13_异亮氨酸

第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵

第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵

第一节 分支链氨基酸的生物合成途径和代谢调节机制

在L型异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）和缬氨酸（Val）的分子中，都具有由甲基侧链形成的分枝结构（见表13-1），故称上述三种氨基酸为分枝链氨基酸（branched chain amino acids）。分枝链氨基酸是合成蛋白质的素材，可以作为生物体的能源，也作为生物体成分的前体。但是，高等动物不能合成这三种氨基酸，故Ile、Leu、Val称为必需氨基酸。目前，分枝链氨基酸主要用作氨基酸输液的原料。

表13-1 分枝链氨基酸的结构 名称 结构式 分子式 分子量 异亮氨酸（Ile） C6H13O2N 131.18 亮氨酸（Leu） C6H13O2N 131.18 缬氨酸（Val） C5H11O2N 117.15 Ile分子内有两个不对称碳原子，因而，Ile存在着D、L、D别、L别四种光异构体（表13-2）。很难用化学合成法，或用化学合成法与酶法相组合的方法，廉价制造纯度高的L型Ile。Leu与Val分别只有两个光学异构体，能够用化工合成、酶法分割的方法，较廉价地制造。要廉价生产高纯度的L型Ile，只有采用发酵法，因此，Ile发酵就成了分枝链氨基酸发酵的中心问题。然而，从自然界中，只找到了分泌Leu或Val的菌株，却找不到分泌Ile的菌株。直到20世纪60年代后半期，随着氨基酸生物合成系反馈调节机制的全部搞清，可以通过选育目的氨基酸代谢拮抗物抗性株的方法，从遗传上解除原菌株的反馈调节机制，从而可以利用这种抗性菌株，由糖直接发酵生产Ile（Leu或Val）。

表13-2 Ile的四种光学异构体

L-Ile D-Ile D-别Ile L-别Ile 一、生物合成途径 1960年，经过用粗糙链孢霉、大肠杆菌的营养缺陷型突变株，及用放射性同位素标记

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的前体，进行研究的结果，确定了Ile、Leu及Val的生物合成途径（图13-1）。出于VaI和Leu的所有碳原子，都来自于丙酮酸，所以，Val及Leu亦称丙酮酸族氨基酸。Ile的六个碳原子中的四个碳原子来自于ASP，所以，Ile与Thr、Lys、Met一起，亦称作ASP族氨甚酸。Umbarger等研究的结果，清楚地说明，不仅L-Thr是Ile的前体，D-Thr及α-氨基丁酸也是Ile的前体。并且指明，由D-Thr等物质生成α-酮基丁酸的酶，不受反馈抑制。因此，可以用D-Thr或α-氨基丁酸发酵制造Ile。

分支链氨基酸的生物合成途径如图13-1所示。

图13-1 分支链氨酸生物合成途径及其调节机制

由图13-1可以看出，异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸这3种分支链氨基酸是从苏氨酸、丙酮酸经过若干步酶促反应而合成的。可以看出，L-苏氨酸是异亮氨酸的直接前体，丙酮酸是缬氨酸的直接前体，由缬氨酸合成途径的中间体α-乙酰异戊酸分支合成亮氨酸。在合成异亮氨酸、缬氨酸的途径中，有4步反应的酶是共用的，即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶、二羟基脱水酶及分支链氨基酸转氨酶。它们分别催化异亮氨酸及缬氨酸生物合成途径中互相对应的反应。例如，乙酰乳酸合成酶既催化异亮氨酸合成途径中由α-酮丁酸生成，α-乙酰-α-羟基丁酸的反应，又催化缬氨酸合成途径中由活性乙醛和丙酮酸生成α-乙酰乳酸的反应。此外，分支链氨基酸转氨酶不仅能催化异亮氨酸和缬氨酸的合成，而且也能催化亮氨酸的合成，也就是说，异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸生物合成途径中的最后一步转氨基反应，都是由同一种转氨酶催化完成的。

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二、代谢调节机制

研究表明，在粘质赛氏杆菌中，分支链氨基酸生物合成的代谢调节机制如图13-2所示。

图13-2 粘质赛氏杆菌中分支链氨基酸生物合成的调节机制

由图13-2可以看出，Ile合成中的第一个限速酶是L-Thr脱氨基酶，第二个限速酶则是乙酰羟基酸合成酶。Va1合成中的限速酶是乙酰基酸合成酶，也就是Ile合成中的第二个限速酶。Leu合成中的限速酶是α-异丙基苹果酸合成酶。限速酶的不同，就意味着目的产物合成所受的代谢调节不同。然而，随着微生物种类的不同，限速酶的调节因子也不同，就现有的研究情况来说，粘质赛氏杆菌的代谢情况了解得较为全面，这种细菌的分枝链氨基酸合成的代谢调节方式，跟大肠杆菌相类似。其他菌种的代谢调节方式只是部分地了解。分支链氨基酸生物合成的代谢调节机制如下。

(1)苏氛酸脱氨酶受异亮氨酸的反馈抑制。 (2)α-乙酰乳酸合成酶受缬氨酸的反馈抑制。 (3)α-异丙基苹果酸合成酶受亮氨酸的反馈抑制。

(4)分支链氨基酸合成酶系的各个酶的生成，受这3种末端氨基酸——异亮氨酸+缬氨酸+亮氨酸的多价阻遏。

编码3个分支链氨基酸合成酶系的基因组成两个主要的操纵子：ilv(左)和1eu(右)操纵子（图13-3 )。位于图距85min的ilv GEDACB操纵子中，DACB基因编码异亮氨酸、缬氨酸2个途径共用的4个多功能酶：基因C和D编码乙酰乳酸异构还原酶的亚基和二羟基脱水酶。基因B、G和E则分别编码乙酰乳酸合成酶亚基Ⅰ、Ⅱ和缬氨酸转氨酶。基因A编码苏氨酸脱氨酶。它们的控制区也分别处在B与C、C与A和E与G基因之间。亮氨酸合成途径酶系由leu操纵子编码：基因A编码异丙基苹果酸合成酶，基因D、C编码α-异丙基苹果酸异构酶，基因B编码β-异丙基苹果酸脱氢酶。leuDCBA操纵子被靠近结构基因A的调节区所控制。处于图距2min的ilvH、I操纵于编码同功酶乙酰乳酸合成酶亚基Ⅲ。

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图13-3 大肠杆菌leu（右）ilv(左)操纵子的组织结构

在ilv GEDACB操纵子中，转录时GEDA产生一条mRNA，而C和B则不和它一起转录。编码Ⅲ型合成酶的结构基因ilv H、I则位于2min处，但都受该途径终产物的阻遏。此外，所有的结构基因产物都可能受到多价阻遏，但是，无论是用遗传的方法还是生化的方法都未能鉴定出阻遏物，所以目前认为ilv和leu操纵子表达的控制可能主要通过衰减机制。

1eu操纵子控制区的全部核苷酸序列已经测出。经分析发现，Pribnow box居于前导转录物起始转录位点之前，此前导转录物具有编码28个氨基酸残基的能力。其上含有的4个连续的leu密码子，无疑也是在翻译水平上起调节作用的、除非亮氨酰－tRNAleu与翻译的核搪体处在这点(指4个leu密码子处)上空转时被隔离开来。如此，转录便向前，一组基因开始表达。另外，还含有3个异亮氨酸和3个缬氨酸密码子，显示着前导肽上这些氨基酸的有效性可能影响1eu操纵子的表达。

1eu前导转录物除含有能够产生前空白子(A—A)、终止子(B—B)和保护子(D—D)的二级结构外，还存在一种能阻止前空白于形成并且引起操纵子衰减的附加序列(additionalsequence)D—D。由于D—D首先形成，此操纵子将会总是处于衰减状态，除非核糖体在那里破坏D—D配对，并且A—A也不配对。运转的核糖体需要精确的密码排列，如果只在leu密码子处发生空转，那么在加个ilv－val第一个双密码子处空转的核糖体不能使操纵子去阻遏，而且在第二个ilv-val双密码子处空转的核糖体也都不能去阻退，因为它阻止了前空白子(A—A)的形成。这就对多价阻遏产生了某些怀疑，实际上，这很可能就是多价衰减。

ilv操纵子表达的程度好像取决于一个以上核糖体沿前导RNA的移动速率，而亮氨酰、缬氨酰和异亮氨酰－tRNA的有效性决定着这种移动速率。核糖体的移动将促进前导转录物结构上发生动力学的变化，显示着可能引起终止子茎环结构的形成。当所有氨酰-tRNA都存在时，核糖体沿前导肽平滑地移动，直到它遇上隐藏终止密码的碱基配对形成茎环结构Z—Z为止。这种终止便给出了足够的时间形成终止子，以致发生衰减作用。

第二节 异亮氨酸发酵

1901年，Fischer在由蛋白水解液分离的亮氨酸组分中发现了旋光度较亮氨酸更大的物

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质，此为有关L-异亮氨酸的最早报道。L-异亮氨酸（L-Isoleucine），化学名为β-甲基-α-氨基戊酸。由于在α位和β位具有两个不对称碳原子，因而存在D、L、D别、L别四种旋光异构体，但自然界中存在的异亮氨酸为L-异亮氨酸，其余三种均无营养价值。由于存在四种旋光异构体，因此很难采用化学合成法或化学合成与酶法相结合的方法，廉价制造高纯度L-异亮氨酸，只有采用发酵法。然而，自然界中只找到了分泌L-亮氨酸和L-缬氨酸的菌株，却未发现分泌L-异亮氨酸的菌株。直到20世纪60年代后半期，随着氨基酸生物合成体系反馈调节机制的全部搞清，才人工选育出L-异亮氨酸产生菌。 一、L-异亮氨酸生产方法

L-异亮氨酸生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三类，但目前在工业生产上实施的主要是发酵法。由于化学合成法生产的L-异亮氨酸与其它异构体分离困难，因而未能实现工业化生产。发酵法就是利用微生物的代谢作用，生物合成并过量积累L-异亮氨酸，包括添加前体物发酵法和直接发酵法两类。

1添加前体物发酵法

又称微生物转化法。这种方法使用葡萄糖作为发酵碳源、能源，再添加特异的前体物质即在氨基酸生物合成途径中的一些合适中间代谢产物，以避免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，经微生物作用将其有效转化为目的氨基酸。

图13-4 L-异亮氨酸合成前体

由于其前体物质稀少或价格昂贵，目前已很少采用此法生产L-异亮氨酸。 2直接发酵法

直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。目前，异亮氨酸产生菌大多由谷氨酸产生菌黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium Lactofermentas）诱变选育而来。 二、 L-异亮氨酸生产概况

目前国际上日本生产L-异亮氨酸占有垄断地位，厂家有味之素、协和发酵和田边制药三家，均以发酵法生产，产酸率达30~35g/L，提取率60~70%。目前全世界合计年产量400~500吨。鉴于L-异亮氨酸生产的高难度，L-异亮氨酸一直是高价氨基酸。我国的L-异亮氨酸发酵研究始于20世纪70年代，90年代初正式工业化生产。目前，传统一次投糖分批发酵大罐产酸率为20~22g/L，总得率为40~50%。与日本相比较，我国的L-异亮氨酸生产水平还较低 (如表13-3所示)。

表13-3 我国与日本L-异亮氨酸发酵技术指标的比较

生产技术指标 产酸率(g/L) 对糖转化率(%) 提取收率(%)

日本 30~35 20~25 60~75

中国 20~25 13~15 60

三、L-异亮氨酸产生菌育种策略及实例

（一） L-异亮氨酸产生菌常规育种策略

根据L-异亮氨酸生物合成途径及代谢调节机制（如图13-1和图13-2所示），L-异亮氨酸高产菌应具备以下生化特征：

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增加到1.1时，维持在30%以上之后，维持在20%左右，植物油作为消泡剂, 发酵过程泡沫较多时，通过消泡泵手动加入已灭菌的消泡剂消泡；补料分批发酵时，当残糖低于1.5时流加灭菌后糖液维持残糖在1.5～2.5之间。发酵80h可产异亮氨酸24.5g/L。

第三节 亮氨酸发酵

L-亮氨酸（L-leucine，Leu）是Proust于1819年首先从奶酪中分离出来的，以后Braconnot从肌肉与羊毛的酸水解物中得到其结晶，并定名为亮氨酸。L-亮氨酸是人与动物自身不能合成而必须依赖外源供给的八大必需氨基酸之一，是临床选用的复合氨基酸静脉注射液不可缺少的原料。L-亮氨酸对维持危重病人的营养需要，抢救患者生命起着积极作用。L-亮氨酸可用于诊断和治疗小儿突发性高血糖症和作为头晕治疗及营养滋补类药物。L-亮氨酸还可用于合成具有抗癌、抗病毒、抑制细菌生长等生物活性的L-亮氨酸Schiff碱Cu（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）配合物。最新研究表明：由L-亮氨酸合成的多聚物，是临时创伤敷料的最佳原料之一，极具发展潜质。 一、L-亮氨酸的生产方法

L-亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、添加前体发酵法、直接发酵法等。 1 提取法

L-亮氨酸在蛋白质中含量较多，将干酪素、角蛋白、血色素在酸性条件下水解，用碱中和即有亮氨酸沉淀，用β-萘矾酸使沉淀结晶，用离交法、层析法分离。国内虽有由天然蛋白质水解液分离提取L-亮氨酸产品，但该方法工艺费时、收率低，不适合大规模工业化生产。

2 化学合成法

化学合成法又分Storeker法、α-卤代酸法等。前法是将异戊醛制成氰醇再制成氨基腈后水解，或将异戊醛先制成乙内酰尿衍生物后加压加热水解；后法是将异己酸在三氯化磷存在的情况下加入溴生成α-溴异己酸，再与氨作用生成亮氨酸。

3 发酵法

发酵法是利用微生物菌体的生物合成作用，过量积累L-亮氨酸的过程。包括微生物转化法和微生物直接发酵法。

1）微生物转化法 又称添加前体发酵法。利用葡萄糖为发酵碳源、能源，再添加目的氨基酸的前体物，经特定微生物的代谢转化作用将该前体物有效地转化为目的氨基酸。德国学者Ulrich Groeger采用分批流加培养法，流加生物合成L-亮氨酸的前体物α-酮基异己酸32g/L，经谷氨酸棒杆菌ATCC13032发酵23小时，产L-亮氨酸24g/L。

2）微生物直接发酵法 利用微生物能自身合成L-亮氨酸的能力，通过对出发菌株（通常用谷氨酸产生菌如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等）的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制与阻遏，达到过量积累L-亮氨酸的目的。以微生物直接发酵法生产L-亮氨酸，在国外（如日本）已形成一定规模的工业生产能力。

二、L-亮氨酸产生菌代谢控制育种策略及实例

（一） L-亮氨酸的生物合成途径及代谢调节机制

由图13-1可知，L-亮氨酸的生物合成途径从丙酮酸开始直至形成α-酮基异戊酸，与L-缬氨酸的相应合成途径完全相同。丙酮酸在乙酰羟基酸合成酶的催化下，与来源于丙酮酸的活性乙醛基缩合形成α-乙酰乳酸。活性乙醛基是乙醛基与α-羟乙基硫胺素焦磷酸结合的产物。α-乙酰乳酸在二羧酸还原异构酶催化下发生甲基自动位移形成α，β-二羟基异戊酸。该产物经二羧酸脱水酶催化脱水后形成L-缬氨酸相应酮酸—α-酮基异

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戊酸。α-酮基异戊酸在α-异丙基苹果酸合成酶的作用下，接受由乙酰CoA转来的酰基形成α-异丙基苹果酸。α-异丙基苹果酸在α-异丙基苹果酸异构酶作用下形成β-异丙基苹果酸，再经以NAD为辅助因子的β-异丙基苹果酸脱氢酶作用形成α-酮基异己酸。α-酮基异己酸由支链氨基酸转氨酶催化与谷氨酸转氨形成L-亮氨酸。

L-亮氨酸生物合成的代谢调节机制如图13-2所示。丙酮酸是合成L-缬氨酸和L-亮氨酸的共同前体物，α-酮基异戊酸是合成L-缬氨酸的直接前体物，又是合成L-亮氨酸间接前体物。催化丙酮酸生成α-酮基异戊酸的酶系，与催化α-酮基丁酸生成α-酮基-β-甲基戊酸的酶系是相同的，这些酶的合成均受到三种支链氨基酸的协同反馈阻遏。其中的乙酰羟基酸合成酶是由丙酮酸合成α-酮基异戊酸的关键（限速）酶，还受到L-缬氨酸的反馈抑制。在由α-酮基异戊酸合成L-亮氨酸过程中，α-异丙基苹果酸合成酶是关键（限速）酶，受到L-亮氨酸的反馈抑制和阻遏。

乙酰羟基酸合成酶对α-酮基丁酸的亲和力比对丙酮酸的高。α-异丙基苹果酸合成酶对α-酮基异戊酸的亲和力比支链氨基酸转氨酶对α-酮基异戊酸的亲和力约高十倍。所以，三种支链氨基酸生物合成的优先顺序为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸。据此可知，在α-酮基丁酸之前减弱或切断异亮氨酸的代谢流，对亮氨酸的优先合成有重要作用。

大肠杆菌分支链氨基酸合成酶系的基因组成如图13-3所示。大肠杆菌细胞中由丙酮酸生成L-亮氨酸的酶系受到两个主要的操纵子（ilv操纵子和leu操纵子）的调控。ilv操纵子中的DACB基因编码合成三种支链氨基酸共用的3个多功能酶。从α-酮基异戊酸合成L-亮氨酸的酶系，是由leu操纵子中的DCBA基因编码的：基因Ａ编码α-异丙基苹果酸合成酶，基因Ｂ编码β-异丙基苹果酸脱氢酶，基因Ｄ、Ｃ编码α-异丙基苹果酸异构酶。leuDCBA操纵子被靠近结构基因Ａ的调节区所控制。

（二）L-亮氨酸育种策略 1. 出发菌株的选择 目前棒杆菌属、短杆菌属的L-亮氨酸生物合成途径及其调节机制已弄清，以鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens）、乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）、钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）为出发菌株，均有选育出L-亮氨酸高产菌的文献报道。

2. 解除反馈抑制与阻遏

根据L-亮氨酸生物合成的代谢调节机制，要通过代谢控制育种手段获得L-亮氨酸高产菌，必须实现三个解除一个改变：

① 解除三种支链氨基酸对生物合成途径上的乙酰羟基酸合成酶等3个共用酶的协同反馈阻遏作用；

② 解除L-缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制作用；

③ 解除L-亮氨酸对α-异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制和阻遏作用。以上可通过使菌体带上L-亮氨酸和L-缬氨酸结构类似物抗性标记(如：2-TAr、α-ABr、β-HLr、Valr、LeuHxr等遗传标记)来实现。

④ 改变菌体的正常代谢，使像氨基酸这类的代谢产物大量的积累。这可通过使菌体带上某些药物类(如：SGr等遗传标记)或抗生素类抗性标记(如：Rifr等遗传标记)来实现。

结构类似物（代谢拮抗物）的作用机理是：正常细胞合成代谢的最终产物对于有关酶的合成具有阻遏作用，对于合成途径的第一个酶具有反馈抑制作用。这是由于终产物能与阻遏蛋白或变构酶相结合的缘故。由于这种结合是可逆的，所以当代谢最终产物例如L-亮氨酸，参与代谢而在细胞内浓度降低时，它就不再与阻遏物以及变构酶相结合，

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这时有关酶的合成以及它们的催化作用便又可继续进行。代谢拮抗物由于与代谢产物结构相似，所以同样能与阻遏物以及变构酶相结合，可是它们往往不能代替正常的L-亮氨酸而参与蛋白质的合成，也就是说它们在细胞中的浓度不会降低，因此与阻遏物以及变构酶的结合是不可逆的。这使得有关的酶不可逆地停止了合成，或是酶的催化作用不可逆地被抑制。表现为菌株在添加有临界浓度以上的结构类似物的培养基中不能生长。

2-噻唑丙氨酸（2-TA）是L-亮氨酸和L-缬氨酸的结构类似物，通过选育2-TAr抗性标记，有利于解除乙酰羟基酸合成酶和α-异丙基苹果酸合成酶所受到的反馈抑制和阻遏。α-氨基丁酸（α-AB）是缬氨酸的结构类似物，选育α-ABr有利于解除缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制。亮氨酸氧肟酸盐（LeuHx）和β-羟基亮氨酸（β-HL）是亮氨酸的结构类似物，选育LeuHxr和β-HLr等抗性标记，均有利于解除终产物亮氨酸对L-亮氨酸生物合成酶系所受到的反馈抑制和阻遏，从而大幅度地提高L-亮氨酸的产量。2-TAr和β-HLr这两个标记，对L-亮氨酸高产菌的育种非常重要。

筛选磺胺胍抗性标记（SGr）菌株，在氨基酸产生菌选育上具有普遍提高产酸能力的作用，关于其详细机制，尚未见到令人信服的报道。一般认为，磺胺胍是细菌的生长因子——对氨基苯甲酸（PAPA）的结构类似物，而PAPA是叶酸的一个组分，不少细菌要求外界提供PAPA以合成其代谢中必不可少的辅酶—四氢叶酸，因而二者起竞争性拮抗作用。一旦菌株带有磺胺胍抗性标记，菌体的正常代谢发生改变，从而导致像氨基酸这样的代谢产物大量的积累。

图13-5 几种结构类似物的结构式

筛选利福平抗性（Rifr）菌株有利于L-亮氨酸产量提高，其机制尚不清楚，可能是通过改变菌体的正常代谢，使像氨基酸这类的代谢产物大量的积累。利福平为半合成广谱抗菌素，对革兰氏阳性和阴性细菌以及结核分支杆菌均有明显抗菌效应。抗菌机理是：通过与细菌RNA聚合酶的β亚基结合，抑制细菌RNA聚合酶的活性，妨碍细菌RNA转录的启始。但是RNA转录一旦开始，利福平则不起作用。

人们还发现：结核分支杆菌耐利福平与细菌RNA聚合酶的β亚基编码基因rpoB的突变有关。rpoB基因全长3543个碱基，当其中有81个碱基的核心区域发生突变时，利福平不能与RNA聚合酶β亚基结合，导致细菌对利福平耐受。黄海荣等通过对rpoB基因588bp易变区进行DNA序列分析，报道了我国耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变的特点：193株耐利福平临床分离株中有172株存在rpoB基因核心区域的点突变，突变率为89.1%（172/193）；46株利福平敏感株均未检测到核心区域的突变。突变类型包括39种，涉及了24个碱基，15种氨基酸。有86个耐利福平菌株的点突变位于11223位碱基，发生了从胞嘧啶向胸腺嘧啶的转换，使531位丝氨酸转换为亮氨酸，占所有菌株的44.6%(86/193)。另一个比较常见的发生突变的氨基酸是位于526位的组氨酸，其突变率是17.1%(33/193)，其相应密码子CAC的三个碱基都可能发生突变，其中最常见的是第

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一个胞嘧啶，可转换为腺嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶（分别是2/33，9/33，10/33）。531位和526位氨基酸突变率之和是62.3%，在我国结核分支杆菌与耐利福平有关的突变中最为常见。在研究中未发现有缺失或插入类型的突变，说明在我国结核分支杆菌产生耐利福平的主要形式是点突变。利福平的化学结构式为：

筛选L-异亮氨酸缺陷型的回复突变株也可望提高L-亮氨酸产量。因为L-亮氨酸生物合成的关键酶α-异丙基苹果酸合成酶的底物专一性宽，也能以丙酮酸为底物，催化丙酮酸生成α-甲基苹果酸，该酶受L-亮氨酸的反馈抑制。α-甲基苹果酸可在解除阻遏的L-亮氨酸生物合成酶系催化下，经过几步酶促反应生成α-酮基丁酸。因此，解除了L-亮氨酸对α-异丙基苹果酸合成酶反馈抑制的突变株，可利用该酶底物专一性宽(特异性不强)的特性，从丙酮酸生成α-酮基丁酸，α-酮基丁酸通过异亮氨酸、缬氨酸酶系转变成L-异亮氨酸，表现为L-异亮氨酸缺陷型的回复突变。在L-异亮氨酸缺陷型的回复突变株中，可能混有L-苏氨酸脱氨酶的回复突变和α-异丙基苹果酸合成酶对反馈抑制脱敏的两种类型突变株，可通过亮氨酸缺陷型的生长谱法加以认别。

3. 减弱或切断支路代谢，并增加前体物的合成

基于丙酮酸是合成L-缬氨酸和L-亮氨酸的共同前体物，α-酮基异戊酸是L-缬氨酸的直接前体物，又是合成L-亮氨酸的间接前体物，因此，在增大丙酮酸合成代谢流的同时，应使α-酮基异戊酸主要流向L-亮氨酸。从图13-1的代谢途径可知，欲切断α-酮基异戊酸合成L-缬氨酸这一代谢支路来选育L-亮氨酸高产菌是行不通的。因为催化合成三种支链氨基酸的转氨酶是同一个酶。因此，从选育营养缺陷突变株的角度看，只能通过选育异亮氨酸缺陷突变株来解除3个共用酶受所到的反馈阻遏。在亮氨酸反馈调节脱敏的L-亮氨酸高产菌中，该酶能优先利用α-酮基异戊酸来大量合成L-亮氨酸，但当菌体自身合成缬氨酸的量或培养基中添加的缬氨酸的量偏低，L-亮氨酸高产菌很容易发生回复突变，表现为产酸不稳定和产率下降。

选育磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力减弱、天冬氨酸族氨基酸缺陷等突变株，可增大L-亮氨酸生物合成代谢流，节约碳源，从而有利于L-亮氨酸产量的提高。选育以琥珀酸为唯一碳源生长微弱的突变株，即可获得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力减弱的突变株。

在乳糖发酵短杆菌中，亮氨酸的生物合成与赖氨酸之间还存在着代谢互锁， 赖氨酸生物合成分支途径的第一个酶（二氢吡啶-2，6-二羧酸合成酶，DDP合成酶）的合成受亮氨酸阻遏。因此，L-亮氨酸的大量积累会引起赖氨酸生物合成途径上的DDP合成酶的合成受到阻遏，从而使丙酮酸通向赖氨酸的代谢受阻。另外，有研究报道，L-亮氨酸生物合成的限速酶α-异丙基苹果酸合成酶，在1mmol/L亮氨酸存在下80%受抑制，而添加1 mmol/L赖氨酸之后，即可恢复，而且赖氨酸可促进该酶的活性。

4. 切断进一步代谢途径

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要大量积累L-亮氨酸，需切断或减弱亮氨酸进一步向下代谢的途径，使合成的亮氨酸不再被消耗，如选育以L-亮氨酸为唯一碳源不能生长或生长微弱的突变株。

5. 利用基因工程技术构建L-亮氨酸工程菌

基因工程技术主要通过目的基因扩增，增加生物合成途径中的限速酶，以提高目的产物的产量。从L-亮氨酸生物合成途径及代谢调节机制可知，α-异丙基苹果酸合成酶是L-亮氨酸生物合成途径中真正意义上的限速酶，将编码该酶的基因克隆到L-亮氨酸产生菌中，增加该酶的数量，以解除其“瓶颈”的限速作用，从而提高L-亮氨酸的产量。

综合以上分析，可以推理出L-亮氨酸高产菌可以带有的遗传标记为天冬氨酸族氨基酸缺陷，如：蛋氨酸缺陷（Met-）、异亮氨酸缺陷（Ile-）等；脯氨酸或丙氨酸缺陷（Ala-）；结构类似物抗性，如： 2-噻唑丙氨酸抗性（2-TAr）、α-氨基丁酸抗性(α-ABr)、β-羟基亮氨酸抗性（β-HLr）、亮氨酸氧肟酸盐抗性（LeuHxr）或缬氨酸抗性（Valr）、磺胺胍抗性(SGr)和利福平抗性(Rifr)等。L-亮氨酸高产菌的整体育种策略如图13-6所示。

图13-6 L-亮氨酸高产菌育种策略图

（三）L-亮氨酸产生菌的育种实例

Kisumi等由粘质赛氏杆菌异亮氨酸缺陷型菌株选育α-氨基丁酸（α-AB）抗性时，意外获得异亮氨酸缺陷的回复突变株，在10%的蔗糖培养基中可发酵积累L-亮氨酸10~13.5g/L。

Tsuchida等将乳糖发酵短杆菌2256进行诱变，获得具有2-噻唑丙氨酸抗性（2-TAr）兼蛋氨酸和异亮氨酸双重缺陷(Met-+Ile-)突变株No.218，在13%的葡萄糖培养基中可积累L-亮氨酸28g/L。证明了该菌株已解除了L-亮氨酸对其生物合成的第一个酶—α-异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制和阻遏。Akashi等研究了通风等条件对产酸率的影响，在最佳条件下该菌株产酸率可达30g/L。

张素鑫等由钝齿棒杆菌AS1.542经NTG连续诱变处理，选育得到一株L-亮氨酸产生菌AS1.1004，可产14g/L的L-亮氨酸。张素珍等继续以AS1.1004为出发菌株，经NTG和快中子处理后获得变异株L-421（L-异亮氨酸缺陷、2-噻唑丙氨酸抗性，Ile-+2-TAr），在2000L发酵罐上，于30℃发酵40h，可产L-亮氨酸20g/L。

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第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵

宫锦芗将黄色短杆菌T6-13经多次诱变处理，并结合氨基酸结构类似物的筛选，最终获得一株具有苏氨酸缺陷、2-噻唑丙氨酸抗性、β-羟基亮氨酸抗性及缬氨酸抗性(Thr-+2-TAr+β-HLr+Valr)的L-亮氨酸产生菌920-36，在最佳条件下，该菌株可在发酵液中积累13.5g/L的L-亮氨酸。

Tsuchida等还采用亚硝基胍（NTG）诱变等方法处理乳糖发酵短杆菌2256，最终选出一株L-亮氨酸高产菌（34号菌, Ile-+2-TAr+β-HLr），可在13%葡萄糖培养基中积累L-亮氨酸34g/L。

李彤等从钝齿棒杆菌中分离获得一株能稳定高产L-亮氨酸的菌株B20-1，其遗传标记为Pro-+ 2-TAr+ N-Leur+ N-Valr+ LeuHxr+ DL-N-LeuHxr，产酸可达15g/L。

刘党生等采用紫外线诱变处理天津短杆菌T6-13，选育得到一株L-亮氨酸产生菌No.145，其遗传标记为AHVr+Rifr，可产21.8g/L的L-亮氨酸。

齐秀兰等分别以黄色短杆菌T6-13、黄色短杆菌CF-435为出发菌，利用紫外线、氯化锂对其原生体进行复合诱变，选育得到两株L-亮氨酸产生菌57-4S、UV3-29，其遗传标记为Rifr，可产23.45g/L、26.73g/L的L-亮氨酸。

伍时华等利用原生质体融合技术定向选育的黄色短杆菌TQ9806（Met-+2-TAr+ α-ABr+β-HLr+SGr），可产22.7g/L的L-亮氨酸。

陈宁等以黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）HL41（CICC 10135）为出发菌种, 通过硫酸二乙酯（DES）和紫外线诱变处理，经摇管初筛、摇瓶复筛、遗传标记验证、单菌落分离和连续传代，筛选出一株L-亮氨酸生产菌株TK0303（Met-+ IleL+2-TAr+α-ABr+β-HLr + Rifr +SGr），该菌株发酵60h可产L-亮氨酸36g/L。 三、L-亮氨酸的发酵过程控制

以天津科技大学陈宁等选育的L-亮氨酸产生菌黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）TK0303（Met-+ IleL+2-TAr+α-ABr+β-HLr + Rifr +SGr）为例，介绍发酵法生产L-亮氨酸的工艺。吸取无菌水于10支试管（18×180）生长良好的活化斜面试管中，将所有菌悬液全部接入5L种子罐中的1500ml种子培养基[种子培养基成分（g/L）：无水葡萄糖37，豆饼水解液25mL，尿素2(分消后补加)，KH2PO4·3H2O 1.3，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 0.01，L-Met 0.4，VB1 300μg，VH200μg，pH7.0~7.2 0.075MPa 20min]，搅拌转速300~500 r/min，维持溶氧在20%左右，通过自动流加氨水和稀盐酸控制pH在7.0，培养温度28℃，培养至对数生长中后期，约26h转发酵，此时，菌体净增浓度△OD620nm在0.6以上。

按10%的接种量将种子液600mL接入装有5.4L发酵培养基的10L发酵罐中；发酵培养基成分为（g/L）：无水葡萄糖80，玉米浆46mL，(NH4)2SO4 20，NH4Ac 12， KH2PO4·3H2O 1.3，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.01, L-Met 0.7，L-Ile 0.060，L-Glu 0.40，VB1 160μg，VH 50μg，柠檬酸钠2.5， pH7.0~7.2 0.075MPa 20min。通风量和搅拌转速根据溶氧的要求调节，通过控制不同的搅拌转速和通风量来控制不同的体积溶氧水平。发酵过程溶氧控制为：0-10h，30%以上；10-16h，10-20%；16h以后，控制溶氧在0-5%之间（以饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧为0，以空气中的溶氧为100%）。通过自动流加25%的氨水控制pH在7.0；培养温度28℃；植物油作为消泡剂, 发酵过程泡沫较多时，通过消泡泵手动加入已灭菌的消泡剂消泡；补料分批发酵时，当残糖低于1.5时流加灭菌后冷却到28℃的糖液维持残糖在1.5～2.5之间，发酵过程中每隔4h取样进行各种参数测定。发酵60小时左右，可产L-亮氨酸36g/L。

第四节 缬氨酸发酵

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第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵

L-缬氨酸（L-valine）于1901年从酪朊蛋白中发现，化学名称为L-α-氨基异戊酸，分子式为C5H11NO2，相对分子质量为117.15。L-缬氨酸属于分支链氨基酸（branched chain amino acid, BCAA），是人体必需氨基酸之一，具有多种生理功能，主要用于食品、调味剂、动物饲料和化妆品的制造以及配制复合氨基酸输液、合成多肽药物和食品抗氧化剂等，尤其是在医学研究和治疗中的作用，日益受到重视。它在血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化以及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病的膳食治疗，败血症及术后糖尿病患者的治疗，加快外科创伤愈合，肿瘤患者的营养支持治疗中应用广泛。随着其研究的不断深入，应用范围也将进一步扩大。因此，L-缬氨酸的生产具有非常广的应用前景。 一、L-缬氨酸的生产方法

目前，L-缬氨酸的生产方法有提取法、合成法、发酵法等。 1提取法 动物血粉、蚕蛹及毛发水解液中L-缬氨酸的含量较高，从动物血粉和蚕蛹水解液中，应用离子交换技术从混合氨基酸中分离L-缬氨酸，分离的效率高，提取操作简单，生产周期短，但是成本高，不适合于现代化大工业生产。猪血粉中提取L-缬氨酸的回收率为14.7%；蚕蛹水解液中分离L-缬氨酸，回收率为23.68%。

2合成法

合成法很多，一种是由异丁酸与氨生成氨基异丁醇，再与氰化氢合成氨基异丁腈，然后水解而成。一种是由异丁醛与氰化氢合成羟基异丁腈，再与氨作用生成氨基异丁腈，水解得DL-缬氨酸，经化学法或酶法拆分得L-缬氨酸。也可由异丁醛与氰化钠和氯化铵直接合成氨基异丁腈，再水解而成。上述三种方法的得率为36%～40%。合成法所得为外消旋体，须经外消旋拆开。旋光拆开的方法很多，如用酰基-DL-氨基酸的酶进行水解，再利用游离氨基酸与酰化体的溶解度差进行分离。化学合成法生产成本高，反应复杂，步骤多，且有许多副产物。

3 发酵法

利用微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低，反应条件温和及易实现大规模生产等优点，是一种非常经济的生产方法。

1） 添加前体物发酵法

又称微生物转化法。这种方法使用葡萄糖作为发酵碳源、能源，再添加特异的前体物质即在氨基酸生物合成途径中的一些合适中间代谢产物，以避免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，经微生物作用将其有效转化为目的氨基酸。由于其前体物质如丙酮酸等稀少或价格昂贵，目前已很少采用此法生产L-缬氨酸。

2）直接发酵法

直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏作用，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。目前，世界上L-缬氨酸均采用直接发酵法生产。国外曾对发酵法所用L-缬氨酸优良生产菌的诱变育种和代谢调控作了一些研究，而国内尚处于研究与小规模生产阶段，菌株产酸水平不高，生产水平和产量远不能满足市场需求。因此，以微生物发酵法生产L-缬氨酸的研究具有重要的意义。

二、L-缬氨酸生产菌的育种策略与育种实例

（一）L-缬氨酸的生物合成途径及其代谢调节机制

L-缬氨酸的生物合成途径如图13-1所示，由图13-1可知，L-缬氨酸的生物合成途径是从丙酮酸开始，经过几步反应形成L-缬氨酸。丙酮酸在乙酰乳酸合成酶的催化下形

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第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵

成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在二羧酸还原异构酶的催化下发生甲基自动移位，形成α，β-二羟基异戊酸。该产物经二羟基脱水酶催化脱水后形成α-乙酰异戊酸，α-乙酰异戊酸在转氨酶的作用下形成L-缬氨酸。

丙酮酸是L-缬氨酸的直接前体物，催化丙酮酸生成α-乙酰异戊酸的酶系，与催化α-酮基丁酸生成α-酮基-β-甲基戊酸的酶系是相同的。这些酶的合成均受到三种分支链氨基酸的协同阻遏。其中α-乙酰乳酸合成酶是L-缬氨酸生物合成途径中的关键酶，受到L-缬氨酸的反馈抑制。此外，L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸生物合成途径中的最后一步转氨反应都是由同一种转氨酶催化完成的。由于限速酶的活性不仅受产物浓度的调节，也受基质浓度的调节，因此要高产L-缬氨酸就要解除L-缬氨酸本身对关键酶的反馈抑制，解除三种氨基酸对酶合成的多价阻遏。

研究发现，大肠杆菌由丙酮酸生成L-缬氨酸酶系的基因组成两个主要的操纵子，即ilv和leu 操纵子，如图13-3所示。Ilv操纵子包括了ilvG、ilvE、ilvD、ilvA、ilvC和ilvB基因，其中ilvDACB基因编码了合成L-异亮氨酸和L-缬氨酸途径共用的4种同工酶，即二羟基脱水酶、苏氨酸脱氨酶、乙酰乳酸异构还原酶和乙酰乳酸合成酶，ilvE基因编码L-缬氨酸转氨酶，而ilvG基因编码乙酰乳酸合成酶。为使L-缬氨酸合成反应有效的进行，优选地使用不表达苏氨酸脱氨酶活性的操纵子。可通过诱变野生型的ilvGMEDA操纵子或通过基因重组技术修饰将ilvA操纵子失活或将ilvA基因从ilv中敲除，就可以减弱苏氨酸脱氨酶的活性，切断苏氨酸到L-异亮氨酸的代谢支路，使得代谢途径中的4种同工酶完全用于L-缬氨酸的合成，以提高L-缬氨酸的产量。

埃希氏菌属的微生物由于其生长快、遗传分析研究清楚，被用作L-缬氨酸工程菌的宿主。从诱变的细菌细胞中筛选出不能在以柠檬酸而能在以葡萄糖为唯一碳源的琼脂平板上生长的突变株。进一步诱变筛选出既需硫辛酸又有H+-ATP酶缺失的突变株。通过将调控机制相当松弛的L-缬氨酸生物合成基因引入具有此突变性能的埃希氏菌属微生物可以提高菌株的L-缬氨酸生产能力。将ilvGMEDA操纵子的苏氨酸脱氨酶失活，得到解除型操纵子ilvGMEDA*（A*代表缺失ilvA基因或ilvA编码失活的苏氨酸脱氨酶），将含有解除型ilvGMEDA*操纵子的DNA片段引入需硫辛酸和/或H+-ATP酶缺失的埃希氏菌微生物可得到高产L-缬氨酸的生产菌。

ilvGMEDA操纵子中的ilvG、ilvM基因分别编码乙酰羟酸合成酶同工酶Ⅱ的大亚基和小亚基，除了同工酶Ⅱ（也称为AHASⅡ），还有同工酶Ⅲ（也称为AHASⅢ）。AHASⅢ由ilvIH操纵子编码，该操纵子由编码大亚基（催化亚基）的ilvI和编码小亚基（控制亚基）的ilvH组成。AHASⅢ受L-缬氨酸的反馈抑制。DNA编码的AHASⅢ的突变体小亚基可以具有一种含有一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位以及上述突变株的氨基酸序列，只要突变体小亚基能够与大亚基一起显示不受L-缬氨酸的反馈抑制的乙酰羟酸合成酶活性。将突变的ilvH基因导入大肠杆菌，可得到高产L-缬氨酸的微生物。

（二）L-缬氨酸高产菌的育种策略

诱变育种的目的即根据L-缬氨酸的生物合成途径，从遗传学角度选育能解除微生物正常代谢机制的突变株，提高目的产物的产量。根据L-缬氨酸的生物合成途径及其代谢调节机制（如图13-2所示），L-缬氨酸工业发酵高产菌株的选育方法如下：

1.出发菌株的选择

目前，世界上利用发酵法生产L-缬氨酸的出发菌株有北京棒杆菌（Corynebacterium pekineise），谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutacium）， 乳糖发酵短杆菌 (Brevibacterium lactofermentum)，大肠杆菌（Escherichia coli），黄色短杆菌（Brevibacterium flavum），粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens），芽孢杆菌属（Bacillus）和埃希氏菌属

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第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵

（Escherichia）的菌株等，这些菌株均可以作为选育L-缬氨酸生产菌的出发菌株。

2.切断或改变平行代谢途径

Nakazawa等以黄色短杆菌为出发菌株，选育出L-异亮氨酸与L-甲硫氨酸缺陷型突变株，此突变株可以发酵生产L-缬氨酸。Katasurada等以北京棒杆菌和谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过选育L-异亮氨酸与L-亮氨酸缺陷型突变株使L-缬氨酸的产量达19~28g/L。由图13-1可以看出，L-缬氨酸和L-异亮氨酸的生物合成途径是平行进行的，L-缬氨酸、L-亮氨酸与L-异亮氨酸的生物合成途径中共用了三种酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基脱水酶。选育L-亮氨酸、L-异亮氨酸营养缺陷型突变株可以使用于合成三种氨基酸的共用酶系完全用于L-缬氨酸的生物合成，进而提高L-缬氨酸的产量。同时α-酮基异戊酸是合成L-缬氨酸和L-亮氨酸的共同前体物。切断L-亮氨酸的合成途径不仅可以节省碳源而且解除了菌体生成L-缬氨酸酶系的反馈抑制和多价阻遏，使α-异丙基苹果酸合成酶脱敏，显著提高L-缬氨酸的产量。

3.解除菌体自身的反馈调节

L-缬氨酸合成中的第一个限速酶—乙酰乳酸合成酶受L-缬氨酸的反馈抑制，同时L-缬氨酸和L-异亮氨酸的合成酶系受三个末端：即L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的多价阻遏。因此，如果解除乙酰乳酸合成酶的反馈抑制和L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸生物酶系的多价阻遏，必将大大提高L-缬氨酸的积累。为此可选育L-缬氨酸结构类似物抗性突变株来解除L-缬氨酸的反馈调节。常用的L-缬氨酸结构类似物有2-噻唑丙氨酸（2-TA）、α-氨基丁酸（α-AB）、氟亮氨酸、正L-缬氨酸等。Tsuchida等选育出了具有β-羟基亮氨酸、β-2噻吩丙氨酸以及1，2，4-三唑丙氨酸抗性的大肠杆菌突变株AJ-11470，以此来解除产物的反馈抑制，从而发酵生产L-缬氨酸。Nakamura等报道选育α-氨基丁酸抗性突变株ATCC221118生产L-缬氨酸，发酵72~96h，L-缬氨酸的产量可达27~37g/L。徐旭东等以乳糖发酵短杆菌XT4为出发菌株，采用亚硝基胍（NTG）诱变处理，获得一株积累L-缬氨酸的高产菌A15，此菌株具有2-噻唑丙氨酸（2-TA）和α-氨基丁酸（α-AB）抗性，摇瓶产酸达33g/L。

SCCH2CHCOOHNH2NCHCH3-CH2-CH-COOHHC2

（α-氨基丁酸 α-AB） (2-噻唑丙氨酸 2-TA) (磺胺胍 SG)

NH2H2N--SO2-NH-CNHNH图13-7几种氨基酸类似物的结构式

4.增加前体物质的合成

由图13-1可以看出L-缬氨酸生物合成的前体物质是丙酮酸，为了积累更多的L-缬氨酸，必须提高丙酮酸的产量，可以选育以琥珀酸为唯一碳源生长慢、丙氨酸缺陷型以及氟丙酮敏感突变株来达到目的。Kyowa等选育出的L-缬氨酸突变株在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中进行培养时，对丙酮酸类似物比较敏感，通过选育丙酮酸类似物敏感突变株，降低了丙酮酸脱氢酶的活性，达到了积累丙酮酸的目的。由于丙酮酸的积累有利于高产L-缬氨酸，结果突变株L-缬氨酸的产量大幅度提高。

根据上述选育突变株的几条途径可选育组合型突变株，如营养缺陷型突变株和抗性结构类似物双重突变株，以提高目的产物的产量。张伟国等所选育的L-缬氨酸高产菌XQ-6就是双重突变株，此菌具有L-异亮氨酸缺陷、2-噻唑丙氨酸（2-TA）和α-氨基丁酸（α-AB）抗性以及α-氨基-β-羟基戊酸（AHV）抗性等标记。发酵培养72h，L-缬氨酸的产量可达40g/L。

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第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵

5.切断进一步代谢途径

要积累大量L-缬氨酸，需切断或减弱L-缬氨酸进一步向下的代谢途径，使积累的L-缬氨酸不再消耗，可通过选育不能以L-缬氨酸为唯一碳源生长，即丧失L-缬氨酸分解能力的突变株来实现。

6.选育营养缺陷型回复突变株

当一个菌株由于突变而失去某一遗传性状之后，经过回复突变可以再回复其原有遗传性状，这是因为当某一结构基因发生突变后，结构基因所编码的酶就因结构的改变而失活。而经过第二次回复突变后，该酶的活性中心结构就可以复原，而调节部位结构常常并没有回复，结果是酶恢复了活性，但是反馈抑制却已解除或并不怎么严重。因此可以利用选育营养缺陷型回复突变株来提高发酵目的产物的产量，例如选育α-乙酰乳酸合成酶缺陷突变株的回复突变株可以解除L-缬氨酸的反馈抑制以及L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸引起的多价阻遏。

7.利用基因工程技术构建L-缬氨酸工程菌

操纵子ilvI、H编码乙酰乳酸合成酶同工酶Ⅲ，受L-缬氨酸的抑制。通过获得ilvH编码的小亚基（控制亚基）的突变体，即具有一个或几个氨基酸DNA的取代、缺失、插入、添加或倒位，它能够与大亚基一起显示乙酰羟酸合成酶活性但已不受L-缬氨酸的反馈抑制，可用于构建高产L-缬氨酸的工程菌。

ilvA基因编码的苏氨酸脱氨酶是异亮氨酸合成的关键酶，因此若获得不表达苏氨酸脱氨酶活性的操纵子，就可以减弱苏氨酸脱氨酶的活性，使得代谢途径中的4种同工酶完全用于L-缬氨酸的合成。可通过诱变野生型的ilvGMEDA操纵子或通过基因重组技术修饰将ilvA操纵子失活或将ilvA基因从ilv中敲除。据报道，埃希氏菌属的微生物因其生长快、遗传分析研究清楚，常用作L-缬氨酸工程菌的宿主。经选育得到一种突变株，其不利用柠檬酸，以葡萄糖为唯一碳源，生长需硫辛酸且具有H+-ATP酶缺失。将ilvGMEDA操纵子的苏氨酸脱氨酶失活，得到解除型操纵子ilvGMEDA*（A*代表缺失ilvA基因或ilvA编码失活的苏氨酸脱氨酶），将此DNA片段引入上述突变株可得到高产L-缬氨酸的基因工程菌。

ilvE基因主要编码L-缬氨酸转氨基酶，Hoechst和Marquardt等将来源于大肠杆菌ATCC11303的ilvE基因片段克隆到pBR322质粒中，将重组质粒转化到大肠杆菌DG30中，所构建的工程菌株可以高产L-缬氨酸。

（三）L-缬氨酸高产菌代谢控制育种实例

在六七十年代国外就进行了L-缬氨酸发酵生产的研究，Nakayama等于1961年选育了具有氨基酸缺陷的L-缬氨酸生产菌；Udaka等于1960年选育了L-缬氨酸生产菌；Tsuchida于1975年选育2-噻唑丙氨酸抗性突变株；Kisumi于1971年选育α-氨基丁酸抗性突变株；在发酵培养基中所积累的L-缬氨酸均在30g/L 左右。

1975年中国科学院微生物研究所氨基酸组使用北京棒状杆菌AS1.299经硫酸二乙酯（DES）诱变处理后，获得一株突变株AS1.586，可积累大量的L-缬氨酸。在500L发酵罐放大试验中，优化条件下发酵43h，L-缬氨酸产量达26.8g/L。

1986年中科院微生物研究所唐任天等利用钝齿棒杆菌AS1.542诱变获得L-缬氨酸产生菌AS1.001，此菌株带有AHVr、Ile-标记，在适宜的条件下，L-缬氨酸积累可达到36g/L。

1988年Mitsubishi等选育出具有DL-氨基丁酸抗性标记的北京棒杆菌，发酵72hL-缬氨酸的产量达20g/L。

1989年沈阳药学院黄海华等以棒状杆菌T6-13野生菌为出发菌株，经紫外线和NTG多次诱变，获得一株新型的L-缬氨酸生产菌104（2-TAr＋AHVr＋β-HLr），其L-缬氨

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第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵

酸产量可达10g/L。

1990年Konickova等用DES诱变北京棒杆菌，选育相应的氨基酸缺陷型突变株，在优化培养基条件下发酵72h，其L-缬氨酸的产量为6~16g/L。

1990年中国科学院微生物研究所的王秀玲等以北京棒状杆菌产L-缬氨酸突变株334为亲株，经NTG诱变，最终获得多重抗性突变株VT-405(Ile-+α-ABr +2-TAr+NLr+NVr)，产酸达28g/L。VT-405再经紫外线和LiCl复合处理，获得A7菌株。A7菌株保留其亲株的遗传特性，未再增加新的标记，产酸为30g/L。采用适宜的供氧和pH控制，进行补料分批发酵，平均产酸率高达36.78g/L。

1991年Mitsubishi-Petrochem等所选育出MJ-233-HS-AEC-1菌株，在30℃培养3天，可产L-缬氨酸12g/L。

1993年Katsurada等以北京棒杆菌和谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过选育聚酮化合物（霉酚酸、浅蓝菌素、迷人醇、富伦菌素等）抗性突变株，得到菌株AJ3434、AJ12341、AJ3776和AJ12342，其L-缬氨酸产量可达20g/L、28g/L、19g/L和26g/L。

1994年刁新民等以北京棒杆菌多重抗性突变株125为出发菌株，经多次提取精制条件试验，获得了最佳发酵培养基配方和较佳的生产工艺条件，提取精制得率达95％以上。

1995年江南大学的张伟国等以DES诱变处理黄色短杆菌XQ5122，得到突变株V3-36(Leu-+α-ABr+AHVr)，在10%葡萄糖培养基中可积累L-缬氨酸23g/L。以NTG诱变V4-153，得到一株突变株(Leu-+α-ABr+AHVr+2-TAr)，再进行单菌落分离，得到突变株ZQ-2，能在培养基中积累L-缬氨酸40g/L。

1996年沈阳药科大学药物所来彩霞等以天津短杆菌为出发菌株，采用硫酸二乙酯诱变处理，筛选出一株可以产12.8g/L L-缬氨酸的突变株，经过培养基配方优化试验，该菌株摇瓶发酵产L-缬氨酸达28.6g/L。

1996年Katsurada等又以北京棒杆菌和谷氨酸棒杆菌为出发菌株，选育以乙酸为唯一碳源的突变菌株和以丙酮酸为唯一碳源丙酮酸类似物敏感性突变珠AV1和AV2，L-缬氨酸的产量分别为39g/L和36g/L，较原始的出发菌株提高了36%。

1999年中国药科大学微生物教研室的徐旭东，以乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)XT-4为出发菌株，采用NTG诱变处理，获得了一株积累L-缬氨酸的突变菌株A15(α-TAr+α-ABr)，该菌株摇瓶产酸26.42g/L，条件优化后，可以达到33.1g/L。

2002年江苏华昌集团有限公司的王平以产L-谷氨酸菌乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermenturn)ATCCl3058为出发菌株，经过NTG和DES多次诱变处理，获得一株产L-缬氨酸突变菌株，其遗传标记为Leu-+Ile-+Met-+AHVr+2-TAr，在10%的葡萄糖培养基中产酸达28g/L～30g/L，在含14%葡萄糖培养基上产酸达35g/L。

2002年天津科技大学陈宁等以黄色短杆菌HL41（CICC 10135）为出发菌株，通过硫酸二乙酯（DES）和紫外线诱变处理，经摇管初筛、摇瓶复筛、遗传标记验证、单菌落分离和连续传代，筛选出一株L-缬氨酸生产菌株TV2564(Ile-+Leu-+SGr+α-ABr+2-TAr)， 在10L发酵罐上发酵生产L-缬氨酸，发酵64h产酸55g/L。 三、发酵条件的优化

以天津科技大学陈宁等选育的L-缬氨酸产生菌黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）TV2564 (Ile-+Leu-+SGr+α-ABr+2-TAr)为例，介绍发酵法生产L-缬氨酸的工艺。吸取无菌水于10支试管（18×180）生长良好的活化斜面试管中，将所有菌悬液全部接入5L种子罐中的1500ml种子培养基[种子培养基成分（g/L）：葡萄糖30.0，玉米浆30mL，尿素1.2，酵母粉 4， KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 0.01，VB1300?g，生物素200?g，pH7.0~7.2 0.075MPa 20min]，搅拌转速300~500 r/min，维持溶氧在20%左右，通过自动流加氨水和稀盐酸控制pH在7.0，培养温度32℃，培养至对数生长中后

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第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵

期，约15h转发酵，此时，菌体净增浓度△OD620nm0.6以上。

按10%的接种量将种子液600mL接入装有5.4L发酵培养基的10L发酵罐中；发酵培养基成分为（g/L）：葡萄糖80，豆饼水解液20mL，玉米浆25mL， (NH4)2SO45，KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 0.01, Ile 0.06，Leu 0.2，Met 0.5，VB1 200?g，生物素 100?g，pH7.0~7.2，0.075MPa，20min。通风量和搅拌转速根据溶氧的要求调节，通过控制不同的搅拌转速和通风量来控制不同的体积溶氧水平。发酵过程溶氧控制为：0-12h，20%以上；12-16h，0-5%；16h后进入快速产酸期，此时溶氧显示值为0，最好控制供氧为发酵菌体最大耗氧的85%左右。通过自动流加25%的氨水控制pH在7.0；16h后调节pH为7.2。培养温度32℃；植物油作为消泡剂, 发酵过程泡沫较多时，通过消泡泵手动加入已灭菌的消泡剂消泡；补料分批发酵时，当残糖低于1.5时流加灭菌后糖液，维持残糖在1.5～2.0之间，发酵过程中每隔4h取样进行各种参数测定。发酵64小时左右，可产L-亮氨酸54g/L。

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第十三章 异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵

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（执笔 徐庆阳）

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/47k6.html