ncRNA(非编码RNA)的知识

ncRNA(非编码RNA)的知识z

2010-07-31 10:36:54| 分类： Biology | 标签：rna |举报|字号 订阅

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一、核糖核酸（RNA） 二、转运RNA(tRNA) 三、信使RNA(mRNA) 四、核糖体RNA（rRNA） 五、小核RNA（snRNA） 六、RNA干扰（RNAi） 七、反义RNA（atRNA） 八、核仁小分子RNA（snoRNA） 九、细胞质小分子RNA(scRNA) 十、不均一核RNA（hnRNA）

十一、干扰mRNA的互补RNA(miRNA) 十二、非编码RNA（ncRNA） 十三、短发夹RNA(shRNA) 十四、短干扰RNA(siRNA) 十五、核酸酶（RNase）

十六、核糖核酸酶抑制剂（RNasin） 十七、向导RNA（gRNA） 一、核糖核酸（RNA） 1 概述

核糖核酸(RiboNucleic Acid ) ，简称RNA。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸，因含核糖而得名。RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。RNA一般是单链线形分子，也有双链的如呼肠孤病毒RNA；环状单链的如类病毒RNA，1983年还发现了有支链的RNA分子。

在RNA病毒中，RNA是遗传物质，植物病毒总是含RNA。近些年在植物中陆

续发现一些比病毒还小得多的浸染性致病因子，叫做类病毒。类病毒是不含蛋白质的闭环单链RNA分子，此外，真核细胞中还有两类RNA，即不均一核RNA（hnRNA）和小核RNA（snRNA）。hnRNA是mRNA的前体，snRNA参与hnRNA的剪接（一种加工过程）。自1965年酵母丙氨酸tRNA的碱基序列确定以后，RNA序列测定方法不断得到改进。目前除多种tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA等较小的RNA外，尚有一些病毒RNA、mRNA及较大RNA的一级结构测定已完成，如噬菌体MS2RNA含3569个核苷酸。

1982年以来，研究表明：不少RNA，如I、II型内含子，RNase P，HDV，核糖体大亚基RNA等等有催化生化反应过程的活性，即具有酶的活性，这类RNA被称为核酶（ribozyme）。

20世纪90年代以来，又发现了RNAi（RNA interference，RNA干扰）等等现象，证明RNA在基因表达调控中起到重要作用。 2 种类

在生物体内发现主要有三种不同的RNA分子在基因的表达过程中起重要的作用，它们是信使RNA（messenger RNA，mRNA）、转移（tranfer RNA，tRNA）、核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）。RNA含有四种基本碱基，即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，此外还有几十种稀有碱基。 3 结构

1965年R.W.霍利等测定了第 1个核酸──酵母丙氨酸转移核糖核酸的一级结构即核苷酸的排列顺序。此后，RNA一级结构的测定有了迅速的发展。到1983年,不同来源和接受不同氨基酸的tRNA已经弄清楚一级结构的超过280种,5S RNA 175种，5.8S RNA也有几十种，以及许多16S rRNA、18S rRNA、23S rRNA和26S rRNA。在mRNA中，如哺乳类珠蛋白mRNA、鸡卵清蛋白mRNA和许多蛋白质激素和酶的mRNA等也弄清楚了。此外还测定了一些小分子RNA，如sn RNA和病毒感染后产生的RNA的核苷酸排列顺序。类病毒RNA也有5种已知的一级结构，它们都是环状单链；MJS2RNA、烟草花叶病毒 RNA、小儿麻痹症病毒RNA是已知结构中比较大的RNA。

RNA的一级结构主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四种核糖核苷酸通过3'，5'磷酸二酯键相连而成的多聚核苷酸链。天然RNA的二级结构，一般并不像DNA那样都是双螺旋结构，只有在一些区段可发生自身回折，使部分A-U、G-C碱基配对，从而形成短的不规则的螺旋区。不配对的碱基区膨出形成环，而被排斥在双螺旋之外。例如：tRNA的三叶草结构。RNA的三级结构，其中研究得最清楚的是tRNA，1974年用X射线衍射研究酵母苯丙氨酸tRNA的晶体，已确定它

的立体结构呈倒L形。 RNA中双螺旋结构的稳定因素，也主要是碱基的堆砌力，其次才是氢键。每一段双螺旋区至少需要4～6对碱基对才能保持稳定。在不同的RNA中，双螺旋区所占比例不同。细胞内有三类主要的核糖核酸，即：mRNA、rRNA、tRNA。它们各有特点。在大多数细胞中RNA的含量比DNA多5～8倍。 RNA 一级结构的测定常利用一些具有碱基专一性的工具酶，将RNA降解成寡核苷酸,然后根据两种(或更多)不同工具酶交叉分解的结果，测出重叠部分,来决定RNA的一级结构。举例如下： 9核苷酸 AGUCGGUAG

工具酶 牛胰核糖核酸酶 高峰淀粉酶核糖核酸酶T1 (RNase A) (RNase T1)

降解结果 AGU+C+GGU+AG AG+UCG+G+UAG

结果分析 1、牛胰核糖核酸酶是一个内切核酸酶，专一地切在嘧啶核苷酸的3′-磷酸和其相邻核苷酸的5′-羟基之间，所以用它来分解上述9核苷酸，得到AGU、C、GGU和AG 4个产物。

2、核糖核酸酶 T1是一个专一地切在鸟苷酸的3′-磷酸和其相邻核苷酸的5′-羟基之间的内切核酸酶，它作用于上述9核苷酸，则得到AG、UCG、G和UAG 4个产物。

因此，根据产物的性质，就可以排列出9核苷酸的一级结构。

除上述两种核糖核酸酶外，还有黑粉菌核糖核酸酶(RNase U2)，专一地切在腺苷酸和鸟苷酸处，和高峰淀粉酶核糖核酸酶T1联合使用,可以测定腺苷酸在RNA中的位置。多头绒孢菌核糖核酸酶(RNase Phy)除了CpN以外的二核苷酸都能较快地水解，因此和牛胰核糖核酸酶合用可以区别Cp和Up在RNA中的位置。 4 功能

20世纪40年代，人们从细胞化学和紫外光细胞光谱法观察到凡是 RNA含量丰富的组织中蛋白质的含量也较多,就推测RNA和蛋白质生物合成有关。RNA 参与蛋白质生物合成过程的有 3类RNA，分别是：转移核糖核酸(tRNA)、信使核糖核酸(mRNA)和核糖体核糖核酸(rRNA)。

不同的RNA有其不同的功能，其中rRNA是核糖体的组成成分，由细胞核中的核仁合成，而mRNA、 tRNA 在蛋白质合成的不同阶段分别执行着不同功能。mRNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息传递过程中的桥梁。tRNA的是携带符合要求的氨基酸，以连接成肽链，再经过加工形成蛋白质。

二、转运RNA(tRNA) 1 概述

转运RNA（transfer ribonucleic acid），简称tRNA，是具有携带并转运氨基酸功能的一类小分子核糖核酸。绝大多数tRNA由七十几至九十几个核苷酸组成，分子量为25000～30000，沉降常数约为4S（个别tRNA的沉降常数为3S，含63个核苷酸）。曾用名有联接RNA、可溶性RNA、pH5RNA等。 2 种类

一种tRNA只能携带一种氨基酸，如丙氨酸tRNA只携带丙氨酸，但一种氨基酸可被不止一种tRNA携带。同一生物中，携带同一种氨基酸的不同tRNA称作―同功受体tRNA‖。组成蛋白质的氨基酸有20种，而tRNA可以有六七十种或更多。携带同一种氨基酸的细胞器tRNA与细胞质tRNA也不一样。生物体发生突变后，校正机制之一是通过校正基因合成一类校正tRNA，以维持翻译作用译码的相对正确性。可以有多种校正tRNA携带同一种氨基酸。 3 结构

tRNA的分子由一条长70~90个核苷酸并折叠成三叶草形的短链组成的。上图中有两种不同的分子，苯丙氨酸tRNA和天冬氨酸tRNA。tRNA链的两个末端在图上方指出的L形结构的末端互相接近，氨基酸在箭头示意的位置被连接，在这条链的中央形成了L形臂，如图下方所示，露出了形成反密码子的三个核苷酸。三叶草结构的其余两环被包裹成肘状，在那里它们提供整个分子的结构。四个常见RNA碱基---腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶显然不能提供足够的空间以形成一个坚固的结构，因为这些碱基大部分被修饰过以延长它们的结构。但是，有两个奇特的例子，看37号反密码子相邻的碱基，位于甲硫氨酸tRNA（1yfg）或苯丙氨酸tRNA(4tna和6tna)的起始部位。

一般情况下，二级结构具有以下几个共同点： ① 5’末端具有G（大部分）或C。 ② 3’末端都以ACC的顺序终结。 ③ 有一个富有鸟嘌呤的环。

④ 有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。

⑤ 有一个胸腺嘧啶环。

自从1965年R．W．霍利等首次测出酵母丙氨酸tRNA的一级结构即核苷酸排列顺序以来，到1983年已有200多个tRNA（包括不同生物来源、不同器官、细胞器的同功受体tRNA以及校正tRNA）的一级结构被阐明。按照A－U、G－C以及G－U碱基配对原则，除个别例外，tRNA分子均可排布成三叶草模型的二级结构（图1）。它由3个环，即D环〔因该处二氢尿苷酸（D）含量高〕、反密码环（该环中部为反密码子）和TΨC环〔因绝大多数tRNA在该处含胸苷酸（T）、假尿苷酸（Ψ）、胞苷酸（C）顺序〕，四个茎，即D茎（与D环联接的茎）、反密码茎（与反密码环联接）、TΨC茎（与 TΨC环联接）和氨基酸接受茎〔也叫CCA茎，因所有tRNA的分子末端均含胞苷酸（C）、胞苷酸（C）、腺苷酸（A）顺序， CCA是连接氨基酸所不可缺少的〕，以及位于反密码茎与TΨC茎之间的可变臂构成。不同tRNA的可变臂长短不一，核苷酸数从二至十几不等。除可变臂和D环外，其他各个部位的核苷酸数目和碱基对基本上是恒定的。图1也示出tRNA分子中出现的保守或半保守成分，这些成分对维系tRNA的三级结构是很重要的。

tRNA的结构特征之一是含有较多的修饰成分，如上面提到的 D、T、 Ψ等；核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。

1974年用X射线晶体衍射法测出第一个tRNA——酵母苯丙氨酸tRNA晶体的三维结构，分子全貌象倒写的英文字母L，呈扁平状，长60埃，厚20埃（图2），它是在tRNA二级结构基础上，通过氨基酸接受茎与TΨC茎以及D茎与反密码茎间折叠成右手反平行双螺旋。tRNA三级结构由保守或半保守成分与构成二级结构的核苷酸之间形成氢键（称三级结构氢键）维系。其他tRNA晶体的三维结构类似酵母苯丙氨酸tRNA，只是某些参数有所不同。tRNA在溶液中的构型与其晶体结构一致。 4 功能

tRNA的功能主要是携带氨基酸进入核糖体，在mRNA指导下合成蛋白质。即以mRNA为模板，将其中具有密码意义的核苷酸顺序翻译成蛋白质中的氨基酸顺序。

tRNA与mRNA是通过反密码子与密码子相互作用而发生关系的。在肽链生成过程中，其中第一个进入核糖体与mRNA起始密码子结合的tRNA叫起始tRNA，其余tRNA参与肽链延伸，称为延伸tRNA，按照mRNA上密码的排列，携带特定氨基酸的tRNA依次进入核糖体。形成肽链后，tRNA即从核糖体释放出来，整个过程叫做tRNA循环（图3）。tRNA靠反密码子与mRNA识别，但并非一种反密码子只能识别一种密码子。例如反密码子CIG（I是次黄嘌呤核苷酸）能识别三种密码子。一般反密码子中的稀有核苷酸因配对不严格而能识别多种密码子，这种现象在生物学中称为―摆动性‖。tRNA是通过分子中3′端的CCA携带氨基酸的。然后氨基酸连接在腺苷酸的2′或3′OH基上，携带了氨基酸的tRNA叫氨酰tRNA，例如，携带甘氨酸的tRNA叫甘氨酰tRNA。氨基酸与tRNA的结合由氨酰tRNA合成酶催化，分二步进行：①氨基酸+ATP→氨酰-AMP+焦磷酸；②氨酰-AMP＋tRNA→氨酰-tRNA＋AMP。与一种氨基酸对应的至少有一种tRNA和一种氨酰-tRNA合成酶。

tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。在许多植物病毒RNA分子中发现有类似于tRNA的三叶草结构，有的也能接受氨基酸，其功能不详。 5 合成

生物合成：在生物体内，DNA分子上的tRNA基因经过转录生成tRNA前体，然后被加工成成熟的tRNA。

tRNA前体的加工包括：切除前体分子中两端或内部的多余核苷酸，形成tRNA成熟分子所具有的修饰核苷酸；如果前体分子3′端缺乏CCA顺序，则需补加上CCA末端。加工过程都是在酶催化下进行的。

人工合成：1981年，中国科学家王德宝等用化学和酶促合成相结合的方法首次全合成了酵母丙氨酸tRNA。它由76个核苷酸组成，其中包括天然分子中的全部修饰成分，产物具与天然分子相似的生物活性。 三、信使RNA(mRNA) 1 概述

生物的遗传信息主要贮存于DNA的碱基序列中，但DNA并不直接决定蛋白质的合成。而在真核细胞中，DNA主要贮存于细胞核中的染色体上，而蛋白质的合成场所存在于细胞质中的核糖体上，因此需要有一种中介物质，才能把DNA

上控制蛋白质合成的遗传信息传递给核糖体。现已证明，这种中介物质是一种特殊的RNA。这种RNA起着传递遗传信息的作用，因而称为信使RNA(messenger RNA)，简称mRNA。

mRNA的功能就是把DNA上的遗传信息精确无误地转录下来，然后再由mRNA的碱基顺序决定蛋白质的氨基酸顺序，完成基因表达过程中的遗传信息传递过程。在真核生物中，转录形成的前体RNA中含有大量非编码序列，大约只有25%序列经加工成为mRNA，最后翻译为蛋白质。因此，原核生物与真核生物的mRNA不同，以下为原核生物和真核生物mRNA不同的特点： ① 原核生物mRNA常以多顺反子的形式存在。 真核生物mRNA一般以单顺反子的形式存在。 ② 原核生物mRNA的转录与翻译一般是偶联的。

真核生物转录的mRNA前体则需经转录后加工，加工为成熟的mRNA与蛋白质结合生成信息体后才开始工作 。

③ 原核生物mRNA半寿期很短，一般为几分钟 ，最长只有数小时（RNA噬菌体中的RNA除外）。

真核生物mRNA的半寿期较长， 如胚胎中的mRNA可达数日。 ④原核与真核生物mRNA的结构特点也不同。

a、 原核生物mRNA一般5′端有一段不翻译区，称前导顺序，3′端有一段不翻译区，中间是蛋白质的编码区，一般编码几种蛋白质。

真核生物mRNA（细胞质中的）一般由5′端帽子结构、5′端不翻译区、翻译区（编码区）、3′端不翻译区和3′端聚腺苷酸尾巴构成分子中除m7G构成帽子外，常含有其他修饰核苷酸，如m6A等。并且，真核生物mRNA通常都有相应的前体。从DNA转录产生的原始转录产物可称作原始前体（或mRNA前体）。一般认为原始前体要经过hnRNA核不均-RNA的阶段，最终才被加工为成熟的mRNA。 b、 通常mRNA（单链）分子自身回折产生许多双链结构。原核生物，经计算有66.4％的核苷酸以双链结构的形式存在。

真核生物mRNA也具有丰富的二级结构，折叠起来的mRNA二级结构有利于蛋白质合成的启动，以后mRNA处于伸展的状态则有利于转译的继续。 mRNA的复制，转录和翻译：由一个DNA分子，边解旋，边转录。利用细胞核内部的游离核糖核苷酸和成其需要的碱基，规则遵循碱基互补配对原则。注：因为mRNA没有T（胸腺嘧啶），所以模版中出现A（腺嘌呤）时，有U(尿嘧啶）代替。以上过程叫做转录，在细胞核中完成。接着，mRNA穿过核孔。和细胞质中的核糖体结合。选择tRNA运输氨基酸，和对应的三个碱基排列好（如

何排列请查询：密码子）。再与其它的氨基酸通过肽键连接在一起，形成肽链。以上过程叫做翻译，在细胞质中完成。

虽然人们已经破译了决定生命基础的蛋白质的氨基酸合成密码，也知道了是ＤＮＡ携带着这种密码，但是，根据细胞学所掌握的事实：所有ＤＮＡ都呆在细胞核内，而蛋白质却存在于细胞质中，像ＤＮＡ这样的大分子是无法随意进入细胞质的。然而密码总是会被带入细胞质的，这一来，人们不禁要问，是谁把锁在细胞核内的ＤＮＡ手里的密码带入了细胞质的呢？科学家们从ＤＮＡ那里拷贝了一份密码文件，并带入了细胞质中。经过试验和观察，发现这个信使就是ＲＮＡ——核糖核酸。 2 信使RNA的发现

储存在DNA分子中的这种遗传信息能在复制中产生更多的拷贝，并翻译成蛋白质。DNA的功能构成了信息的流动，遗传信息如何转变成蛋白质呢？转录就是其中的重要的一环。基因表达时以DNA的一条链为模板合成RNA，这一过程就是转录（transcription）。催化合成RNA的酶叫做RNA聚合酶（RNA polymerase）。 RNA和DNA结构相似，所不同之处在于：（1）RNA一般以单链形式存在；（2）RNA中的核糖其C′-2不脱氧的；（3）尿苷（U）取代了DNA中的胸苷。细胞中的RNA分成三种：mRNA（信使RNA），tRNA（转运RNA）和rRNA（核糖体RNA）。它们的功能各不相同。mRNA是合成蛋白质的模板，tRNA是转运特异氨基酸的运载工具，rRNA是合成蛋白质的装置。mRNA的碱基序列，决定着蛋白质装配时氨基酸的序列。

1955年Brachet用洋葱根尖和变形虫进行了实验：若加入RNA酶降解细胞中的RNA，则蛋白质合成就停止；若再加入从酵母中提取的RNA，则又可以重新合成一些蛋白质，这就表明，蛋白质的合成是依赖于RNA。同年Goldstein和Plaut用同位素标记变形虫（Amoeba proteus）RNA前体，发现标记的RNA都在核内，表明RNA是在核内合成的。在标记追踪（pulse-chase）实验中，用短脉冲标记RNA前体，然后将细胞核转移到未标记的变形虫中。经过一段时间发现被标记的RNA分子已在细胞质中，这就表明RNA在核中合成，然后转移到细胞质内，而蛋白质就在细胞质中合成，因此RNA就成为在DNA和蛋白质之间传递信息的信使的最佳候选者。

1956年Elliot Volkin和 Lawrence Astrachan作了一项很有意思的观察：当E.coli被T2感染，迅速停止了RNA的合成，但噬菌体的RNA却开始迅速合成。用同位素脉冲一追踪标记表明噬菌的RNA在很短的时间内就进行合成，但很快又消失了，表明RNA的半衰期是很短的。由于这种新合成的RNA的碱基比和

T2的DNA碱基比相似，而和细菌的碱基比不同，所以可以确定新合成的RNA是T2的RNA。由于T2感染细菌时注入的是DNA，而在细胞里合成的是RNA，可见DNA是合成RNA的模板。最令人信服的证据来自DNA-RNA的杂交实验。Hall.B.D和Spiegeman,S，将T2噬菌体感染E.coli后立即产生的RNA分离出来，分别与T2和E.coli的DNA进行分子杂交，结果发现这种RNA只能和T2的DNA杂交形成―杂种‖链，而不能和E.coli的DNA进行杂交。表明T2产生的这种RNA（即mRNA）至少和T2的DNA中的一条链是互补的。

Brenner,s. Jacob,F.和Meselson（1961）进行了一系列的的实验，他们将E.coli培养在15N/13C的培养基中，因此合成的RNA和蛋白都被―重‖同位素所标记。也就是说凡是―重‖的核糖体，RNA和蛋白都是细菌的，然后用T2感染E.coli，细菌的RNA停止合成，而开始合成T2的RNA此时用普通的―轻‖培养基（14N/12C），但分别以32P来标记新合成的T2 RNA，以35S标记新合成的T2蛋白，因此任何重新合成的核糖体、RNA，及蛋白都是―轻‖的但带有放射性同位素。经培养一段时间后破碎细胞，加入过量的轻的核糖体作对照，进行密度梯度离心，结果―轻‖的核糖体上不具有放射性，―重‖的核糖体上具有32P和35S，表明：（1）T2未合成核糖体，―轻‖核糖体却是后加放的。（2）T2翻译时是借用了细菌原来合成的核糖体，所以核糖体并无特异性，核糖体上结合的mRNA，其序列的特异性才是指导合成蛋白质的遗传信息，从而提出了mRNA作为―信使‖的证据。因此，他们将这种能把遗传信息从DNA传递到蛋白质上的物质称为―信使‖。他们预言：（1）这种―信使‖应是一个多核苷酸；（2）其平均分子量不小于5?105（假定密码比是3），足以携带一个基因的遗传信息；（3）它们至少是暂时连在核糖体上；（4）其碱基组成反映了DNA的序列；（5）它们能高速更新。Volkin和Astrachan发现高速更新的RNA似乎完全符合以上条件。Jacob和Monod将它定名为信使RNA（Messenger RNA），简称mRNA。 3 信使RNA的合成与加工 Ⅰ DNA转录生成RNA

转录分为起始、延长和终止三个阶段。起始包括对双链DNA特定部位的识别、局部（17bp）解链以及在最初两个核苷酸间形成磷酸二酯键。第一个核苷酸掺入的位置称为转录起点。起始后起始因子离开，核心酶构象改变，沿模板移动，转录生成杂交双链(12bp)，随后DNA互补链取代RNA链，恢复DNA双螺旋结构。延伸速度为50nt/s，酶移动17nm，错误几率为10-5。聚合酶到达终点时，在终止辅助因子的帮助下停止反应，酶和RNA链脱落，转录结束。 注：1、启动子和转录因子

（一）原核生物：大肠杆菌在起点上游约－10碱基对处有保守序列TATAAT，称为pribnow box，有助于局部解链。在其上游还有TTGACA，称为－35序列，提供RNA聚合酶识别的信号。

（二）真核生物：复杂，差异较大。

①信使RNA的启动子通常有三个保守区，－25到－30有TATA框，是解链位置，并决定转录起点；－75位置有CAAT框，与RNA聚合酶的结合有关；更上游还有GC框，某些转录因子可结合。后两个称为上游因子，对转录起始频率有较大影响。

② 小RNA的启动子在转录区内部，有一些辅助因子帮助RNA聚合酶识别。 2、终止子和终止因子

（一）所有原核生物的终止子在终点之前都有一个回文结构，可使酶减慢移动或暂停合成。大肠杆菌有两类终止子：

①简单终止子，回文区有一段富含GC对的序列，回文后有寡聚尿苷。 ②依赖ρ的终止子，必须在有ρ因子时才能发挥作用，不含GC对，也无寡聚尿苷。ρ因子是蛋白质，可与酶作用，释放RNA，并使酶脱离。

（二）某些因子可使酶越过终止子继续转录，称为通读。常见于某些噬菌体的时序控制，早期基因与晚期基因以终止子相隔，早期基因产生抗终止因子，使发生通读以表达晚期基因。 3、转录的调控

（一）遗传信息的表达有时序调控和适应调控，转录水平的调控是关键环节，因为这是表达的第一步。转录调控主要发生在起始和终止阶段。

（二）操纵子是细菌基因表达和调控的单位，有正调节和负调节因子。阻遏蛋白的作用属于负调控。环腺苷酸通过其受体蛋白（CRP）促进转录，可促进许多诱导酶的合成。操纵子可构成综合性调控网络，如SOS反应等。对终止子也有调控作用，如衰减子。

（三）真核生物不组成操纵子，而是通过激素、生长因子等进行调控。某些DNA序列对转录起增强作用，称为增强子。 Ⅱ 转录后加工 一、原核生物

（一）核糖体RNA：大肠杆菌共有7个核糖体RNA的转录单位，每个转录单位由16S、23S、5SRNA和若干转运RNA基因组成。16S和23S之间常由转运RNA隔开。转录产物在RNA酶III的作用下裂解产生核糖体RNA的前体P16和P23，再由相应成熟酶加工切除附加序列。前体加工时还进行甲基化，产

生修饰成分，特别是a-甲基核苷。N4,2’-O二甲基胞苷(m4Cm)是16S核糖体RNA特有成分。5S核糖体RNA一般无修饰成分。 （二）转运RNA：有60个基因，其加工包括：

1、内切酶在两端切断，大肠杆菌RNA酶P是5’成熟酶。 2、外切酶从3’修剪，除去附加顺序。RNA酶D是3’成熟酶。

3、3’端加上CCAOH，由转运RNA核苷酰转移酶催化，某些转运RNA已有，切除附加序列后即露出。

4、核苷的修饰：修饰成分包括甲基化碱基和假尿苷，修饰酶具有高度特异性。甲基化对碱基和序列都有严格要求，一般以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体。 （三）信使RNA：细菌多数不用加工，转录与翻译是偶联的。也有少数多顺反子信使RNA必须由内切酶切成较小的单位，然后翻译。如核糖体大亚基蛋白与RNA聚合酶的b亚基基因组成混合操纵子，转录后需经RNA酶Ⅲ切开，各自翻译。因为RNA聚合酶的合成水平低得多，切开有利于各自的翻译调控。较长的RNA会产生高级结构，不利于翻译，切开可改变其结构，从而影响其功能。

二、真核生物

（一）核糖体RNA：基因拷贝数多，在几十到几千之间。基因成簇排列在一起，由RNA聚合酶I转录生成一个较长的前体，哺乳动物为45S。核仁是其转录、加工和装配成核糖体的场所。RNA酶III等核酸内切酶在加工中起重要作用。5SRNA基因也是成簇排列的，由RNA聚合酶III转录，经加工参与构成大亚基。核糖体RNA可被甲基化，主要在核苷2’羟基，比原核生物甲基化程度高。多数核糖体RNA没有内含子，有些有内含子但不转录。

（二）转运RNA：由RNA聚合酶III转录，加工与原核相似，但3’端的CCA都是后加的，还有2’-O-甲基核糖。

（三）信使RNA：真核生物编码蛋白质的基因以单个基因为转录单位，但有内含子，需切除。信使RNA的原初转录产物是分子量很大的前体，在核内加工时形成大小不等的中间物，称为核内不均一RNA(hnRNA)。其加工过程包括： 1、5’端加帽子：在转录的早期或转录终止前已经形成。首先从5’端脱去一个磷酸，再与GTP生成5’，5’三磷酸相连的键，最后以S-腺苷甲硫氨酸进行甲基化，形成帽子结构。帽子结构有多种，起识别和稳定作用。

2、 3’端加尾：在核内完成。先由RNA酶III在3’端切断，再由多聚腺苷酸聚合酶加尾。尾与通过核膜有关，还可防止核酸外切酶降解。

3、 内部甲基化：主要是6-甲基腺嘌呤，在hnRNA中已经存在。可能对前

体的加工起识别作用。 三、RNA的拼接

（一）转运RNA的拼接：由酶催化，酶识别共同的二级结构，而不是序列。通常内含子插入到靠近反密码子处，与反密码子配对，取代反密码子环。第一步由内切酶切除插入序列，不需ATP；第二步由RNA连接酶连接，需要ATP。 （二）四膜虫核糖体RNA的拼接：某些四膜虫26S核糖体RNA基因中有一个内含子，其拼接只需一价和二价阳离子及鸟苷酸或鸟苷存在即可自发进行。其实质是磷酸酯的转移反应，鸟苷酸起辅助因子的作用，提供游离3’羟基。 （三）信使RNA：真核生物编码蛋白质的核基因的内含子属于第二类内含子，左端为GT，右端为AG。先在左端切开，产生的5’末端与3’端上游形成5’,2’-磷酸二酯键，构成套索结构。然后内含子右端切开，两个外显子连接起来。通过不同的拼接方式，可形成不同的信使RNA。 Ⅲ RNA的复制

一、噬菌体QbRNA的复制

其RNA是单链，正链，侵入大肠杆菌后立即翻译，产生复制酶的b亚基，与宿主的三个亚基(α为核糖体蛋白，γ、δ均为肽链延长因子)构成复制酶，进行复制。先以正链为模板合成负链，再根据负链合成正链。合成负链时需要宿主的两个蛋白因子，合成正链则不需要，所以可大量合成。病毒的蛋白质合成受RNA高级结构的调控。

二、病毒RNA复制的主要方式

（一）病毒含正链RNA，先合成复制酶，复制后合成其他蛋白质进行装配。如噬菌体Qb及灰质炎病毒。

（二）病毒含负链和复制酶，先合成正链，再合成病毒蛋白和复制病毒RNA。如狂犬病毒。

（三）病毒含双链RNA和复制酶，如呼肠孤病毒。先复制正链，再翻译成病毒蛋白，最后合成负链，形成双链RNA分子。

（四）致癌RNA病毒：如白血病病毒和肉瘤病毒，先逆转录生成DNA前病毒，再转录、翻译。 ⅩRNA生物合成的抑制剂 一、碱基类似物

有些人工合成的碱基类似物能干扰和抑制核酸的合成。作用方式有以下两类： （一）作为代谢拮抗物，直接抑制核苷酸生物合成有关酶类。如6-巯基嘌呤进入体内后可转变为巯基嘌呤核苷酸，抑制嘌呤核苷酸的合成。可作为抗癌药

物，治疗急性白血病等。此类物质一般需转变为相应的核苷酸才能表现出抑制作用。

（二）进入核酸分子，形成异常RNA或DNA，影响核酸的功能并导致突变。5-氟尿嘧啶类似尿嘧啶，可进入RNA，与腺嘌呤配对或异构成烯醇式与鸟嘌呤配对，使A-T对转变为G-C对。因为正常细胞可将其分解，而癌细胞不能，所以可选择性抑制癌细胞生长。 二、DNA模板功能抑制物

（一）烷化剂：带有活性烷基，能使DNA烷基化。鸟嘌呤烷化后易脱落，双功能烷化剂可造成双链交联，磷酸基烷化可导致DNA链断裂。通常有较大毒性，引起突变或致癌。

（二）放线菌素类：可与DNA形成非共价复合物，抑制其模板功能。包括一些抗癌抗生素。

（三）嵌入染料：含有扁平芳香族发色团，可插入双链DNA相邻碱基对之间。常含丫啶或菲啶环，与碱基大小类似，可在复制时增加一个核苷酸，导致移码突变。如溴乙啶。 三、RNA聚合酶抑制剂

（一）利福霉素：抑制细菌RNA聚合酶活性。

（二）利链菌素：与细菌RNA聚合酶b亚基结合，抑制RNA链的延长。 a-鹅膏蕈碱：抑制真核生物RNA聚合酶。 4 信使RNA的结构与功能

从DNA转录合成的带有遗传信息的一类单链RNA，它在上作为蛋白质合成的模板，决定肽链的排列顺序。1961年F.雅各布和根据大肠杆菌诱导酶生成的实验结果提出：信息从DNA到蛋白质之间的转移，必需有一种RNA起传递作用，由此提出了信使核糖核酸的名称。

生物体内的每种多肽链都由特定的mRNA编码，所以细胞内mRNA的种类很多，但通常每种mRNA的拷贝数极少（1～10个）。根据信息密码学说，3个连续的核苷酸可以编码一个氨基酸,因此从已知mRNA（或DNA）核苷酸顺序可以准确推导出蛋白质的一级结构。

存在范围和性质mRNA存在于原核和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器中。RNA既是遗传信息的载体又具有mRNA的功能。生物体mRNA种类的多少与生物进化水平有关,高等生物所含的遗传信息多,mRNA的种类也多。生物体内某种mRNA的含量根据需要而有不同，如5龄蚕后部丝腺体的主要任务是快速合成大量丝心蛋白，因而编码丝心蛋白的mRNA含量特别多。有些细

菌需要不断适应外部环境，其体内编码某些诱导酶的mRNA的含量也较多。 一级结构与功能的关系 原核生物mRNA一般5＇端有一段不翻译区，称前导顺序，3＇端有一段不翻译区，中间是蛋白质的编码区，一般编码几种蛋白质。如大肠杆菌乳糖操纵子mRNA编码3条多肽链；色氨酸操纵子mRNA编码5条多肽链。也有单顺反子形式的细菌mRNA，如大肠杆菌脂蛋白mRNA。原核生物mRNA分子中一般没有修饰核苷酸，也没有5＇端帽子结构和3＇端聚腺苷酸尾巴。在原核生物mRNA的起始密码子(AUG)附近（5＇方向上游）的一小段长短不等的顺序，含有较多的嘌呤核苷酸，被称为SD顺序。它能和核糖体小亚基上的16SrRNA的3＇端富含嘧啶核苷酸的区域配对结合，有助于带有甲酰甲硫氨酸的起始tRNA识别mRNA上的起始密码(AUG)，使肽链合成从此开始。这段顺序是1974年由J.夏因和L.达尔加诺发现的，所以称为SD顺序，也称核糖体结合部位。原核生物mRNA的编码区一般编码几种功能上相关联的蛋白质，两种蛋白质的编码区之间常有一小段不翻译的顺序，叫做间隔区。有的噬菌体RNA中2个相邻的顺反子共用一段相同的编码顺序，例如，M 噬菌体RNA中的溶菌蛋白编码区共225个核苷酸中有189个核苷酸是由相邻两个蛋白质共用的。原核mRNA与真核mRNA一样使用同一套三联体密码子（真核生物线粒体mRNA有例外）。原核生物合成氨基酸的操纵子mRNA的5＇ 端前导顺序上有一段顺序称作弱化子。弱化子具有两种可以互变的构象，其中一种构象是转录终止的信号，能使转录中止（或衰减）。衰减调节是原核生物合成氨基酸的调控方式之一。

真核生物 mRNA（细胞质中的）一般由5＇端帽子结构、5＇端不翻译区、翻译区（编码区）、3＇端不翻译区和3＇端聚腺苷酸尾巴构成。 分子中除 G构成帽子外，常含有其他修饰核苷酸，如 A等。5＇端帽子结构通常有3种类型，即： G（5＇）ppp(5＇)N； G(5＇)ppp(5＇) N和 G(5＇)ppp（5＇） N。真核细胞线粒体中的mRNA无帽子结构。一般认为帽子的功能与翻译的启动有关。许多真核生物 mRNA(如珠蛋白mRNA)除去帽子后翻译效率大大降低。5＇端不翻译区，也叫前导顺序。不同的真核mRNA的前导顺序长度不同，有的只有10个核苷酸,有的则有200个核苷酸。与原核mRNA相似,真核mRNA5＇端不翻译区中常有一段顺序与核糖体小亚基上的18SrRNA的3＇端的一段顺序互补并结合，这种结合与真核mRNA的翻译启动有关。

翻译区(编码区)使用的密码子除线粒体（如人、牛和酵母线粒体）外与原核生物mRNA是一样的。真核生物mRNA的起始密码子都是AUG。 真核和原核生物mRNA使用的密码子也都有―简并现象‖，即几种不同的密码子翻译出同一

种氨基酸，但不同的mRNA中简并密码子的利用率是不同的，真核与原核生物之间的差别就更大。mRNA的终止密码子有3个（UAG、UGA和UAA），其功能是停止翻译，一般只用一个终止密码子就能使翻译停止。有的mRNA有2个连续的终止密码子。3＇端不翻译区的长短在不同的mRNA上有所不同，β珠蛋白mRNA只有39个核苷酸,而卵白蛋白mRNA则有637个核苷酸。真核生物mRNA3＇端不翻译区常有 AAUAA(A)或AUUUA(A)等顺序，它们和识别多聚A聚合酶及装配多聚A尾巴有关。除个别组蛋白mRNA外，真核生物mRNA3＇端均有多聚A尾巴 3＇端多聚A尾巴的长度随来源不同而不同,且随mRNA的老化而变短,通常有20～200个A。多聚A与mRNA稳定性及mRNA从细胞核转到细胞浆中有关。

真核生物mRNA通常都有相应的前体。 从DNA转录产生的原始转录产物可称作原始前体（或mRNA前体）。 一般认为原始前体要经过hnRNA核不均-RNA的阶段，最终才被加工为成熟的 mRNA。hnRNA上的蛋白质编码区被一些居间顺序分隔成若干段；不同的基因转录产物所含的居间顺序的数目不同，人胰岛素只有两个，而牛眼的晶体蛋白则含有数十个；居间顺序的长短也各不相同，从数十个到上千个核苷酸（鸡卵白蛋白有一个1550个核苷酸的居间顺序）。居间顺序将在剪接过程中去除。约有10～40％的hnRNA含有3′端多聚A尾巴。hnRNA经过进一步加工切除居间顺序并把分隔的蛋白质编码区连接起来，最终成为成熟的mRNA。

二级结构与功能的关系 通常mRNA(单链)分子自身回折产生许多双链结构。原核生物,例如M 噬菌体RNA外壳蛋白编码区，经计算有66.4％的核苷酸以双链结构的形式存在。M RNA能翻译4种蛋白质，但效率各不相同。在通常条件下翻译外壳蛋白(其编码区在成熟蛋白的下游)的效率高于成熟蛋白的效率。但用甲醛处理M RNA破坏二级结构后，则翻译成熟蛋白的效率提高。噬菌体M RNA中外壳蛋白的起始密码子 AUG(1335～1337)通常处于环(Loop)的顶端，暴露在外面，因而易于与翻译的启动因子结合而进行翻译。成熟蛋白的编码区尽管处在外壳蛋白的前面，但其起始密码子GUG(130～132)却埋在二级结构之中，故翻译效率低，只有将二级结构松开（如甲醛处理）之后才能被翻译。可见mRNA分子的二级结构对翻译蛋白质的效率有很大影响。

真核生物mRNA也具有丰富的二级结构，如鸭珠蛋白mRNA和兔珠蛋白mRNA分别有45～60％和55～62％的核苷酸残基处在碱基配对之中。在真核生物蛋白质启动复合物中,40S核糖体实际上覆盖着mRNA上包括帽子结构在内的50～54个核苷酸,但是40S核糖体的大小比50个核苷酸的长度小得多 由于

形成的发夹结构(二级结构使帽子与起始密码子之间的空间距离缩短)，造成40S核糖体能够覆盖包括帽子结构和起始密码子 AUG在内的50多个核苷酸，从而启动蛋白质合成。不同的mRNA中发夹结构的有无或多少各不相同。在蛋白质合成肽链继续延伸时，不需要帽子结构参加，此时核糖体覆盖的mRNA的区域约为25～35个核苷酸，mRNA的构象已不同于启动阶段而是处于一种伸展的状态，从而有利于转译的延续。可见，折叠起来的mRNA二级结构有利于蛋白质合成的启动，以后mRNA处于伸展的状态则有利于转译的继续。 5 信使RNA与密码子

遗传信息从DNA分子转录到RNA分子中的过程称为转录（transcription）。在真核生物中，最初转录生成的RNA称为不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA），然而在细胞浆中起作用，作为蛋白质的氨基酸序列合成模板的是mRNA（messenger RNA）。hnRNA是mRNA的未成熟前体。两者之间的差别主要有两点：一是hnRNA核苷酸链中的一些片段将不出现于相应的mRNA中，这些片段称为内含子（intron），而那些保留于mRNA中的片段称为外显子（exon）。也就是说，hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接，被去掉了一些片段，余下的片段被重新连接在一起；二是mRNA的5′末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA3′末端多了一个多聚腺苷酸（polyA）尾巴。mRNA从5′末端到3′末端的结构依次是5′帽子结构，5′末端非编码区，决定多肽氨基酸序列的编码区，3′末端非编码区，和多聚腺苷酸尾巴。多聚腺苷酸尾一般由数十个至一百几十个腺苷酸连接而成。随着mRNA存在时间的延续，这段聚A尾巴慢慢变短。因此，目前认为这种3′末端结构可能与增加转录活性以及使mRNA趋于相对稳定有关。原核生物的mRNA没有这种首、尾结构。 1961年，Jacob和Monod首先提出了mRNA的概念。在真核细胞中，由于蛋白质是在胞浆中而不是在核内合成，因此显然要求有一个中间物将DNA上的遗传信息传递至胞浆中。后来的研究证实，这种中间物即信使RNA。mRNA的核苷酸序列与DNA序列相应，决定着合成蛋白质的氨基酸序列。它如何指导氨基酸以正确的顺序连接起来呢？不同的mRNA碱基组成和排列顺序都不同，但都只有A，G，C，U 4种碱基，如果一个碱基就可以决定一个氨基酸，则只有四种变化方式，如果两个碱基决定一个氨基酸，则只有16种变化方式，都不能满足20种氨基酸的需要。1961年Crick和Brenner的实验得出了三个核苷酸编码一个氨基酸的结论，并将这种三位一体的核苷酸编码称做遗传密码（genetic code）或三联体密码，这样就可以有64种不同的密码，但此情况下必须假定有一些氨基酸使用两个以上的密码。这一假定很快就被证明是对的。遗传密码具有

下列特征：

（1）三个核苷酸组成一个密码子，每个密码子由三个前后相联的核苷酸组成，一个密码子只为一种氨基酸编码。共有64个密码子； （2）密码子之间不重叠使用核苷酸，也无核苷酸间隔；

（3）一种氨基酸可有多个密码子，这个特点称为密码子的简并性； （4）密码子的通用性，所有生物从最低等的病毒直至人类，蛋白质合成都使用同一套密码子表，仅有极少的例外，如特殊细胞器线粒体，叶绿体所用的密码稍有不同。通用遗传密码与线粒体遗传密码之间的一些差异。

究竟哪一个密码子为哪一种氨基酸编码，即密码子与氨基酸之间的对应关系已在60年代研究解决了。1964年Nirenberg用一种RNA聚合酶体外合成了多聚尿苷酸、多聚腺苷酸等多聚核苷酸，将这些多聚核苷酸分别用于蛋白质的体外合成。发现，当所用的多聚核苷酸为多聚尿苷酸时，只有多聚苯丙氨酸合成，这意味着UUU为苯丙氨酸编码；用其它多聚核苷酸进行相应的实验后发现，CCC为脯氨酸编码，而AAA为赖氨酸编码；其后，有人又用核苷酸比例为已知，但是核苷酸序列随机的多聚核苷酸，以及用已知序列的含两种或两种以上核苷酸的多聚核苷酸进行相应的实验，将结果加以数理统计处理，又解读了一批密码子，其中包括三个终止码，最后，还有一些密码子是通过合成已知序列的三聚核苷酸与核蛋白体和载有放射性同位素标记的氨基酸的tRNA共沉淀原理予以解读的。在所有密码子中，AUG不仅为蛋氨酸编码，而且又是翻译（translation，以mRNA上的遗传信息指导核蛋白体上多肽链合成的过程）的起始信号，UAA、UAG和UGA不为任何氨基酸编码，而是作为翻译的终止信号，统称为终止码（stop codon），又常被叫作无意义码（nonsense codon）。

大多数氨基酸是由一个以上的密码子所编码。这个事实提出了一个问题：编码同一种氨基酸的一组密码子的使用频率是否都相同？细致的分析表明，无论是原核生物，还是高等真核生物，密码子的使用频率并不是平均的，有些密码子的使用率很高，有些则几乎不使用，其使用频率主要与细胞内tRNA含量呈正相关。 6 信使RNA与遗传信息的传递

转录是在原核和真核细胞中以DNA为模板合成RNA的过程。

在原核和真核生物中，转录过程是相似的。包括DNA变性，RNA聚合酶结合在单链DNA上以5′→3′方向合成RNA分子。双链中只有一条链作为转录模板，合成单链RNA分子。启动子和终止子序列决定转录的起始和终止。

在E.coli中RNA多聚酶转录各种RNA（mRNA，tRNA和rRNA）。在真核细胞中有三类不同的RNA多聚酶，它们的功能不同。RNA pol Ⅰ转录4种

rRNA中的3种；RNA pol Ⅱ转录mRNA和一些snRNA；RNAⅢ转录第四种rRNA，tRNA以及其余的snRNA。

3种真核生物的RNA pol，不像E.coli RNA pol，没有一个直接地和启动子区结合，而是通过转录起始因子的介导来起始RNA的合成。对于每一种RNA多聚酶来说，转录因子是特异的，它可以识别启动子的特殊序列。

蛋白质编码基因的启动子位于转录起始位点的上游，由不同组合的启动原件所构成。特异的转录因子和调节因子结合在这些原件上，促进RNA pol Ⅱ转录起始。增强子离启动子较远，它可被调节因子识别结合，具有促进基因转录的功能。

由RNA pol Ⅲ转录的启动子，位于下游，在其基因编码序列内部。这种启动子，根据所转录的RNA的种类，由不同的功能区组合而构成。转录因子识别这些功能区，促进RNA聚合酶转录起始。

18S，5.8S和28S rRNA作为一个转录单位一道转录，产生前体RNA分子。大部分真核生物的18S，5-8S和28S rRNA都是以串联重复排列，每个重复单位被不转录的间隔序列（nontranscribed specer,NTs）所分隔。转录单位的启动子位于NTS中，其功能是和特异的转录因子相结合，促进RNA pol Ⅰ的转录起始。

从孟德尔定律问世以后，人们就知道了生物的各种性状是由基因控制的。一基因一酶学说的建立进一步地明确了基因是以酶的形式通过控制生化反应链来控制的。酶或蛋白和基因又是什么样的关系呢？也就是说遗传信息怎样传递，怎样表达成性状呢？就在Watson和Crick建立DNA双螺旋模型后的第三年，1957年Crick提出了中心法测(central dogma),指出了遗传信息的传递方向: DNA → RNA→蛋白质

1970年H.Temin和D.Baltimore发现了反转录酶后，Crick对中心法测又作了部分修改：

DNA → RNA →蛋白质

也就是说由DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，RNA通过翻译把信息传递给蛋白。通过这种单向的传递，遗传信息通过蛋白质的不同形式，如酶，结构蛋白，运载蛋白，调节蛋白等表达成一种性状。 7信使RNA与转移RNA的区别

区分mRNA和tRNA，可以从结构和功能这两个方面去把握。 1.结构。

⑴真核生物的mRNA的5' 端有帽子结构，3' 端为多聚腺苷酸（poly(A))

尾巴。

⑵tRNA的二级结构呈三叶草形。三叶草形结构由氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环和TφC环等5个部分组成。其中，氨基酸臂末端为CCA；反密码环中部为反密码子，由3个碱基组成。反密码子可识别mRNA的密码子。 ⑶tRNA折叠形成三级结构。tRNA的三级结构呈倒L形，反密码环和氨基酸臂分别位于倒L的两端。 2.功能。

⑴mRNA是合成蛋白质的直接模板。每一种多肽链都有一种特定的mRNA做模板，因此细胞内mRNA的种类也是很多的。它将DNA上的遗传信息转录下来，携带到核糖体上，在那里以密码的方式控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序，作为蛋白质合成的直接模板。

⑵tRNA的功能是转运氨基酸。在蛋白质合成过程中，tRNA与合成蛋白质所需的单体——氨基酸形成复合物，将氨基酸转运到核糖体中mRNA的特定位置上。

8 mRNA与反转录

以反义RNA为模版,通过反转录酶进行的RNA转录 1．概念

反转录是以RNA为模板合成DNA的过程，也称逆转录。这是DNA生物合成的一种特殊方式。

2．反转录酶与反转录过程

反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。反转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有反转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。 3．生物学意义

反转录的发现有重要的理论意义和实践意义。

（1）对分子生物学的中心法则进行了修正和补充，修正后的中心法则表示为：

（2）在致癌病毒的研究中发现了癌基因，在人类一些癌细胞如膀胱癌、小细胞肺癌等细胞中，也分离出与病毒癌基因相同的碱基序列，称为细胞癌基因或原癌基因。癌基因的发现为肿瘤发病机理的研究提供了很有前途的线索。

（3）在实际工作中有助于基因工程的实施。由于目的基因的转录产物易于制备，可将mRNA反向转录形成DNA用以获得目的基因。 四、核糖体RNA（rRNA） 1 概述

核糖体RNA（ribosome RNA），简称rRNA，是细胞中含量最多的RNA，约占RNA总量的82%，也是3类RNA中相对分子质量最大的一类RNA，它与蛋白质结合而成核糖体，其功能是作为mRNA的支架，使mRNA分子在其上展开，实现蛋白质的合成。rRNA单独存在时不执行其功能，它与多种蛋白质结合成核糖体，作为蛋白质生物合成的―装配机‖。 2 分类

①原核生物的rRNA分三类：5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA。

②真核生物的rRNA分四类：5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA。 注：S为大分子物质在超速离心沉降中的一个物理学单位，可间接反应分子量的大小。原核生物和真核生物的核糖体均由大、小两种亚基组成。

rRNA的分子量较大，结构相当复杂，目前虽已测出不少rRNA分子的一级结构，但对其二级、三级结构及其功能的研究还需进一步的深入。 3 结构与功能

①所有的rRNA均有其基本的特点： a、rRNA是单链RNA；

b、G-C碱基对与A-U碱基对的总量不等；

c、单股rRNA链可自行折叠，形成螺旋区和环区，所有螺旋区的碱基都是保守的；

d、所有来源rRNA均能形成4个结构域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，每个结构域均含许多茎(螺旋段)和环，它们通过无距离碱基对的相互反应彼此靠近;

e、绝大多数的rRNA碱基的特异功能尚不清楚。据说rRNA中不配对的碱基(环区或单股区)涉及到rRNA与其它RNA的结合，如16S的3'端不配对的碱基与mRNA的起始部位(SD顺序)形成碱基配对。 ②rRNA的空间排列

测定rRNA的空间排列方式的方法主要有电镜法和交联法。在电镜下,16SrRNA的排列呈V型,一个臂比一个臂稍厚和长。23S的大小和形状可与50S―皇冠‖式样很好匹配。有结论认为，rRNA形成了核糖体亚基的骨架，蛋白质与其结合。一般来说，rRNA骨架不发生大的构象改变。用免疫电镜法已确定在亚基内rRNA

的某些特征。使用抗N6,6-二甲基腺苷(位于16SrRNA3'末端24和25位)抗体，确定了修饰碱基区段(指16SrRNA3'端约25个碱基)位于30S亚基头和体之间。16SrRNA的第526位的m7G处于30S上1/3和下2/3交界处。16S、5S和23SrRNA的内部交联已被研究。证明在5SrRNA内G41和G72交联,这种交联属三级结构反应,利用此反应已经构建了一处改进的5SrRNA分子三维模型。此外，RNA-蛋白质交联研究也是测定亚基内rRNA分子空间排列的非常有用的方法。

现在一般认为,核糖体的基本功能依赖于其中的rRNA,核糖体蛋白质起着加强rRNA功能的作用。核糖体最初由rRNA构建,在进化过程中一些蛋白质加在其上。在体内外的实验均证明了缺乏某些蛋白质的核糖仍有生物活性;此外,rRNA基因(rDNA)突变及甲基化等均可引起对抗菌素(如红霉素、氯霉素)的抵抗。 核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)是组成核糖体的主要成分。核糖体是合成蛋白质的工厂。在大肠杆菌中，rRNA量占细胞总RNA量的75%-85%，而tRNA占15%，mRNA仅占3-5%。

rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起，形成核糖体（ribosome），如果把rRNA从核糖体上除掉，核糖体的结构就会发生塌陷。原核生物的核糖体所含的rRNA有5S、16S及23S三种。S为沉降系数（sedimentation coefficient），当用超速离心测定一个粒子的沉淀速度时，此速度与粒子的大小直径成比例。5S含有120个核苷酸，16S含有1540个核苷酸，而23S含有2900个核苷酸。而真核生物有4种rRNA，它们分子大小分别是5S、5.8S、18S和28S，分别具有大约120、160、1900和4700个核苷酸。

rRNA是单链，它包含不等量的A与U、G与C，但是有广泛的双链区域。在双链区，碱基因氢键相连，表现为发夹式螺旋。

rRNA在蛋白质合成中的功能尚未完全明了。但16 S的rRNA3’端有一段核苷酸序列与mRNA的前导序列是互补的，这可能有助于mRNA与核糖体的结合。核糖体RNA在各种生物中都有其特性，因此可以从不同生物的rRNA的对比中得出关于生物进化历程的结论。

rRNA为肽酰转移酶(peptidyl transferase)时，催化使肽键形成，不需要额外的能量。过去认为，大亚基的蛋白质具有酶的活性，促使肽键形成，故称为转肽酶。20世纪90年代初，H.F.Noller等证明大肠杆菌的23SrRNA能够催化肽键的形成，才证明核糖体是一种核酶，从而根本改变了传统的观点。核糖体催化肽键合成的是rRNA，蛋白质只是维持rRNA构象，起辅助的作用。与rRNA或核糖体亚基结合的蛋白质有二类：一类与rRNA或核糖体亚基紧密连接，需高浓度

盐和强解离剂(如3mol/LLiCl或4mol/L尿素)才能将其分离，这类蛋白质称为―真‖核糖体蛋白质(\或简称为核糖体蛋白质。如E.coli30S亚基上的21种蛋白质及50S亚基上的34种蛋白质(共54种，因为小亚基上的S20与大亚基上的L26是相同)，或者在真核细胞40S亚基上的30种蛋白质及60S亚基上的45-50种蛋白质(共约80种)，即属此类。而另一类蛋白质则为与有功能的核糖体亚基疏松缔合，能被0.5mol/L单价阳离子(如K+，NH4+)从亚基上洗脱，并对核糖体循环发挥调节作用的蛋白质，如起始因子(IF或eIF)和延长因子(EF)等,称为核糖体相关蛋白质(proteins associated with ribosome)，简称PAR。PAR不是构成核糖体的固有成分。 五、小核RNA（snRNA） 1 概述

细胞内有小核RNA(small nuclearRNA)，简称snRNA。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分，参与mRNA前体的加工过程。现在发现有五种snRNA，其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸。snRNA一直存在于细胞核中，与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在RNA转录后加工中起重要作用。另外，还有端体酶RNA(telomerase RNA)，它与染色体末端的复制有关；以及反义RNA(antisense RNA)，它参与基因表达的调控。

mRNA最后翻译为蛋白质，而rRNA、tRNA及snRNA等并不携带翻译为蛋白质的信息，其终产物就是RNA。 2 作用

真核细胞有细胞核和细胞质中都含有许多snRNA，它们约有100到300个碱基，每个细胞中可含有105-106个这种RNA分子。它们是由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ所合成的，其中某些像mRNA一样可被加帽。在细胞核中的小RNA称为snRNA，而在细胞质中的称为scRNA。但在天然状态下它们均与蛋白质相结合，故分别称为snRNP和scRNP。某些snRNPs和剪接作用有密切关系。有些snRNPs分别和供体及受体剪接位点以及分支顺序相互补。snRNAs中最受注意的一个是U1，它普遍存在于哺乳动物、鸟类和昆虫细胞中。人U1snRNP中除RNA外，还有8个蛋白质分子。人U1snRNA的可能二级结构，其5'端的11个核苷酸是单链的，并有一段和内含子左侧的供体序列互补。在供体位点处的互补序列通常为4-6bp。在体外，完整的U1snRNP粒子能和左侧共同顺序结合，但纯化的U1snRNA却不能。U1snRNA参与剪接的证据是抗U1snRNP的抗体可以在体外抑制剪接作用；而且如果从系统中将U1snRNP除去，剪接即不能进行。事实

上，除去U1sn RNA5'端的几个核苷酸即可抑制体外剪接作用。

有可能U5snRNA能识别右侧(受体位点)共同顺序；而U2snRNA，则具有与分支位点互补的顺序。抗U2snRNP的抗体可以和U2snRNA及包括分支位点在内的内含子所形成的复合体发生免疫沉淀。U1和U2可能参与剪接反应的起始阶段，因为U1和U2的灭活将阻止左侧连接点的切断和套索的形成。另外两个snRNAsns(U4和U6)可能亦参与剪接作用，但它们的功能尚不详。一般认为，脊椎动物细胞有6种不同的snRNAs，称为U1、U2、U3、U4、U5和U6。最小的是U6，有约100核苷酸长。最大的是U3，也不过215核苷酸长。它们和蛋白质结合成snRNPs。系统性红斑狼疮(SLE)患者和某些风湿病患者的血清中常可检出对snRNPs中某些蛋白质的自身抗抗体。 六、RNA干扰（RNAi） 1 RNAi的定义

目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义： ① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。

② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。

如果将其作为一门生物技术，则定义为：

① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ，从而诱导内源靶基因的mRNA 降解，达到阻止基因表达的目的。 ② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。 ③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。

各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。 2 概述

最近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。

这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的，是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3'末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA。

这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。

有趣的是，除了短双链RNA，短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，从而产生RNA干扰。这使得构建表达干扰RNA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能。shRNA可以利用RNA聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6或者RNaseP的组分H1 RNA转录的。另外一种办法是两段短RNA分子分别用U6启动子转录出来。载体介导的siRNA表达使对功能缺失（loss-of-function）表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象。

另外一种延长siRNA抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下，需要对siRNA的稳定性进行进一步提高。因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷。一个5'端为两个2'-O-甲基RNA、3'端为4个甲基化核苷的siRNA与序列相同但是未经修饰的siRNA比活性相同，但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRNA活性下降。 3 RNA干扰技术的应用

RNA干扰在哺乳动物体内的第一个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA的质粒注入老鼠的尾静脉。在大多数器官中，报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上）的表达可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNA干扰实验。注射siRNA之后，小鼠

肝细胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Fas特异抗体引起的爆发性肝炎，82%用siRNA处理的小鼠活过了10天观察期，而所有的对照小鼠在3天之内死亡。

上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此，标准的基因治疗所采用的方法被用于RNA干扰。一个反转录病毒载体被用于导入siRNA，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因K-ras等位基因。负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项研究还表明siRNA的高度特异性，因为只有癌基因K-ras被沉默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。另外，当在纹状区注射表达siRNA的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV启动子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表达元件被用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的siRNA载体打开了大门。

总的来说，siRNA的第一个体内实验已经进行，其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。至今为止的研究没有观察到任何应用siRNA引起的毒性作用，但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心，以排除长期使用RNA干扰引起的严重副作用。因为用siRNA使基因表达沉默与传统的反义技术相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的，以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。

将dsRNA触发的RNAi作为基因组的―免疫系统‖，人们可能要问：转座子和病毒是如何诱导与它们自己序列相对应的dsRNA 的？在线虫，至少可有三个可能的解释。第一，一旦一个基因单元已经将多个拷贝插入基因组的任意位置，从启动子端开始连续转录可以从两条链产生RNA，形成dsRNA。这种情况出现的机会将随着插入的数量而增加， 这将提供一个感受随机整合的拷贝数的装置，存在于基因组中的一种转座子扩散的感受器。第二， 在线虫中的知道要被RNAi调节的转座子有末端反向重复序列。一个单拷贝的连续阅读转录能够产生与这些末端对应的折回dsRNAR。我们在线虫中确实观察到与转座子末端对应的dsRNA 。 第三，可能存在其他转座子感受器 。所有\好\基因在它们的mRNA中分享结构基序，甚至可能是5 和 3 端之间的相互作用，及蛋白质因子与它们的结合。 缺乏这些特征的mRNAs 通过一个特殊的装置转变成dsRNA。转座子沉默有缺陷的几个线虫突变，在给予dsRNA后在RNAi中没有缺陷 ，可能存

在将外源mRNAs转变成dsRNA的步骤。

在线虫中，小量的dsRNA 能够使大量的靶RNA沉默。 这种现象至少有三种机制：1、Dicer酶将长dsRNA分子切成短的\初级\短RNA（siRNA）， 因为每一个siRNA具有结合一个同源mRNA的能力，效应的放大水平取决于dsRNA的长度 ，很容易检测到放大10~20倍。2、siRNA在酶作用中，可多次应用，能提供进一步放大。3、 短RNAs可作为靶mRNA的引物，产生后代\次级siRNAs\（靶序列直接扩增），并且这样启动一个RNA诱导的RNA聚合反应。 4 2006诺贝尔医学奖成果RNA干扰机制解读

1990年，曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！科学界对此感到极度困惑。

类似的谜团，直到美国科学家安德鲁?法尔和克雷格?梅洛发现ＲＮＡ干扰机制才得到科学的解释。两位科学家也正是因为1998年做出的这一发现而荣获今年的诺贝尔生理学或医学奖。

根据法尔和梅洛的发现，科学家在矮牵牛花实验中所观察到的奇怪现象，其实是因为生物体内某种特定基因―沉默‖了。导致基因―沉默‖的机制就是ＲＮＡ干扰机制。

此前，ＲＮＡ分子只是被当作从ＤＮＡ（脱氧核糖核酸）到蛋白质的―中间人‖、将遗传信息从―蓝图‖传到―工人‖手中的―信使‖。但法尔和梅洛的研究让人们认识到，ＲＮＡ作用不可小视，它可以使特定基因开启、关闭、更活跃或更不活跃，从而影响生物的体型和发育等。

诺贝尔奖评审委员会在评价法尔和梅洛的研究成果时说：―他们的发现能解释许多令人困惑、相互矛盾的实验观察结果，并揭示了控制遗传信息流动的自然机制。这开启了一个新的研究领域。‖

科学家认为，ＲＮＡ干扰技术不仅是研究基因功能的一种强大工具，不久的未来，这种技术也许能用来直接从源头上让致病基因―沉默‖，以治疗癌症甚至艾滋病，在农业上也将大有可为。从这个角度来说，―沉默‖真的是金。美国哈佛医学院研究人员已用动物实验表明，利用ＲＮＡ干扰技术可治愈实验鼠的肝炎。 目前，尽管尚有一些难题阻碍着ＲＮＡ干扰技术的发展，但科学界普遍对这一新兴的生物工程技术寄予厚望。这也是诺贝尔奖评审委员会为什么不坚持研究成果要经过数十年实践验证的―惯例‖，而破格为法尔和梅洛颁奖的原因之一。 诺贝尔生理学或医学奖评审委员会主席戈兰?汉松说：―我们为一种基本机制的发现颁奖。这种机制已被全世界的科学家证明是正确的，是给它发个诺贝尔奖的时

候了。‖

七、反义RNA（atRNA） 1 反义RNA的定义

反义RNA(antisense RNA，atRNA)是指与mRNA互补的RNA分子, 也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合, 即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式，最早是在E.coli 的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现的,许多实验证明在真核生物中也存在反义RNA。近几年来通过人工合成反义RNA的基因, 并将其导入细胞内转录成反义RNA, 即能抑制某特定基因的表达,阻断该基因的功能, 有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。同时也暗示了该方法对肿瘤实施基因治疗的可能性。 2 反义RNA的来源

细胞中反义RNA的来源有两种途径∶第一是反向转录的产物，在多数情况下, 反义RNA是特定靶基因互补链反向转录产物, 即产生mRNA和反义RNA的DNA是同一区段的互补链。第二种来源是不同基因产物，如OMPF基因是大肠杆菌的膜蛋白基因，与透性有关，其反义基因MICFZE则为另一基因。 3反义RNA的分类和作用机制

反义RNA的分类和作用机制：下表总结了原核细胞内天然存在的11种反义RNA。这些反义RNA按其作用机制可经分为三大类。 调节水平 反义RNA 靶RNA 分类 功能 来源 转录后水平 micF RNA ompFmRNA 1A OmpF合成 染色体 转录后水平 oop RNA cⅡmRNA 1B 溶菌-溶源 噬菌体 转录后水平 sar RNA antmRNA 1A 溶菌-溶源 噬菌体 转录后水平 ouT RNA 转位酶mRNA ⅠA 转位作用 转位子 转录后水平 finp RNA traJ mRNA ⅠA DNA转位 转位子 转录后水平 sok RNA hok mRNA ⅠA 杀死作用 转位子 转录后水平 copA RNA repA mRNA Ⅱ 复制 质粒 转录后水平 R1162RNA repⅠmRNA Ⅱ 复制 质粒 转录后水平 pT181RNA repC mRNA Ⅱ 复制 质粒 转录水平 ticRNA CAP mRNA Ⅲ cAMP结合蛋白 染色体 复制前水平 RNAⅠ RNAⅡ Ⅲ DNA复制 质粒

Ⅰ类:这类反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或编码区，引起翻译

的直接抑制(ⅠA类)或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶Ⅲ的敏感性增加，使其降解(ⅠB类)。

Ⅱ类:这类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制尚不完全清楚，可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后会引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变，因而阻止了核糖体的结合。

Ⅲ类:这类反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。

ticRNA(transcription inhibitory complementary RNA)是大肠杆菌中CAP蛋白(cAMP结合蛋白)的mRNA的反义RNA。ticRNA的基因的启动子可被cAMP-CAP复合物所激活，从CAP mRNA的转录起始位点上游3个核苷酸处开始，以CAP mRNA的模板DNA链的互补链为模板，合成ticRNA。ticRNA具体长度不清楚，但是它是5'端一段正好和CAP mRNA的5'端有不完全的互补，可以形成双链的RNA杂交体。而在CAP mRNA上紧随杂交区之后的是一段约长11bp的A，U丰富区。这样的结构十分类似于ρ不依赖性的转录终止子的结构，从而CAP mRNA的转录刚刚开始不久后即迅速终止。从这个例子中我们可以看到CAP蛋白合成的自我调节作用。当CAP合成达一定量后，即可与cAMP结合成cAMP-CAP复合物。再激活ticRNA的启动子转录出ticRNA，反过来抑制CAP-mRNA的合成。 4反义RNA的功能

在原核生物中反义RNA具有多种功能，例如调控质粒的复制及其接合转移，抑制某些转位因子的转位，对某些噬菌体溶菌-溶源状态的控制等。下文仅举数例。

1.调控细菌基因的表达：反义RNA对编码CAP的基因的调控作用已如前述。这里再介绍一下micF RNA对ompF基因的表达的调控。ompF蛋白质是大肠杆菌的外膜蛋白的主要成分这一。micF RNA是从另一基因(ompC基因)附近的DNA序列转录而来，和o-mpFn RNA的5'端有70%的序列互补，因此在体外micF RNA可以抑制ompF mRNA的翻译。但是这种抑制作用在体内是否重要尚有疑问，因为缺失micF基因的菌株其ompF蛋白的表达只受到轻微的影响。 2.噬菌体溶菌/溶源状态的控制：反义RNA也参与了λ和P22噬菌体的溶菌/溶源状态的控制。P22噬菌体编码一种抗阻遏蛋白Ant，它可以抑制许多λ样噬菌体的阻遏蛋白与DNA的结合。这对于刚刚感染细胞的P22建立λ样原噬菌体(prophage)是有益的。但是Ant必须在严格的控制下，否则Ant的过分表达必将阻止溶源状态的建立，而成为溶菌性的噬菌体。Ant蛋白质表达的控制是利用反

义RNA(sarRNA)能与ant mRNA的翻译起源区互补结合，从而抑制ant mRNA翻译成Ant蛋白。

在λ噬菌体中cⅡ蛋白控制着溶菌或溶源状态的选择。cⅡ蛋白可以激活λPre启动子，该启动子控制的基因是λ噬菌体整合作用所必须的，且同时能抑制λ噬菌体的复制。cⅡ蛋白的另一功能是延缓λ晚期基因的表达，其作用机制是cⅡ蛋白激活PaQ的启动子，转录出PaQRNA。PaQRA是编码Q蛋白的mRNA的反义RNA。因此，PaQRNA能与QmRNA配对杂交而抑制其翻译，而Q蛋白早已知道是晚期基因表达的激活蛋白。

cⅡ基因本身的表达还受到称为oopRNA的反义RNA的调控。oopRNA与cⅡ基因的3'端互补，但其具体作用机制尚不清楚。

3.IS10转位作用的抑制:outRNA是一种反义RNA，可以和IS10编码的转位酶mRNA(INRNA)5'端结合而抑制其翻译，当细胞内只有一个考贝IS10时，只能生成很少量的outRNA，故转位酶仍可生成。但当IS10的考贝数增多时，outRNA愈来愈多，其控制作用亦明显增强，所以称为多考贝抑制现象。这种现象可以防止IS10的过量堆积引起的细胞损害。 5人工合成构建反义RNA

既然反义RNA在原核生物中对基因表达起着重要的调控作用，那么人工设计在天然状态下不存在的反义RNA来调节靶基因的表达，想必也是可能的。这已在不少实验中得到证实。

1.由于目前对靶mRNA的SD序列的上游区的结构了解甚少，因此，在要设计Ⅱ类反义RNA用于和靶mRNASD序列上游区结合，以期达到调节该mRNA翻译的目的是比较困难的。

2.Ⅲ类反义RNA是和mRNA的起始处结合而形成类似ρ-不依赖性的转录终止子而使转录水平上抑制靶基因的表达。因此，要设法在靶mRNA上找到一段连续的U序列，就可以设计出反义RNA，与该U序列上游的mRNA链互补，以形成ρ-不依赖性终止子。理想的作用位点是在靶mRNA的5'端上游的非编码区，以免受核糖体的影响。

3.只要靶基因的核苷酸顺序已经知道，就可以人工设计出Ⅰ类反义RNA。有时还可设计同时具有Ⅰ类和Ⅲ类反义RNA功能的反义RNA。

我们还可以设计出天然存在的反义RNA的反义RNA来。这样就可以拮抗原始反义RNA对靶mRNA的抑制作用。而达到激活或加强某个靶基因的表达的目的。然而并不是所有的mRNA对其相应的Ⅰ类反义RNA都敏感。例如，有的mRNA寿命很短，只有1-2分钟，它们和反义RNA结合的机会较少，因而就较

不敏感。反之，另一些mRNA则很稳定，寿命可达十多分种，则其对相应的反义RNA的抑制作用就很敏感。此外，反义RNA本身的稳定性有很大的实际意义。显然，稳定的反义RNA对靶mRNA的调节作用比不稳定的反义RNA要好。 使反义RNA分子稳定的方法如下：

[1]反义RNA3'端带有茎环结构或类似ρ-不依赖性终止子结构时，可以稳定RNA分子。

[2]Gorski等还发现在T4噬菌体的基因32mRNA的5'端上游的茎环结构及其附近的序列亦可稳定RNA分子。所以在设计反义RNA基因时，最好将产生3'及5'端这种二级结构的序列克隆在反义RNA基因的两端。Hirashima等1986年发现，针对靶mRNA的SD序列和AUG区域的反义RNA，要比单纯对编码区域的反义RNA更为有效。1989年Hirashima又发现，针对SD序列和它的上游区域(但不包括AUG)的反义RNA更为有效。在真核生物中，针对5'端非编码区的反义RNA更有效。但也有实验表明针对第一内含子的反义RNA也同样有效。

现在设计反义RNA基因是时应注意之点总结如下： [1]长的反义RNA并不一定比短的反义RNA更为有效。

[2]在原核生物中针对SD序列及其附近区域的反义RNA可能更有效。 [3]在真核生物中，对应于5'端非编码区的反义RNA可能比针对编码区的反义RNA更有效。

[4]尽量避免在反义RNA分子中出现自我互补的二级结构。

[5]设计的反义RNA分子中不应有AUG或开放读框，否则该反义RNA亦会与核糖体结合而影响其与靶mRNA的配对结合。

[6]进一步还可以将带有ribozyme结构的RNA连在反义RNA的3'端尾上，当反义RNA与靶mRNA杂交后，即可利用其酶活性来降解靶mRNA。 此外，为了增强反义RNA的作用，还可以采取一些额外措施，例如： [1]由于反义RNA对靶mRNA的抑制作用有剂量依赖性，所以在构建反义RNA基因时，要选择强的、可以诱导的启动子以增强反义RNA本身的表达。 [2]构建许多个反义RNA基因串连在一起，以得到线性重复的多拷贝基因，对提高反义RNA的表达也有利。

[3]RNA酶Ⅲ可以降解RNA:RNA杂交体，所以在构建反义RNA基因时，可将RNA酶Ⅲ的基因也同时转化到靶细胞中并进行表达。这样，当反义RNA与靶mRNA结合后，RNA酶Ⅲ即可将其降解。这显然有利于反义RNA的抑制作用。 近年来，有关反义RNA的研究进展迅速，已经应用到抗病毒感染，研究癌

基因的作用机制，探索肿瘤治疗的可行途径等方面。在今后一段时间内，有关反义RNA的研究肯定将会有更加迅速的进展和更广阔的应用前景。 6反义RNA技术

随着分子生物学和遗传工程的发展，基因治疗应运而生，反义技术是其中一种，它的基础是根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列的反义核酸，从而抑制特定基因的表达，包括反义RNA、反义DNA及核酶（Ribozyme），它们通过人工合成和生物合成获得。

（一）反义RNA，根据反义RNA的作用机制可将其分为3类：

Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ 降解；

Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。

(二)反义DNA是指一段能与特定的DNA或RNA以碱基互补配对的方式结合，并阻止其转录和翻译的短核酸片段，主要指反义寡核苷酸，因更具药用价值而倍受重视。

(三)核酶(ribozyme)是具有酶活性的RNA，主要参加RNA的加工与成熟。天然核酶可分为四类：(1)异体催化剪切型，如RNaseP；(2)自体催化的剪切型，如植物类病毒、拟病毒和卫星RNA；(3)第一组内含子自我剪接型，如四膜虫大核26SrRNA；(4)第二组内含子自我剪接型。利用反义技术研制的药物称反义药物。反义药物作用于产生蛋白的基因，因此可广泛应用于多种疾病的治疗，如传染病、炎症、心血管疾病及肿瘤等。与传统药物比较反义药物更具选择性及效率，因此也更高效低毒。基于上述特点反义药物已成为药物研究和开发的热点。而且反义技术还可以应用于生物科学的基础研究。 7总结

经过长期盛衰沉浮，反义技术近年来得到越来越多的注意。对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降低毒性的修饰核苷的研究取得了重要进展。由于大多数新的DNA类似物不能激活RNaseH，对反义寡核苷酸的设计需要考虑靶mRNA是否需要保留，例如，是改变剪接方式，还是降解靶mRNA（这种情况下应该使用gapmer技术）。可以通过有系统的修饰天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的稳定核酶。一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验研究，一个反义药物已经在1998年获得批准。一个重要的突破是发现短的双链RNA分子可用于哺乳动物细胞中特异性沉默基因表达。这个方法与传统的反义技术比效率明显更高，并且一些体内实验的数据已经发表。因此，反义技术有望广泛应用

于对未知功能基因的研究、药物靶标的确认和治疗。 八、核仁小分子RNA（snoRNA）

核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA），如U3等，主要与有关PROTEIN协作剪接rRNA，并非所有的rRNA都是SELF-SPLICING。snoRNA由编码PROTEIN基因的intron编码。是近来生物学研究的热点，由内含子编码。已证明有多种功能，反义snoRNA指导rRNA核糖甲基化。

核仁小RNA与其它RNA的处理和修饰有关，如核糖体和剪接体核小RNA、gRNA（向导 RNA）等。核仁小RNA是一个与特性化的非编码RNA相关的大家族。

九、细胞质小分子RNA(scRNA)

scRNA(small cytoplasmic RNA)存在于真核细胞的cytoplasmic或者nuleus中，是细胞质小分子RNA。

现在研究甚热的、在GramPositive bacterium Bacillus subtilis（枯草杆菌）中发现的scRNA和human signal recognition particle 7S RNA和E.coli 4.5S RNA的功能类似。在蛋白质的合成中起重要作用。

由scRNA的缺失可以引起蛋白质合成的alpha-amylase(戊糖化)或者beta-lactamase（乳糖化），指导细胞死亡。 十、不均一核RNA（hnRNA）

核内不均一RNA（ heterogeneous nuclear RNA系heterogeneous nuclear之缩写）简称hnRNA，存在于真核生物细胞核中的不稳定、大小不均的一组高分子RNA（分子量约为105～2×107，沉降系数约为30—100S）之总称。占细胞全部RNA之百分之几，在核内主要存在于核仁的外侧。认为hnRNA多属信使RNA（messenger ribonucleic acid，mRNA）之先驱体，包括各种基因的转录产物及其成为mRNA前的各中间阶段的分子，在5’末端多附有间隙结构，而3’的末端附有多聚腺苷酸聚合酶分子。这些hnR-NA在受到加工之后，移至细胞质，作为mRNA而发挥其功能。大部分的hnRNA在核内与各种特异的蛋白质形成复合体而存在着。

在真核生物中，转录形成的前体RNA中含有大量非编码序列，大约只有25%序列经加工成为mRNA，最后翻译为蛋白质。因为这种未经加工的前体mRNA(pre-mRNA)在分子大小上差别很大，所以通常称为不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA），简称hnRNA,携带遗传信息。

真核细胞DNA 上的结构基因最终会表达成各种相应的蛋白质，不过，结构基因 先在细胞核内转录初步生成hnRNA，hnRNA上有些核苷酸序列将来是不表达的

称为内含子，而且结构上也不完全，所以hnRNA只是mRNA的前体，hnRNA还要在细胞核内进行首尾修饰、切除内含子拼接外显子 等加工手续，之后才能形成成熟的mRNA ，而后mRNA 在细胞浆中作为蛋白质合成的模板，指导合成蛋白质。所以，hnRNA是mRNA的前体，而mRNA是蛋白质合成的模板。 十一、干扰mRNA的互补RNA(miRNA) 1概述

MicroRNA (mRNA enterfering complementaty RNA，miRNA)：是含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子（~21-23个核苷酸）。MiRNA，以及miRISCs（RNA-蛋白质复合物）在动物和植物中广泛表达。因之具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能，miRNA被认为在调控发育过程中有重要作用。

microRNAs（miRNAs）是一种小的，类似于siRNA的分子，由高等真核生物基因组编码，miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译。miRNAs在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。尽管在10年前已经发表了第一篇关于miRNA的论文，直到最近miRNA的普遍性和重要性才逐渐被人们所认识。 2 miRNA 的特点

① 广泛存在于真核生物中,，是一组不编码蛋白质的短序列RNA ,，它本身不具有开放阅读框架(ORF) ；

② 通常的长度为20～24 nt ， 但在3′端可以有1～2 个碱基的长度变化； ③成熟的miRNA 5′端有一磷酸基团，3′端为羟基, 这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA 的降解片段区别开来；

④多数miRNA 还具有高度保守性、时序性和组织特异性。 3 miRNA的产生和作用机理

miRNA基因通常是在核内由RNA聚合酶II(polII)转录的，最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pre-miRNA。

pre-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的pre-miRNA。RAN–GTP和exportin 5将pre-miRNA输送到细胞质中。随后，另一个核酸酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA:miRNA*双链。这种双链很快被引导进入沉默复合体(RISC)复合体中，其中一条成熟的单

链miRNA保留在这一复合体中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达。

与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达（哺乳动物中比较普遍）。然而，最近也有证据表明，这些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。使用这种机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3’端非翻译区。如果miRNA与靶位点完全互补（或者几乎完全互补），那么这些miRNA的结合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比较常见)。通过这种机制作用的miRNAs的结合位点通常都在mRNA的编码区或开放阅读框中。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。 4 miRNA在正常生理过程中的作用

目前只有一小部分miRNAs生物学功能得到阐明。这些miRNAs调节了细胞生长，组织分化，因而与生命过程中发育、疾病有关。通过对基因组上miRNA的位点分析，显示其在发育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明：miRNAs在细胞生长和凋亡，血细胞分化，同源异形盒基因调节，神经元的极性，胰岛素分泌，大脑形态形成，心脏发生，胚胎后期发育等过程中发挥重要作用。例如，miR-273和lys-6编码的miRNA，参与线虫的神经系统发育过程；miR-430参与斑马鱼的大脑发育；miR-181控制哺乳动物血细胞分化为B细胞；miR-375调节哺乳动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌；miR-143在脂肪细胞分化起作用；miR-196参与了哺乳动物四肢形成，miR-1与心脏发育有关。另有研究人员发现许多神经系统的miRNAs在大脑皮层培养中受到时序调节，表明其可能控制着区域化的mRNA翻译。对于新的miRNA基因的分析，可能发现新的参与器官形成、胚胎发育和生长的调节因子，促进对癌症等人类疾病发病机制的理解。 5 miRNAs与癌症

最近的研究发现，miRNA表达与多种癌症相关，大约50%得到注解的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（fragile site）。这说明miRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用，这些miRNAs所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人员将miRNA命名为―oncomirs‖。 充当抑癌基因作用的miRNA:

? mir-125b-1，位于染色体的11q24脆性位点，乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌病人中11q924位点常有缺失，而这一位点并不存在已知的抑癌基因。

? 65%B细胞慢性淋巴型白血病（CLL）病人，50%的套细胞淋巴瘤病人，16-40%的骨髓瘤病人、60%的前列腺癌病人中有13q14位点的缺失。因此，在这个30Kb的区域中必定有一个肿瘤抑制基因的存在。而mir-15a和mir-16-1位于这一区域中一个功能未知的被称为LEU2的非编码蛋白的RNA基因的内含子区域。Climmino等最近报道，miR-15a和miR-16-1负调控BCL2，一个抗凋亡基因，因此，这两个miRNAs的缺失或下调，导致了BCL2表达的升高，促进了白血病、淋巴瘤和前列腺癌的发生。

? 有研究报道，mir-143和mir-145在结肠癌中明显下调。有趣的是，其发夹结构的前体分子在肿瘤和正常组织中含量相似，这表明，可能是由于其成熟过程受到破坏。mir-143和mir-145的肿瘤抑制基因功能不仅仅局限于结肠癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、淋巴癌等细胞系中其表达量也明显下调。 ? Takamizawa等发现肺癌病人的let-7表达显著降低，并且这导致这些病人更差的预后，非小细胞肺癌病人的let-7表达水平越低，其预后越差，术后生存期越短。体外组织培养实验表明，在人的肺癌细胞中瞬时的表达let-7可以抑制细胞的增殖，这也说明let-7在肺组织中可能是一个抑癌基因。实验表明，在人类细胞中let-7通过3’非翻译区域直接抑制癌基因Ras的表达。大约有15-30%的人类肿瘤都含有Ras突变，而激活的突变导致这个蛋白表达上升可以引起细胞转化。因此，能够调节Ras蛋白表达的let-7，可以控制细胞的增殖速度。 充当癌基因作用的miRNA：

? miR-21在胶质母细胞瘤中表达增加。这个基因在肿瘤组织中表达量比正常组织高5-100倍。反义核酸的研究发现这个miRNA通过抑制凋亡而并非影响细胞增殖控制细胞生长，这预示着这个miRNA具有癌基因的功能。另一项独立研究，利用芯片来检测肿瘤和正常组织的245个miRNAs的表达水平，也发现胶质母细胞瘤中miR-21表达升高。由于mir-21不是一个大脑特异性的基因，在乳腺癌样品中表达也有增加，这个基因可能在肿瘤发生中起到广泛的作用。 ? Metzler等人发现，在BIC基因上具有一段138个核苷酸的保守序列，编码mir-155的发夹结构。该研究组还发现在Burkitt淋巴瘤中，miR-155表达量上升了100倍，此外的研究也发现，Hodgkin淋巴瘤等肿瘤中miR-155水平也有提高。因此，mir-155可能是作为一个癌基因和MYC协同作用，而其正常功能是在B细胞的分化中起作用，其可能的靶基因是那些对抗MYC信号通路的基因。

? He等人最近发表的论文发现在散布的B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、套细胞淋巴瘤等肿瘤中常常有13q31位点的扩增。而在这一扩增区域的唯一的基

因就是一个非编码蛋白的RNA，C13orf25，这个转录本编码了mir-17-92基因簇，其中包含了7个miRNAs：miR-17-5p，miR-17-3p，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b-1，and miR-92-1。他们由此推断，这个基因簇的过表达与肿瘤形成有关，而后通过实验研究证明，过表达Myc和mir-17-19-b1基因簇淋巴癌与仅有Myc过表达肿瘤相比较，具有更强的增殖能力，更低的细胞死亡率。这些实验证实，mir-17-19-b1中的miRNAs可以协同地行使癌基因的功能，其靶基因可能是在MYC过表达条件下激活的凋亡蛋白。当凋亡途径被

mir-17-19-b1去除，MYC可以诱导细胞不受控制地增殖，这导致了肿瘤发生。 ? O’Donnell等人单独证明了mir-17-92基因簇是一组可能的肿瘤相关的基因。他们用miRNAs芯片筛选过表达MYC，B细胞系P493-6中miRNA表达变化。他们发现MYC诱导了mir-17-92的表达，而这些miRNAs可以抑制E2F1的翻译。在这一模型中，mir-17-92基因簇所起的作用似乎是抑癌基因的作用，这与上面讨论的He等人的发现是相反的。这其中可能的机理是，尽管E2F1可以促进细胞增殖，但是当E2F1的表达水平超过一阈值，它也可以引起凋亡，在此情况下，miRNAs对于E2F1的负调控可能是通过阻断E2F1的诱导凋亡活性，从而促进MYC介导的细胞增殖，支持了He等提出的模型。 6 miRNA展望

miRNA在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，越来越多的引起研究人员的关注。随着对于miRNA作用机理的进一步的深入研究，以及利用最新的例如miRNA芯片等高通量的技术手段对于miRNA和疾病之间的关系进行研究，将会使人们对于高等真核生物基因表达调控的网络理解提高到一个新的水平。这也将使miRNA可能成为疾病诊断的新的生物学标记，还可能使得这一分子成为药靶，或是模拟这一分子进行新药研发，这将可能会给人类疾病的治疗提供一种新的手段。 7 miRNA鉴定及功能研究手段：

前鉴定miRNA常用的方法包括直接克隆鉴定，miRNA芯片分析和生物信息学预测。当然计算机预测的miRNA必须经过RT-PCR或Northern试验分析才能鉴定，另外也可以通过miRNA mimics和inhibitors从功能上进行实验鉴定。另外序列分析表明，至少有1/3的人类基因与miRNA调控相关，而且越来越多的试验证据表明miRNA还有很多功能未被发现。研究基因的功能通常是将其从基因组中敲除，然后观察敲除前后的变化，但在破译miRNA的功能，我们一般不会采用这种策略，而是通过增强或减弱该miRNA的表达来鉴定其功能。 miRNA mimics是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，

能增强内源性miRNA的功能。而miRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。

近年来人工合成的miRNA（artificial miRNA，amiRNA）已经成功应用于沉默预期靶基因的表达及其功能研究，人工合成的miRNAs既能够特异性地沉默单一基因，也可以同时沉默多个相关但不相同的基因。miRNA mimics进一步增强内源miRNA的沉默作用，降低细胞内蛋白表达量，进行功能获得性（gain-of-function）研究；相反，使用化学合成的方法合成miRNA inhibitors，特异的靶向和敲除单个的miRNA分子，可以削弱内源miRNA的基因沉默效应，提高蛋白表达量，进行功能缺失性（loss-of -function）研究，可以用来筛选miRNA靶位点，筛选调控某一基因表达的miRNA，筛选影响细胞发育过程的miRNA。化学合成miRNA mimics和inhibitors是近年来研究的一个新热点，已经成为研究动植物基因家族功能的有用工具，并有望成为癌症治疗和临床研究的一种新策略。

十二、非编码RNA（ncRNA）

非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA），是指各种不转译成蛋白质的RNA分子。过去也称此类RNA为小RNA（sRNA）,不过有些ncRNA分子其实相当大。其他较少使用的同义词还有非信使RNA（nmRNA）、小非信使RNA（snmRNA）或功能性RNA（fRNA）等。DNA序列中专门转录成非编码RNA的部分称为RNA基因或是非编码RNA基因。非编码RNA基因用来生产转移RNA与核糖体RNA，以及一些小RNA，如snoRNAs、microRNAs、siRNAs与piRNAs；较大的则有Xist、Evf、Air、CTN与PINK等。基因组中可生产非编码RNA的DNA比例目前仍未明了，最近的转录组及微阵列研究显示，在老鼠基因组中，可能有超过3万个长ncRNA。mRNA（信使RNA）末端也含有一些非编码区域（non-coding regions；UTRs），虽然这些部分并非蛋白质编码，但mRNA并不归类于非编码RNA。 十三、短发夹RNA(shRNA)

shRNA（short hairpin RNA，shRNA），包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。

在活体中输送―短干涉RNA‖（siRNA）的一种办法是，将siRNA序列作为―短发夹‖克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个―双链RNA‖（shRNA），并被RNAi通道处理。然而，对成年小鼠肝脏中shRNA的表达的长期效应所做的一项研究为我们敲响了警钟。该研究结果表明，很多

shRNA在小鼠中表达时是有毒的。这种经常是致命的毒性似乎是由shRNA与内生微RNA之间为与Exportin-5结合所展开的竞争造成的。Exportin-5是一个参与将分子输送出细胞核的因子。人们对开发基于shRNA的疗法非常感兴趣，而此前几乎没有证据表明shRNA在活体中有很强毒性。 十四、短干扰RNA(siRNA) 1 定义

短干扰RNA(Small interfering RNA ，siRNA)，是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。 2 siRNA原理

RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成。由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA，Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA，当dsRNA达到一定量的时候，Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶，具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶活性区域，dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区）结合，形成酶-dsRNA复合体。在Dicer酶的作用下，细胞中的单链靶mRNA（与dsRNA具有同源序列）与dsRNA的正义链互换，原来dsRNA中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来，然后，在ATP的参与下，细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex（RISC，由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）利用结合在其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与dsRNA反义链互补的区域，形成21-23nt的dsRNA小片段，这些小片段即为siRNA。RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的，因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生，所以

这些中央的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应。 3 siRNA特点

a) 长度约在22nt左右。

b) 依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。 c) 生成需要Argonaute家族蛋白存在。 d) 是RISC组分。

e) siRNA合成是由双链的RNA或RNA前体形成的。

f) siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。 g) 结构上， siRNA是双链RNA。

h) 在Dicer酶的加工过程中， siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。

i) 在作用位置上， siRNA可作用于mRNA的任何部位。

j) 在作用方式上， siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。 k) siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

十五、核酸酶（RNase） 1定义

核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶（DNase），有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此统称为核酸酶（nuclease）。 2分类

根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶分为核酸外切酶（exonuclease）和核酸内切酶（endonuclease）。 ① 核酸外切酶

有些核酸酶能从DNA或RNA链的一端逐个水解下单核苷酸，所以称为核酸外切酶。只作用于DNA的核酸外切酶称为脱氧核糖核酸外切酶，只作用于RNA的核酸外切酶称为核糖核酸外切酶；也有一些核酸外切酶可以作用于DNA或RNA。核酸外切酶从3′端开始逐个水解核苷酸，称为3′→5′外切酶，例如，蛇毒磷酸二酯酶即是一种3′→5′外切酶，水解产物为5′核苷酸；核酸外切酶从5′端开始逐个水解核苷酸，称为5′→3′外切酶，例如：牛脾磷酸二酯酶即是一种5′→3′外切酶，水解产物为3′核苷酸。

② 核酸内切酶

核酸内切酶催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。有些核酸内切酶仅水解5′磷酸二酯键，把磷酸基团留在3′位置上，称为5′-内切酶；而有些仅水解3′-磷酸二酯键，把磷酸基团留在5′位置上，称为3′-内切酶。还有一些核酸内切酶对磷酸酯键一侧的碱基有专一要求，例如胰脏核糖核酸酶（RNaseA）即是一种高度专一性核酸内切酶，它作用于嘧啶核苷酸的C′3上的磷酸根和相邻核苷酸的C′5之间的键，产物为3′嘧啶单核苷酸或以3′嘧啶核苷酸结尾的低聚核苷酸。 ③20世纪70年代，在细菌中陆续发现了一类核酸内切酶，能专一性地识别并水解双链DNA上的特异核苷酸顺序，称为限制性核酸内切酶（restriction endonuclease，简称限制酶）。当外源DNA侵入细菌后，限制性内切酶可将其水解切成片段，从而限制了外源DNA在细菌细胞内的表达，而细菌本身的DNA由于在该特异核苷酸顺序处被甲基化酶修饰，不被水解，从而得到保护。 限制性核酸内切酶可被分成三种类型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亚基有通过在特殊碱基上补加甲基基团对DNA进行化学修饰的活性。Ⅱ型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修饰DNA，能在所识别的特殊核苷酸顺序内或附近切割DNA。因此，被广泛用于DNA分子克隆和序列测定。

十六、核糖核酸酶抑制剂（RNasin） 1概述

RNasin是从人胎盘中提取的特异性核糖核酸酶(RNase)抑制剂，分子量为51,000道尔顿的蛋白质，等电点pH值为4.7。它能特异地与RNase以300的抑制常数(ki)以非共价键结合形成复合体而使RNase失去活性。在缓冲液为0-0.5M NaCl，pH5-8的条件下保持其活性，pH7.8时活性最高。 2特性

a) 抑制一般的真核RNase包括RNaseA、B、C和人胎盘RNase； b) 不抑制RNase H，S1核酸酶，SP6，T7和T3 RNA聚合酶，AMV或M-MLV反转录酶，Taq DNA聚合酶，RNase T1；

c) 活性pH范围宽广，但需要1mM DTT以保持其活性。 3应用

A用在有潜在RNase污染的地方。 B 在cDNA合成中保护mRNA。

C体外转录系统、翻译系统，保护mRNA。 D 用于多核糖体的活性、产量增加。

E增进体外病毒复制。

F促进同源体系中的RNA翻译。 G 制备无RNase的抗体。

H 提高Riboprobe (R)系统RNA合成反应的得率。 十七、向导RNA（gRNA）

向导RNA（guide RNA，gRNA），也称为小向导RNA（small guide RNA，sgRNA）。是作用于动质体（kinetoplastid）体内一种称为RNA编辑（RNA editing）的后转录修饰过程中。也是一种小型非编码RNA。可与pre-mRNA配对，并在其中插入一些尿嘧啶，产生具有作用的mRNA。

转自 http://www.hjcz.org/bbs/read.php?tid=194697

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