实验动物心肌肥厚模型 - 图文

III.实验动物心肌肥厚模型 A、 压力超负荷/主动脉缩窄

压力超负荷引起的心脏肥厚常用的手术方法是主动脉缩窄（i.e.缩窄升主动脉）。小鼠行主动脉缩窄（TAC）可以引起心脏机械性的压力超负荷，最终导致心肌肥厚、心衰（20,84）。TAC通常诱导方法采用在近胸骨端行小切口, 缩窄主动脉的这样的开胸手术。TAC模型虽然不能完全模拟人类的心室重构，但该模型可以用于肥厚发病过程中多种基因学的研究。主动脉缩窄模型能很好的模拟血流动力学超负荷引起左心室肥厚的发生发展。该动物模型在主动脉缩窄造成心肌肥厚几个月后会导致心衰。 B、 容量超负荷

在静脉回流适当的情况下，心脏不能排出足够的血液满足全身组织代谢的需要就会

引起CHF（充血性心力衰竭）。心内檐沟血或回心血量增加导致瓣膜闭锁不全就会引起心室容量超负荷。在慢性动脉和/或二尖瓣瓣膜回流疾病中的容量超负荷，我们会观察到“舒张期压力-容积曲线”整体右移,说明心脏僵硬度增加，即发生LVH (可见于主动脉瓣狭窄、高血压、肥厚性心肌病)（36）。通常情况下，容量超负荷CHF模型制备方法是腹主动脉-下腔静脉分流术。即于肾动脉上方分离出下腔静脉和腹主动脉，用血管夹在近肾动脉端夹闭主动脉阻断血流；用0.6-mm的针头由主动脉远端刺入，继续进针刺入下腔静脉，使动静脉联合。退针后，缝合血管壁伤口。4-5周后，就能复制出心肌肥厚模型，并具有左心室收缩力增强、舒张末期压力增加的特点（257）。 C、 冠状动脉结扎

冠状动脉结扎常用于复制心衰动物模型。冠脉左前降枝（LAD）结扎后会阻断心脏的供养和营养输送，这种情况类似于人类心脏病发作时伴随的症状。血氧和营养供输阻断后，心肌细胞死亡，心脏整体功能受影响，最终导致心功能紊乱。由于这种动物模型非常接近临床心衰疾病的发生发展，研究证明该模型是心衰发病机制研究的重要手段（13）。

D、 转基因型心脏肥大模型

几十年以来，一些心脏肥大和心力衰竭的转基因小鼠模型被学者们用于心肌肥厚和心衰这些致命疾病的可能的分子机制研究。受条件限制，在此不能针对于所有模型作一全面的综述，但在此文中，我们介绍一种转基因小鼠模型，该模型能成功模拟心肌肥厚的发生发展以及最终演变为心衰的过程。表1列举的是截止目前，研究学者们发现的较成熟的心肌肥厚/心衰模型。

表1：小鼠心衰模型

转基因小鼠模型 肌侵蛋白， TNFα，Gi， Gαq， PKCβ， PKA，β1AR,

磷酸化蛋白, 肌集钙蛋白, 钙调磷酸酶, L-型 Ca2+ 通道

代谢转变模型 线粒体功能紊乱 氧化应激

脂肪酸氧化 (FAO) 通路的受损

ECM紊乱转基因模型 基质金属蛋白酶2/MMP2 基质金属蛋白酶9/MMP9 组织金属蛋白酶抑制剂1/TIMP1

1、高表达肌侵蛋白的转基因小鼠 在此我们介绍一种心肌肥厚和心衰发病机制研究中典型的转基因小鼠模型，该模型中，小鼠心脏高表达肌侵蛋白。肌侵蛋白，分子量为12-kDa的可溶性蛋白，已被证明是自发性高血压大鼠（SHR）和心肌病病人心脏特有表达的（227,318）。肌侵蛋白能诱导心肌细胞生长，促进原癌基因和原代心肌细胞肥大基因的表达（202）。肌侵蛋白可以与NF-κB（146,279）共同作用调节蛋白激酶C（PKC）的活性（276）。心脏特异表达肌侵蛋白的小鼠，应用α-肌球蛋白重链作为启动子，能促进心肌肥厚的发生发展，最终导致心衰（255）（Fig.3）。该病理过程的发生与心脏中相关分子组成的改变有关，它包括原癌基因、肥厚标志基因、生长因子基因的表达升高和胶原沉积增加（Fig.4）。转基因小鼠历经9个月的时间可以从心肌肥厚慢慢的发展到心衰，表现出LVH、心房扩张、心肌细胞凋亡、多灶性纤维化、胸腔积水以及心功能改变包括射血分数减少、缩短等特征（Fig.5）（255）。这些变化是由横纹肌和结构蛋白表达发生实质性改变导致的。这种转基因小鼠从心肌肥厚开始阶段到心衰的终末阶段，其基因的变化已明确。由于这种变化与人类心肌肥厚过程中基因变化非常相似，为研究心肌肥厚发病初期及发展到最终阶段的心衰过程中涉及到生长因子和细胞因子的变化提供了可靠地手段。若心肌肥厚发病初期及过度阶段的基因表达的变化已经明确，为预防心肌肥厚、心衰的发展提供新的思路。我们预计，这种新型小鼠模型是进一步阐明心肌肥大和心衰发病机制的重要模型工具，为该类疾病的治疗提供新的靶点。

图.3.（A）WT和TG小鼠心室重构过程中心脏的变化：WT和TG小鼠心脏肥大期（4wk）以及肥大向心衰转变期(9 months )HW/BW的比较; （B）WT和TG小鼠心肌细胞横截面积的比较（n=5）上图是4wk龄WT（A）、Tg（C）小鼠心肌细胞（HE染色）。E是9-month-old WT心肌细胞，G是Tg小鼠在×63放大倍率下细胞。下图是时上图×2.5放大倍率的图；B，是 4-wk WT 小鼠心肌细胞; D，是4-wk Tg小鼠心肌细胞；F, 9-month-old WT小鼠心肌细胞; H, 9-month-old Tg小鼠心肌细胞。 4-wk 龄时，小鼠心肌细胞横截面积明显增大。Tg小鼠心肌

细胞横截面积明显增大(2，431 ± 712 至 6，297 ± 280μm2；p < 0.001)。(C) 9-month-old WT小鼠分离出的心肌细胞 (左图) (×63) 以及 9-month-old Tg小鼠分离出的心肌细胞且肌侵蛋白高表达(右图) (×63). (图来自参考文献255.)

图.4. (A) 24 wks 时，与WT小鼠比较，Tg小鼠(Gn1-Gn4)ANF and β-MHC 表达上调。4重转基因小鼠心肌发生肥厚后，ANF 和β-MHC 表达上调。(B) 与WT小鼠比较，幼龄及老龄Tg小鼠中原癌基因表达上调。(图来自参考文献255.)

图. 5. 36-wk龄WT和Tg小鼠的M-型超声心动图. (图来自参考文献255.)

2、能量代谢紊乱的心脏衰竭 CHF发病过程中会伴有横纹肌动蛋白功能、细胞外基质、钙离子和能量代谢等一系列细胞内物质的变化。基础和临床实验研究表明，肥厚性心脏和衰竭的心脏特点是线粒体功能紊乱、磷酸化物质含量增加以及脂肪酸氧化途径（FAO）异常。当前述能量物质代谢发生变化，心肌就需要消耗更多的能量物质-三磷酸腺苷（ATP）。然而，“能量代谢紊乱”在心衰发生机制中扮演着怎样的角色需要进一步的研究。本文从线粒体功能紊乱和脂肪酸代谢途径异常两个方面综述心衰的发生发展。

3、线粒体功能紊乱与心衰 线粒体被视为细胞中的 “能量站”。 线粒体位于心脏肌原纤维之间，约占心肌细胞总体积的50%，具有线粒体DNA（mtDNA）、核糖体、转运RNAs、以及线粒体基因表达所需要的几种酶。基础和临床试验研究证明，当心衰发生时心肌细胞线粒体呼吸功能明显受损（140,271）。在心室重构发生过程中线粒体是重要的受损靶点，它

会释放多种神经调节因子。“线粒体孔”的开/关与心肌细胞凋亡密切相关（130）。现从下面几点，进一步解释线粒体功能紊乱与心衰的关系：

a.氧化应激： 氧化应激的特点是在呼吸链中产生过量氧自由基（ROS）。线粒体中氧化磷酸化酶做功能产生氧自由基，如超氧化物自由基、H2O2、羟自由基（150）。氧自由基产生的另一种途径是脂质过氧化。研究已显示慢性缺血性心脏中过量氧自由基的产生加重mtDNA的损伤程度，最终从基因水平上引起氧化磷酸化（56）。mtDNA是不与组蛋白结合，裸露存在于线粒体中的，与核DNA比较，mtDNA更容易受到破坏，而且mtDNA缺乏自我修复能力（49,241,242）。呼吸链产生ATP时，mtDNA不断的暴露在自由基环境中，使其具有高达10-12倍的突变率（167）。在线粒体中，ROS主要影响线粒体酶的活性。在心肌中，氧自由基能改变Na+/Ca2+交换、Na+--K+ATP酶、Ca2+ ATP酶的活性。缺乏锰超氧化物歧化酶（一种清除酶）的突变小鼠体内，呼吸链中复合物Ⅱ明显减少并迅速发展为扩张性心肌病。

b.获得性突变 研究已证明线粒体呼吸链中引起的许多缺陷均可导致遗传性充血性心力衰竭和心肌病（177,323）。也有报道家族性心肌病患者中，线粒体中转运蛋白肉碱缺乏（322）。虽然突变蛋白在遗传性心肌病的作用还不是很明确（177），但有一点可以肯定的是mtDNA和线粒体是可以母性遗传的。在母系遗传中，我们还观察到特定线粒体基因突变可以诱导呼吸链多种缺陷，导致CHF的发生（347）。因此，线粒体基因大片段缺失，必会导致心脏传导缺陷和心肌病，如卡尔森-赛尔斯综合征(40)。线粒体基因片段的缺失会影响电子传递系统，人们认为线粒体基因片段的缺失发生机率在胚胎早期自发突变体细胞中较大，它在心脏疾病发展中发挥着重要作用(298)。

c.线粒体功能紊乱的心衰小鼠模型 大量的转基因小鼠已经被开发用于研究线粒体与心脏功能之间的关系。这些模型的方法不是使线粒体代谢紊乱（功能丧失）就是激活线粒体分子氧化途径（功能增强）。在线粒体代谢模型中研究最成熟的腺嘌呤核苷酸转运体（ANT）。ANT，是一分子量为32-kDa的能量转移蛋白，编码3个不同的核基因（ANT-1、2、3），并以特定的组织形式结合在一起，在线粒体内膜上能完成ATP/ADP转运。ANT是调节ATP在线粒体基质中的产生和消耗的关键分子。Graham等(102,203)发现ANT-/-的小鼠表现为线粒体功能异常、心肌表型肥厚。另外一个模拟毁坏mtDNA复制的基因敲除模型是Tfam(线粒体转录因子A)。Tfam是由核编码的mtDNA复制转录因子。利用cre-lox系统，Larson’s课题组(155,165,324)研究出特异性缺失Tfam基因的小鼠。Tfam基因敲除的小鼠通常在新生儿期就死亡了，即使生存下来，在2月龄的时候也伴有心肌病。这些小鼠的特点是心脏肥大、心室扩张、心室传导缺陷，如房室传导阻滞。另外，小鼠的过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因几乎无表达，心肌脂肪分解降低、有一定程度的心肌病表型(158,328)。据此推测，是不是脂肪酸不同形式的中间代谢产物积累导致心脏疾病的发生。

相反，心脏中PPARα特异性高表达转基因小鼠，线粒体FAO途径相关基因表达上调，葡萄糖转运和糖酵解途径相关基因表达下调(88)。这种转基因小鼠也有心脏肥厚、短轴缩短率较小、心室壁变薄、心室腔扩大等特点。另外，小鼠心脏超表达过氧化物酶体增殖物激活受体协同刺激因子-1α（PGC-1α）诱导的扩张型心肌病模型，心脏超微结构异常，包括纤维化、肌原纤维破坏、大型线粒体增多（160）。考虑到线粒体功能紊乱在这些转基因小鼠模型中的重要性，推测单独激活PPARα或PGC-1α或两者都被激活对于心脏肥厚和心脏功能紊乱具

有重要的作用。

d.脂肪酸氧化（FAO）途径受损 FAO是心脏和骨骼肌线粒体中ATP产生的主要路径。长链脂肪酸的跨膜转运是通过脂肪酸转运体实现的，如脂肪酸转运蛋白（FATP）、CD36/FAT。进入胞内后，脂肪酸活化为酰基辅酶A（CoA，CoA在CoA合成酶作用下生成）。β氧化的第一步是乙酰CoA的氧化：这一反应在乙酰CoA脱氢酶催化下完成。乙酰CoA脱氢酶家族包括：极长链乙酰CoA脱氢酶（VLCAD）、长链乙酰CoA脱氢酶（LCAD）、乙酰CoA脱氢酶、短链乙酰CoA脱氢酶（SCAD）四个家族成员。研究发现VLCAD基因突变的儿童和青少年患有心肌病（183）。VLCAD缺乏的小鼠体内VLCAD基因性的缺乏会导致心脏出现微多孔状脂质聚集、线粒体增生、室性心动过速、退行性纤维化、胶原沉积、心肌细胞空泡状的特点（86）。这个新型有趣的模型系统，为我们的研究提供一个新的切入点即在病理生理情况下，细胞内脂肪酸的代谢平衡与心肌细胞功能是有关联的。

另外一个因FAO受损导致心肌病比较受关注的小鼠模型，其制备方法是利用cre-lox P位点特异性重组系统，特异性除去心肌细胞PPARδ（46）。这种小鼠具有心功能紊乱、心肌中脂肪沉积加重、心脏肥大和CHF、存活率下降特点。心肌PPARδ的慢性缺失会引起脂毒性心肌病。因此，PPARδ是心肌FAO重要的因子，对于维持能量平衡和正常的心功能也具有重要的作用。

4.心肌肥厚和心衰中细胞外基质的作用 细胞外基质（ECM）是网状结构的胶原，维持着心肌细胞的完整性。ECM将心肌细胞和肌纤维以同轴度的方式连接在一起，形成一定的框架从而支撑着心肌细胞，能提高心脏对各种刺激的顺应性，同时又加重心室重构的发展。心肌的ECM成分主要是Ⅰ型胶原（Col I)和Ⅲ型胶原（Col Ⅲ)，它们的作用是连接心肌细胞，维持心脏结构和功能的完整性。若改变Col I /Col Ⅲ的比例会妨碍心脏的收缩和舒张功能。在扩张型心肌病和CHF的高血压患者中，也发现了Col I 、Col Ⅲ增多或者二者比例增大的现象（174,223）。胶原纤维丢失会诱导心室扩张、心肌细胞位移、收缩功能障碍。因此，在心室重构和心衰的病理生理过程中，基质蛋白的合成与降解平衡的调节是至关重要的。在正常心脏中，胶原的转换依赖于基质金属蛋白酶（MMP）及其内源性抑制剂[基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMPs)]（168）。MMPs和 TIMPs之间的平衡维持着基质正常水平。增强MMP的活性会促进ECM的降解，从而导致心室扩张和CHF。MMPs是一类Zn-依赖的蛋白水解酶家族，一种能降解ECM的蛋白。目前，已发现、克隆出很多种不同形式的MMPs，并且都具有广泛的特异性底物（58）。根据它们的结构和作用的底物不同，MMP可分为4类：(a) 胶原酶，包括MMP-1， -8， -13， 和-18； (b) 明胶酶，包括 MMP-2 和 -9； (c)基质溶解素，包括MMP-3， -10， 和-11； (d) 膜型MMP (MT-MMP)，包括 MMP-14 至MMP-17 、 MMP-24 和 -25。MMPs表达在心脏间质，心肌梗死时，其表达水平上调（38）。在此综述中，本文将从下面三个方面进行综述：目前已经知道的心衰疾病中MMP/TIMP系统、调控该系统的新机制以及该蛋白水解途径怎样向临床试验和应用的转换。

已经证实人类心脏中表达的几种MMP在发生CHF时，他们含量会发生变化。许多研究已经证实人、鼠、猪的心脏发生重构时，心脏中MMP-1、-2、-3和-9表达上调，表明MMP在不同疾病阶段扮演着重要的角色（53，58，300，311）。更重要的是，在临床性和实验性扩张型心肌病病患的心脏中MMP活性增强（287,309,310）。MMPs [如胶原酶-3（MMP-13）、

膜型MMPs (MT-MMP)]在正常心脏中是低表达的，而在CHF心脏中表达大幅度升高（281）。然而，在终末期的CHF没观察到同样的MMPs表达增加，暗示在心衰的心脏中有“特定组合”的MMPs存在（281）。在CHF动物模型中，已经验证了心肌中MMP的表达在LV重构过程中的变化。一个典型的超表达MMP-1的转基因小鼠模型，很好的解释了心脏ECM降解，此情况与人类CHF相似（144）。与心肌梗死（MI）WT小鼠相比， MMP-2的基因敲除小鼠其存活率升高、LV破裂率降低、左心室腔扩张被抑制、短轴缩短频率得到改善，提示这可能是心肌梗死（MI）一种新的有效的治疗方针（118）。MMP-9缺失的MI小鼠，同样心室扩张被抑制、胶原沉积减少，提示MMP-9可以作为MI治疗候选的选择性抑制剂（76）。相反，MI小鼠TIMP-1的缺失，加重LV重构（59）。前面列举的研究都是与MMP基因敲除或转基因或应用MMP抑制剂有关，这些都肯定了MMP蛋白酶在心室重构中的作用，为MMP作为CHF的治疗靶点提供充分依据。药理学中也应用MMP抑制剂介入治疗MI动物，发现MMP抑制剂能改善心室重构，对CHF具有保护作用（226，245）。更值得一提的是MMP-1, -3, -9, 和 -12多样性的激活与心血管疾病密切相关，包括冠状动脉疾病和腹主动脉瘤，暗示MI患者MMP基因转录的多样性同样会导致不同的LV重构以及会有不同的梗塞治疗方案（341，348）。因此基因小鼠和MMP抑制剂的使用，揭示了这些蛋白酶在心血管疾病中的作用。更多关于MMP的多样性与心血管疾病因果关系研究是非常有必要的。

表2：药理学抑制剂对血压及心脏肥厚的影响

模型 SHR SHR SHR SHR SHR SHR

药物 / 卡托普利 双氢氯噻嗪 阿替洛尔 氯沙坦 硝苯地平

HW/BW 3.44 ± 0.15 2.64 ± 0.08 3.30 ± 0.05 3.00 ± 0.11 2.86 ± 0.04 3.06 ± 0.05

BP 196 ± 28 119 ± 23 171 ± 60 151 ± 50 146 ± 30 140 ± 20

参考文献 Sen S (268) Sen S (268) Sen S (268) Sen S (268) Alvarez BV (4) Alvarez BV (4)

结果以平均值±SEM表示。SHR，自发性高血压大鼠；卡托普利，ACE抑制剂；双氢氯噻嗪，利尿剂；阿替洛尔，β受体阻断剂；氯沙坦，AngⅡ受体阻断剂；硝苯地平,钙离子通道阻滞剂；HW/BW，心脏重量与体重之比；BP，血压。

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