芽孢杆菌活菌数及芽孢数检测方法

芽孢杆菌活菌数及芽孢数检测方法

1主题内容与适用范围

本方法规定了芽孢杆菌总数的测定方法；

本方法适用于测定微生物制剂中芽孢杆菌总数 。

2方法提要

芽孢杆菌总数是指水样在一定条件下培养后(培养基成分，培养温度和时间、pH、 需氧性质等)所得1mL水样所含菌落的总数。按本方法规定所得结果只包含一群能在营养琼脂上发育的嗜中温的需氧的芽孢杆菌菌落总数。

3 培养基与试剂

3.1 营养琼脂成分

蛋白胨 10g，酵母膏 5g，NaCl 10g，琼脂20g，水1000mL。

3.2 制法: 将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.2， 分装于玻璃容器中(如用国产含杂质较多的琼脂时，应先过滤)，经121℃灭菌20min， 储存于冷暗处备用。

3.3生理盐水的制备：按总体积的0.9%称量NaCl并混合均匀，然后用移液枪或移液管吸取9ml生理盐水加入到试管中，并在121℃灭菌20min备用。

4 仪器

高压蒸汽灭菌器， 干热灭菌箱， 培养箱，36±1℃， 电炉， 天平， 冰箱， pH计，灭菌试管，平皿(直经9cm)、刻度吸管等。

5 活菌计数方法

5.1 取固体样品5.0g，溶于95mL蒸馏水(此时稀释20倍)，加入适量已灭菌玻璃珠，于200rpm摇床中振荡20min。

5.2 用移液枪从锥形瓶取1ml样品液至装有9ml无菌水的试管中，逐步稀释至适当梯度。

5.3 吸取0.2mL适当稀释梯度的菌液放入对应平板中，用已灭菌的涂布棒来回涂匀。

5.4 涂匀的平板置于30℃培养箱中培养20~30h，待长出清晰可见的菌落，进行计数。

6菌落计数及报告方法

作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿一半，而其余一半中菌落数发布又很均匀，则可将此平皿计数后乘2 以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。

7 不同稀释度的选择及计数方法

7.1 首先选择平均菌落数在30～300之间者进行计算， 若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之。

7.2有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间， 则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数。若大于2 则报告其中稀释度较小的菌落总数。若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数。

7.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300， 则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

7.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

7.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

7.6 若所有稀释度的均无菌落生长，则以〈1乘以稀释倍数报告之。

7.7 菌落计数的报告: 菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。

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