组培1

关于如何控制组培中的褐变文献综述

摘要：有效控制外植体褐变是植物组织组织培养过程中的关键技术。本文对导致植物组织培养中外植体褐变的主要影响因素及防止和减少褐化的相应途径进行了综述,旨在为该领域的深入研究提供系统的理论基础。

关键词：组织培养 褐变 外植体

褐化现象在植物组织培养中普遍存在，外植体褐化是植物组织培养的一大难题。褐化的主要原因是外植体组织被切割后，多酚类化合物从切口处向外分泌，多酚氧化酶被激活，多酚类物质被氧化形成褐色有毒的醌类物质，损伤切面迅速变成棕褐色或暗褐色，褐色物逐渐向培养基中扩散，抑制其它酶的活性，毒害整个外植体组织，外植体随之进一步变褐而最终死亡[1,2]。褐化现象主要发生在外植体、植物愈伤组织的继代培养、悬浮细胞培养、花药培养以及原生质体的分离与培养中。褐化产物不仅使外植体、细胞、培养基褐变,而且抑制外植体正常的生理生化反应,影响外植体的生长与分化,甚至导致其死亡。

外植体的基因型、外植体年龄、大小、部位、种类、培养基成分、激素水平和培养条件等因素都会影响褐化的发生[3]。 1外植体的选择

植物的基因型对外植体褐变发生频率、程度都存在根本性影响,轻者影响细胞生长和繁殖,重者导致细胞死亡。这是由于基因会从根本上导致植物体内相关物质合成量有差异。在木本植物中,单宁含量或色素含量高的植物容易发生褐变[4],这是由于酚类的糖苷化合物是木质素、单宁或色素的合成前体,酚类化合物含量高,木质素单宁或色素形成就多,而酚类化合物含量高将导致褐变的发生,因此,木本植物一般比草本植物更容易发生褐变。在植物组织培养中,不同物种之间褐化程度差异很大,就是同种植物的不同品种间也存在一定差异[5]。外植体所处状态也会影响褐变，具体表现为外植体生理状态、取材部位、取材时期、外植体的大小及受伤程度、外植体预处理等。余慧琳等[11]在蝴蝶兰花梗腋芽离体快繁过程发现带腋芽花梗节段褐变程度比腋芽要轻。徐文华等

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发现在原球茎增殖过程中原球茎切割时，不应切得太小，否则褐化情况

严重。此外，外植体越老，木质素含量越高，越易褐化。幼龄材料比成龄材料褐变轻,这可以用幼龄材料的酚类化合物含量少,而成龄材料多来解释。延长外植体消毒时间会使消毒效果增加,但对外植体伤害也大,从而加剧褐变。因而消毒时间应掌握在一定范围内,才能保证较高的外植体存活率。 2控制温度和光照

2.1光照

在自然光照条件下,生长的植物体内酶活性较高,外植体易褐变,当把母株放置在黑暗或弱光条件下生长,植株组织内光诱导的那些参与酚类合成与氧化的酶活性就大大减弱,酚类化合物的合成减少,其氧化产物酮类也相应减少,使褐变得到控制[4]。苹果、桃、葡萄、金 缕梅和丝穗木等植物的茎尖外植体,如果取自田间自然光照下的植株枝条,接种后很容易褐变,而事先对取材母株或枝条进行遮光处理,之后再切取外植体,则可有效控制褐变[13-14]。 2.2温度

温度对组织褐变影响比较大,从酶促反应的角度,其根本原因是植物体内酶活性和温度直接相关。低温不仅会降低相关酶(如PPO)的活性,从而抑制褐变,还可以抑制酚类化合物的合成,减少底物酚类氧化,进而减轻褐变[7]。温度越高，褐化越严重，低温可减轻褐化。 3选择适宜的培养基 3.1培养基的状态

液体培和半固体培养系统中,外植体溢出的有毒次级代谢产物可以得到充分的扩散,降低其浓度,因而对外植体造成的危害较轻,如果再加上滤纸做成纸桥,褐变抑制程度有所提高[8],这可能是滤纸吸附了少量有害的酚类物质。培养基中的琼脂含量降低,外植体褐变严重,培养基中水分含量相对增加,外植体褐变产生的鞣质具有一定的极性,更加易于溶出，毒害细胞,加重外植体的褐变。为降低褐化程度,应该在允许的条件下,适当增加培养基的硬度,琼脂用量大,培养基硬度大,则褐变率低;随着琼脂用量的减少,培养基浓度减少,组织褐变加重[15]。 3.2无机盐

在初代培养时,培养基中无机盐浓度过高会引起酚类物质外溢,加剧褐变。降低盐的浓度,尤其是降低Mn2+和Cu2+等可作为氧化酶类的组成成分或辅因子离子的浓度,能够降低酶活性、抑制酚类氧化、减轻褐变[9]。盐浓度的高低与褐变没有明显正相关性,可能与其他影响因素相互制约,而在不同外植体中制约更加明显,从而表现出盐浓度高低与褐变程度的相关性。 3.3植物激素

不同植物分裂素和生长素能影响外植体发育和褐变酶活性,细胞分裂素BA或KIN具有使得PPO活性提高的作用。通常生长素浓度过高可促进褐变，研究发现高量 6-BA 会使组织严重褐化。 3.4 pH值

培养基低pH值可降低多酚氧化酶的活性和底物利用率,抑制褐变[4]。同时pH值影响细胞膜的渗透性,以及相应酶的活性,从而影响褐变。一般来说,较为酸性的环境可以减少褐变。培

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养基添加物。为减轻褐化程度,可向培养基内加入一些化学添加剂。一般有吸附剂、抗氧化剂、螯合剂和激活剂四大类。常用的吸附剂有AC(活性炭)和PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂,能吸附培养基中的有害物质,减轻褐变。粉末状与颗粒状AC相比,吸附性更强,一般在培养基中加入2～3ｇ/Ｌ的AC。张红针对库拉索芦荟组培中的褐变现象,在培养基中加入活性炭500.0ｍｇ/Ｌ,环境温度控制在25℃,有利于减轻褐[10]。考虑到AC也吸附培养基中的生长调节物质,对外植体的生长带来竞争性抑制,应结合具体情况改变培养基的物质配比。

4采用适当的培养方式

外植体的接种方式与褐变发生有一定相关性,这可能与外植体的极性相关。用薯蓣的茎段做外植体进行组培时,将茎段正向插入培养基中,褐变现象明显,而将茎段倒向插入时,则褐变消失。用漂浮培养法可有效防止决明原生质体沉淀、改善通气状况、使营养分布均匀、抑制酚类物质释放、减轻褐变、提高原生质体分裂率。接种后放置的时间越长,易褐变的材料伤口周围会积累更多醌类物质。

5添加抗氧化剂和其他抑制剂或吸附剂

研究表明培养基中添加 PVP、椰子汁、柠檬酸、VC、活性炭等可有效抑制褐变。活性炭不但对培养基中的醌类化合物有吸附作用，同时也吸附了部分分裂素、生长素、维生素等相关成分，从而减少了这些物质的浓度，在抑制褐化的同时也影响到芽的萌发和增殖效果。 6结语

在植物组织培养中,从褐化产生途径角度分析,得出引起褐化是多因素共同作用的结果。从外植体的选择角度上讲,外植体材料的基因型、年龄、取材部位、时期、大小和受伤害状态等都会影响褐变的发生;就培养基而言,有无机盐成分、生长激素浓度、状态、硬度、ｐＨ值、化学添加剂等影响因素,还有培养条件(光照、温度)、最后培养方式都会影响褐变的发生。从发生机理角度分析,组织培养褐变主要是由酶促褐变反应导致酚类物质被氧化的结果,同时也会有非酶促反应的影响。因此，深入了解褐变有关机制,从理论上认识组织培养中的褐化现象,找到影响褐变的主导因子和克服褐变的有效方法,可从实践上防止褐化的发生,减少经济损失。

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