ml样品中所含的剂量少于1mg。在这样的情况下，检验量不少于十份单位剂量或产品的10g或10ml。

对于取样量被限制或产品的批量极小（如小于1000ml或1000g）的活性物质，其检验量应为批量的1%，除非有特别规定或已修改且经批准时可以减少检验量。

对于一批总量少于200的产品（例如用于临床试验），检验量可减少到2个单位。若批量少于100时，可减少到1个单位。

从大批量或者可用制剂容器内随机取样。为了获得要求的检验量，可混合足量的小批量药品后再取样。

产品检验

膜过滤法

使用可以转移过滤膜至培养基的过滤装置。按照“促生长试验和计数方法的适用性”所描述的其中一种方法制备样品，然后取适量样品至过滤器内，每份样品制两张过滤膜，立即过滤。用适宜的方法冲洗滤器。 对于总需氧菌数（TAMC）的测定，转移其中一张滤膜至酪蛋白大豆琼脂培养基的表面。对于酵母菌和霉菌总数（TYMC）的测定，转移另一个滤膜至沙氏-葡萄糖琼脂培养基的表面。将酪蛋白大豆琼脂培养基在30-35℃条件下培养3-5天，将沙氏-葡萄糖琼脂培养基在20-25℃条件下培养5-7天。计算每g或者每ml产品的cfu值。

当测定透皮贴剂，将4-5-1中所制备的样取10%的体积进行过滤，且每一个样制2张滤膜。一张放在酪蛋白大豆琼脂培养基上进行总需氧菌计数，另一张放在沙氏-葡萄糖琼脂培养基上进行总酵母菌和霉菌计数。

平板计数法

倒平板法——按照“促生长试验和计数方法的适用性”所描述的其中一种方法制备样品。每 一个稀释级样品的每种培养基至少制备两个培养皿。将酪蛋白大豆琼脂培养基在30-35℃条 件下培养3-5天。沙氏-葡萄糖琼脂培养基在20-25℃条件下培养5-7天。根据给定的稀释剂 和生长菌落数少于250个（总需氧菌数）或50个（酵母菌和霉菌总数）来选择平板。用算 术平均数计算培养基上菌落数并计算每g或者每ml的产品的cfu值。

表面扩散法——按照“促生长试验和计数方法的适用性”所描述的其中一种方法制备样品。 每一个稀释级样品的每种培养基至少制备两个培养皿。培养和计算cfu值同倒平板法。

最大可能数法

用章节4描述适宜的方法来制备和稀释样品。培养所有试管在30-35℃条件下3-5天。如果需要进行次培养，使用表现适宜的程序进行。记录每个稀释水平表现为微生物生长的试管编号。根据2.6.12.-4来测定每克或者每毫升被测产品的微生物最可能数。

表2.6.12.-3.-微生物的最有可能数量（略）

结果的诠释

总需氧菌数（TAMC）为酪蛋白大豆琼脂培养基上的cfu值；如果有真菌在此培养基中生长时，把它算入总需氧菌数（TAMC）内。酵母菌和霉菌总数（TYMC）为沙氏-葡萄糖琼脂培养基上的cfu值；如果这个培养基上的细菌生长时，把它算入酵母菌和霉菌总数（TYMC）内。当酵母菌和霉菌总数（TYMC）由于细菌的生长而超过了可接受标准时，在沙氏-葡萄糖琼脂培养基中加入抗生素。如果计数是通过MPN进行的，那么计算所得的值是总需氧菌数（TAMC）。

当有叙述微生物可接受的标准时，那么根据以下内容解释： -101CFU：最大可接受值=20 -102CFU：最大可接受值=200

-103CFU：最大可接受值=2000，等等以此类推

建议的溶液和培养基在章节“62 特殊菌种的检测“中有描述。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/4b9v.html