iCycler iQ荧光实时多波长PCR检测系统操作说明 - 图文

iCycler iQTM荧光实时多波长PCR检测系统

操作说明

iCycler iQTM Multi-Color Real Time PCR Detection System

Operating Instructions

Catalog Number

170-8740

如与英文版说明书有不符之处以英文版说明书为准

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2．iCycler iQTM荧光实时多波长PCR检测系统操作速成

2.1 简介：

iCycler iQTM荧光实时多波长PCR检测系统可以最多一次检测96个样品，且每个样品中同时可以检测4个不同波长的荧光信号。也就是说，只要标记不同荧光探针，iCycler可以对同一个孔中两种以上的PCR产物（最多四种）同时进行实时分析。这样对多重PCR反应或使用内对照（Internal Control）定量的PCR反应的检测就十分方便。

在反应过程中，不同的荧光信号通过与其匹配的不同波长的滤光镜组来检测。比如，在一个反应管中同时有四种荧光探针共存，分别标记了FAM、HEX、Texas Red?和CyTM5，在收集其荧光信号数据的时候，必须同时使用FAM滤光镜组、HEX滤光镜组、Texas Red滤光镜组和Cy5滤光镜组。所有的收集的信号由iCycler的软件进行分析整理，在PCR反应结束后，该软件可以显示其各自的荧光曲线和标准曲线，并得到这四种荧光探针分别对应的靶DNA的定量结果。

在每次使用iCycler进行PCR荧光定量实验之前，系统必须获得孔间差异因子（Well Factor）和纯染料校准（Pure Dye Calibration）的数据。系统通过这些数据来区分不同的荧光信号，矫正孔间的误差。本章节将详细的介绍这两者的调节方法。您在使用本仪器前请先仔细阅读本章的内容，这将有助于您能够快速地完成实验并获得理想的实验数据。

2.2 ：iCycler 操作速成

1. 开机前先让摄象系统预热30分钟。接通iCycler的电源，并连上电脑，打开iCycler的软件。如果本仪器在上次使用后被搬动过，请在Run Time Central 模块中的Imaging Service窗口检查遮光框的校正情况，详见6.2。

2. 如果要使用新的荧光染料/滤光镜组，必须进行一次纯染料校准（Pure Dye Calibration），使系统获得相关数据，详见2.4。

3. 在96孔薄壁反应板（96-well Thin Wall plate，产品序列号 223-9441）内加入PCR反应试剂和待测样本。完成后在反应板上盖一块光学级封带（Optical Quality sealing tape，产品序列号 223-9444），用封带涂抹器（塑料扁平齿）

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将其涂抹光滑。注意，无论带不带手套，都不要让手指接触到封带表面。完成后撕去封条四周的白条。如果不用96孔薄壁PCR反应板，而是用单独的PCR反应管或八连管时，请在加完样品后盖上相匹配的盖子。注意，为防止放入iCycler的PCR反应管被压碎，在使用绿色抗凝环（green anticondensation ring）时至少放8个反应管；如果没有使用该环，则至少要加14个反应管。 4. 在Protocol Workshop模块中设置PCR热循环的程序（thermal protocol），包括温度、时间、循环次数等参数的设置。详见5.1。

5. 在Protocol Workshop模块中设置反应板设置文件（Plate Setup）。先创建一个新的反应板设置文件，再根据本次实验的所用的荧光染料选择其对应的滤光镜设置文件（Fliter Wheel Setup file），详见5.2.5。最后，在设置窗口的96孔模拟布局图中选择本次实验使用哪些孔、样品类型（sample type）以及要检测的荧光基团种类。如果样品类型是标准品的话，还要输入其对应的量。全部完成后再点击“View Plate Setup”键，进行确认。详见5.2。 6. 确认上一步中选择的滤光镜组是否就位。详见5.2.5。

7. 如果实验需要使用孔间差异矫正板（external well factor plate）进行系统孔间差异矫正的，先将该板放入iCycler；如果是使用反应板内部矫正的，直接将步骤3中准备好的PCR反应板放入iCycler。详见2.3。在Protocol Library模块中 “View Protocol”窗口选择PCR热循环文件；同样在该模块的“View Plate Setup”窗口选择反应板设置文件。完成后按“Run”键。

8. 随后系统自动切换到 “Run Prep”窗口，用户在此确认PCR热循环文件和反应板设置文件是否正确。在“Sample volume is”文件框中输入反应体系的体积；根据本次实验内容在“Identify Protocol Analysis”中选择是PCR定量/熔点曲线（PCR Quantification/ Melt Curve）还是纯染料校准（Pure Dye Calibration）；在“Well Factor Source”中选择系统孔间差异矫正是使用孔间差异矫正板（Well Factor Plate）还是使用反应板内部矫正（Experimental Plate）。一切都完成后点击“Begin Run”键（见图2.1）。 9. 给本次的数据记录文件（opd文件）起名。

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10. 如果是使用反应板内部矫正的，系统会在PCR反应前自动收集孔间差异因子的数据；如果使用了孔间差异矫正板，则系统会先用大约5分钟时间收集孔间差异因子数据，然后自动进入暂停模式（Pause Mode ）。取出孔间差异矫正板，将步骤3中准备好的PCR反应板放入iCycler中，盖好。点击“Continue Running Protocol”（见图2.6）。

11. PCR循环开始后，系统会打开Run-Time Central模块对实验进行实时监控。当实验进行到荧光收集循环时，Data Analysis模块会自动打开，进行数据的收集和分析。

2.3 ：孔间差异因子（Well Factor）

在采用荧光实时法对PCR反应进行检测的过程中，反应管之间的差异对结果的准确性有一定的影响，这就是所谓的孔间差异因子（Well Factor）。为了获得更科学更真实的结果，iCycler在PCR反应开始前必须获得孔间差异因子的数据，以便于对每个反应管中荧光信号强度进行矫正。一般矫正孔间差异因子的方法有两种，一是用孔间差异矫正板（Well Factor Plate），二是反应板内部矫正。

相较而言，在这两种方法中，采用反应板内部矫正是较简单较科学的方法。这种方法得到的矫正数据也叫动力学孔间差异矫正因子。使用这个方法的前提是在每个反应管中必须含有相同浓度同种成分的荧光基团。比如，在一块反应板的

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每个反应管中都加入50nM荧光素，100nm HEX，125nM Texas Red和200nM Cy5，就可以使用反应板内部矫正。但如果某管中和其他管成分不同，比如某管中荧光素含量为100nM或200nM的话，这种方法就不可行了。如采用反应板内部矫正，在“Run Prep”窗口的“Well Factor Sourse”选项框中选择“Experimental Plate”选项即可（见图2.1）。系统软件会在PCR反应前自动收集孔间差异因子的数据。

如果在实验中采用如SYBR Green I 或溴乙啶等能与DNA结合的荧光染料，那么上述方法就无效了。因为在PCR反应的靶DNA预变性过程中，这样的荧光信号强度比较弱，统计所得的孔间差异因子的数据偏差较大。解决这个问题的方法有两种，一是采用孔间差异矫正板；二是在PCR主反应液中加入微量的荧光素稀释液（详见2.3.2）。加入这种稀释液后，在95oC下SYBR Green I等的荧光信号强度会增加，这样用反应板内部矫正也能得到较准确的孔间差异因子的数据。

2.3.1 ：孔间差异因子数据来源（Well Factor Source）： 反应板内部矫正（Experimental Plate）

如果使用反应板内部矫正的话，荧光探针必须没有二级结构（在纯染料校准时也必须解开二级结构），所以必须在PCR反应板第一次被加热到90oC以上的

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时候系统才会开始收集荧光信号，并得到孔间差异因子的数据。

2.3.2 ：使用反应板内部矫正来进行孔间差异因子矫正操作指南

如果选择使用反应板内部矫正，系统软件会在用户设定的PCR热循环文件开始前先插入执行一个名为“Dynaicwf.tmo”的文件，95oC加热90秒。这样用户在设置PCR热循环文件的时候就要考虑到这一点，在预变性段中要减去相应的时间。比如，您本来的设定是95oC预变性10分钟，这一来您就要改成95oC预变性8.5分钟。

在执行这个插入文件的过程中，被选定的滤光镜组会进入工作位置，系统软件开始收集各反应管中的荧光信号，统计孔间差异因子。当这些完成后，系统软件的Run-time Central 界面中会跳出提示信息（见图2.3）。

如果用SYBR Green I，那么我们建议调节PCR主反应液的荧光染料终浓度为10nM。先将1mM的荧光素校准染料（Fluorescein Calibration Dye，产品序列号170-8780）用PCR缓冲液（10mM Tris，pH 8.0，50mM KCl，3mM MgCl2）稀释1000倍，配成1μM的稀释液。然后按照稀释液：PCR主反应液=1：99的比例进行配制，比如10μl 1μM稀释液加990μl PCR主反应液，这样就能得到荧光素终浓度为10nM的PCR主反应液。

在反应板内部矫正完成后，系统软件会将其数据储存在本次实验的数据记录（opd文件）中，然后自动开始执行设定的PCR热循环文件。

2.3.3 ：孔间差异因子数据来源（Well Factor Source）： 孔间差异矫正板（Well Factor Plate）

当一次实验中各反应管中所含的荧光基团的种类和含量不同，比如某反应

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管含有200nM 荧光素而其他反应管只含100nM，或者某反应管用的是Texas Red而其他都用荧光素。象这样的情况下，孔间差异因子只能用孔间差异矫正板来矫正。

所谓的孔间差异矫正板，就是一块和本次实验一样的PCR反应板，其反应管与实验用PCR反应板的反应管顺序一一对应。在孔间差异矫正板上，每个反应孔中含有和对应的实验用PCR反应板的反应管中相等体积的溶液以及相同种类和浓度的荧光基团。比如本次实验用PCR反应板的A1反应管内PCR反应液的总体积是50μl，100nM 荧光素，那么孔间差异矫正板的A1反应管也加50μl液体，100nM 荧光素。如果您一个反应管中含有不止一种荧光基团，那么我们建议您在孔间差异差异矫正板上使用我们伯乐公司的孔间差异矫正板稀释液（External Well Factor Plate Solution，产品序列号 170-8794），当然只有一种荧光基团也可以使用本产品。

2.3.4 ：制备孔间差异矫正板

本公司提供的孔间差异矫正板稀释液是10×的，使用前先用ddH2O稀释10倍。然后在孔间差异矫正板的反应管中加入与其对应实验用PCR反应板反应管内PCR反应液相同体积的1×孔间差异矫正板稀释液和同样成分的荧光基团。比如实验用PCR反应板A5反应管内有50μl PCR反应液，100nM荧光素，那么孔间差异矫正板的A5反应管同样要加入50μl 1×孔间差异矫正板稀释液（内含荧光素100nM）。

加样完毕后，在板上盖一块干净的光学级封带。将板略微离心一下，使各反应管管壁上没有液体残留，全部流到反应管底部。

您可以在Run-Time Central模块的Imaging Service窗口确认准备好的孔间差异矫正板中每管的荧光信号遮光框有没有调节好，CCD照相机像素有没有饱和（详见6.2）。

2.3.5 ：使用孔间差异矫正板来进行孔间差异因子矫正操作指南

在一块PCR反应板上进行不同的实验项目或纯染料校准时只能使用本法矫正孔间差异因子。

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将准备好的孔间差异矫正板放入iCycler，盖上热盖。

在Protocol Library模块中选择PCR热循环程序和反应板设置文件，然后点击“Run”。

在“RunPrep”界面中的“Well Factor Source”选项框中选择“Well Factor Plate”选项。其他选项相同。完成后点击“Begin Run”。

此时系统软件会在用户设定的PCR热循环文件开始前先插入执行一个名为“External.tmo”的文件，长度为3分钟（见图2.4）。内容为： （95oC 10秒 60oC 30秒）×2 60oC 1分钟

在此期间系统会收集孔间差异因子数据， Run-Time Central模块会显示相应信息（见图2.5）。

系统在孔间差异因子收集完毕后，会进入暂停模式，此时取出孔间差异矫正板，放入实验用PCR反应板，盖好热盖，点击“Continue Running Protocol”（见图2.6）。

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2.4 ：纯染料校准（Pure Dye Calibration）和RME文件（RME Files）

任何一种荧光染料，第一次在iCycler上使用前，都必须进行一次纯染料校准。当然如果更换滤光镜组，也是如此。一种荧光染料/滤光镜组组合在同一台iCycler只需要进行一次纯染料校准（前提是相应的滤光镜组不被更换），其数据会被系统保存，以后实验中可以读取。

纯染料校准的功能，其实就是使系统在收集信号的时候能准确辨认某一种荧光信号。它的操作方法很简单，就是把相应的荧光染料校准溶液（每种荧光染料有其相应的荧光染料校准溶液）加入反应板的各反应管中，然后放入iCycler，设置、运行一个PCR热循环文件，所得到的校准数据被系统保存在C:\\Program Files\\Bio-Rad\\iCycler\\Ini文件夹的REM.ini文件中。

一次纯染料校准可以同时测定16种不同荧光染料/滤光镜组组合（一次至多含4种不同荧光染料）。测定完成后，系统自动将数据存入RME文件。一旦一种荧光染料/滤光镜组组合在一台iCycler上进行过纯染料校准，那在以后在这台iCycler的实验中如果使用到这种组合就可以读取其数据。只要您进行一次纯染料校准，RME文件就会被更新一次。如果同种组合再校准一次，那么新的校准数据会覆盖原来的校准数据。

如果一次实验中使用没有进行过纯染料校准的荧光染料/滤光镜组组合时，那么系统会提出警告。此时必须对这种组合进行一次纯染料校准以更新RME文件。为了以防万一（比如系统崩溃），您可以在C:\\Program Files\\Bio-Rad\\iCycler\\Ini文件夹中找到RME文件并将其改名备份在硬盘的其他区域或软盘中。

2.4.1 ：纯染料校准RME文件例举

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因为单种荧光染料可以通过多种滤光镜组检测到，比如Texas Red就可以通过490/530、530/575、548/595、575/620、635/680等滤光镜组检测。系统必须通过RME文件的记录来辨认通过某滤光镜组收集的荧光信号是对应什么荧光染料的信号。所以整个RME文件分为许多小文件段。每个文件段对应每种荧光染料在不同的滤光镜组下的校准数据。

以下是一个荧光染料组合的纯染料校准数据RME存档的例子。使用的荧光染料为FAM-490和Cy5-635。 [FAM-490]

490/20X_!_530/30M=5.384598e+003 635/30X_!_680/30M=1.565864e+001 [CY5-635]

490/20X_!_530/30M=2.951601e+001 635/30X_!_680/30M=6.064747e+003

假设再对另外的一种荧光染料组合FAM-490和Texas Red 575进行一次纯染料校准，则RME文件将被更新为： [FAM-490]

490/20X_!_530/30M=5.332098e+003 635/30X_!_680/30M=1.565864e+001 575/30X_!_620/30M=3.864038+001 [Texas Red-575]

490/20X_!_530/30M=1.40998e+001 575/30X_!_620/30M=4.737024e+004

[CY5-635]

490/20X_!_530/30M=2.951601e+001 635/30X_!_680/30M=6.064747e+003

经过第二次校准后，您可以注意到文件中FAM-490对于490/530滤光镜组的校准数值略有改变，增加了FAM-490对于575/620滤光镜组的校准值和Texas

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Red-575对于两种滤光镜组的校准值，这是因为第二次校准后RME文件更新造成的；而FAM-490和Cy5-635对于635/680滤光镜组的数据没有改动，这是因为第二次校准没有测试相关数据。

上述第二份REM文件适合于使用FAM-490 & Texas Red –575组合和FAM-490 & Cy5-635组合以及三种荧光染料单独使用的实验。但当使用Texas Red –575 & Cy5-635组合时就不行。因为该文件没有Texas Red –575对于635/680滤光镜组的校准值和Cy5-635对于575/620滤光镜组的校准值。此时只能进行第三次纯染料校准，得到第三份RME文件： [FAM-490]

490/20X_!_530/30M=5.632098e+003 – 未变 635/30X_!_680/30M=1.565864e+001 – 未变 575/30X_!_620/30M=3.864038+001 – 未变 [Texas Red-575]

490/20X_!_530/30M=1.40998e+001 – 未变 575/30X_!_620/30M=4.81645e+004 – 更新 635/30X_!_680/30M=2.64573e+000 – 新值 [CY5-635]

490/20X_!_530/30M=2.951601e +001 – 未变 635/30X_!_680/30M=6.123537e+003 – 更新 575/30X_!_620/30M=4.746395e+001 – 新值

经过第三次纯染料校准后，这三种荧光染料对应三组滤光镜组的任意组合都可以使用了。当然，您可以在一次纯染料校准中同时将其全部完成。

2.4.2 ：制备纯染料校准反应板（Pure Dye Calibration Plate）

制备纯染料校准板必须使用本公司提供的荧光染料校准溶液（Pure Dye Calibration Solution，产品序列号170-8792）。每种荧光染料都有其对应的荧光染料校准溶液。该溶液中含有相应荧光标记的寡核苷酸，其浓度都已经调配到最佳工作状态，所以注意，千万不要对其稀释。若一次对多种荧光染料（最多4种）

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进行校准，那么在纯染料校准反应板上加样的时候，必须将其对应的校准溶液分开加到不同反应管中。纯染料校准反应板制备的具体操作步骤如下：

将第一种荧光染料校准溶液在反应板上加10个反应管，每孔50μl。 若有其他荧光染料则同上操作，至多再加3次（注意要加在未加过样的反应管中）。

加完样后在板上盖一块干净的光学级封带，将反应板略微离心一下，使反应管壁上没有液体残留，全部流到反应管底部。

由于反应板各反应孔中所含荧光染料种类不同，所以必须用孔间差异矫正板来矫正孔间差异因子，具体操作见2.3.4。

对于SYBR Green I我们建议您准备用500pg/μl的DNA溶液稀释100,000倍的SYBR Green I的校准液；对于溴乙非啶我们建议你准备同样DNA终浓度为500pg/μl，溴乙非啶终浓度为1μg/ml的校准液。

2.4.2 ：纯染料校准上机操作

设置一个PCR热循环文件，内容为： 55oC 1分钟 55oC 1分钟 ×10

在软件界面上选择在循环的第二步（55oC ，1分钟，10个循环）进行实时检测（显示黄色照相机状图标）（见图2.7）。

设置反应板设置文件。在模拟96孔模拟图上选择各反应管中所含的荧光染料的种类。如图2.8，B2-B11反应管中加了荧光素校准溶液；D2-D11反应管中

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加了Texas Red校准溶液；H2-H11中加了Cy5校准溶液。

把孔间差异矫正板放入iCycler，在Protoco Library 模块中选择刚才设置的PCR热循环文件和反应板设置文件，点击“Run”。

在“Run Prep”的界面中，输入反应体系的体积，在“Identify Protocol Analysis”选项框中选择“Pure Dye Calibration”。注意，一旦选择该选项，则在 “Well Factor Sourse”选项框中“Experimental Plate”选项就会变灰而成为不可选选项（见图2.9）。

点击“Begin Run”。

给本次数据记录文件起名。此时系统开始收集孔间差异因子数据，详见2.3。其数据收集完毕后，系统自动进入暂停模式。取出孔间差异矫正板，放入纯染料校准反应板，点击“Continue Running Protocol”。此时系统开始正式进行纯染料校准数据收集，完成后，系统界面会有提示信息跳出（见图2.10）。

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2.5 ：1.440（1.0 ）版文件的转换

2.5.1：数据记录（Data File）

只要在C:\\Program Files\\Bio-Rad\\iCycler\\Ini文件中保存有REM.ini文件并在该文件中有FAM/SYBR的记录，1.440以后各版本的软件都可打开在1.440版软件下保存的实验数据记录。FAM/SYBR记录的正确格式如下： [FAM/SYBR]

485DF22_!_535RDF45=4.021013e+003

在软件版本更新时，系统会自动将RME文件存在原先的位置。

在2.1880以后的版本中，系统会自动将RME的数据保存到opd文件中，所以你可以把你的数据拷贝到另外的一台电脑上进行分析。如果你在2.1.880版中打开一个1.440版的数据记录，再保存。那么此时系统中的RME数据也将被写入该数据记录。

注意：如果当前的RME.ini文件中没有FAM/SYBR的记录，1.440版的数据记录将不能被打开。当然，上述在2.1.880版中打开再保存一个1.440数据记录来写入RME文件的方法也失效。

2.5.2：PCR热循环文件（Thermal protocols）

1.440版中设置的PCR热循环文件通用于以后所有版本的软件。

2.5.3：反应板设置文件（Plate Setups）

1.440版的反应板设置文件不能和以后的版本通用。您不能在1.440版以后版本软件中打开或是修改1.440版中设置的反应板设置文件，但可以在其中浏览它的内容，也可以将其打印下来，这样可以很方便地重新设置这些文件。如果您在新版本软件中使用1.440版的反应板设置文件，系统会提示您该文件需要升级

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（见图2.11）。

2.6 ：1.880（2.0 ）版文件的转换

1.880版的文件通用于以后所有版本软件。

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3．iCycler 系统软件简介

3.1 ：iCycler软件界面的构成

iCycler的软件界面分为5个功能模块，分别是“Protocol Library”模块、“Protocol Workshop”模块、“Run Time Central”模块、“User Profile”模块和“Data Analysis”模块。通过这些模块，用户可以很方便使用iCycler进行各项实验。如图3.1，这是“Protocol Library”模块的“View Protocol”窗口，其功能是管理已保存的PCR热循环文件。iCycler的系统将PCR热循环文件储存成带有“tmo”后缀的文件，详见5.1。同样，“View Plate Setup”窗口是管理已保存的反应板设置文件。反应板设置文件被系统保存成带有“pts”后缀的文件，详见5.2。在iCycler软件界面中，各模块的选择切换键始终在界面的最左边，用户可以很方便地选择切换。

3.1.1 ：Protocol Library 模块

Protocol Library是对已保存的PCR热循环文件、反应板设置文件、实验数据记录进行管理的模块。用户可以在其中实现以下功能：

浏览已保存的PCR热循环文件 浏览已保存的反应板设置程序文件

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浏览反应板设置文件中各反应管的标识和对应的模板量（标准品）。 将数据记录切换到Data Analysis模块中进行分析。

将已保存的PCR热循环文件切换到Protocol Workshop模块中进行修改。 将已保存的反应板设置程序文件切换到Protocol Workshop模块中进行修改。 以已保存的PCR热循环文件和反应板设置文件开始一次实验。

当用户要设置新的PCR热循环文件或反应板设置程序文件时进行简要说明。

3.1.2 ：Protocol Workshop 模块

Protocol Workship是设置PCR热循环文件和反应板设置文件的模块。用户可以在其中实现以下功能：

修改已保存的PCR热循环文件 修改已保存的反应板设置文件 新建PCR热循环文件并将其保存 新建反应板设置文件并将其保存

以新建的PCR热循环文件和反应板设置文件开始一次实验。

当一次实验中新建的PCR热循环文件和反应板设置文件分别保存后，用户以后可以根据实际需要和原有文件重新排列组合使用。

3.1.3 ：Run-Time Central 模块

实验时当用户在Protocol Workshop模块的“Run Prep”窗口中确认完反应的各项设置后，系统自动转到Run Time Central模块。该模块实际上就是用来实时监测反应的各项参数，包括反应开始时间、预计结束时间、实时温度变化曲线等。

3.1.4 ：Data Analysis 模块

有两种进入Data Analysis模块的方法：

一是在实验中，当系统开始收集实验数据时，Run-Time Central模块就会自动打开Data Analysis模块；

二是您可以在Protocol Library模块中打开一个实验数据记录，系统会自动

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切换到Data Analysis模块。

在该模块中用户可以实现以下功能： 浏览实验数据记录 优化数据记录

设置样品的临界循环数（threshold cycle，即Ct值） 建立标准曲线

确定未知样品的初始模板量 对实验数据进行统计分析。

3.1.5 ：User Profile 模块

该模块独立于其他的4个模块。在该模块中，用户可以对PCR热循环的一些内部默认参数进行设置，还可以得到选择转轮上各滤光镜的位置信息（在该模块中不能对滤光镜进行设置，详见5.2.5）。

3.2 ：iCycler PCR热循环内部参数

在iCycler中一个PCR热循环文件可以最多包含9种不同的循环，每种循环最多可以有9个步骤。在步骤设置中，至少要设置保持温度（Setpoint Temperature）和保持时间（Dwelling Time）；在循环设置中，除了其各步骤设置外，至少还要设置其循环次数。

3.2.1 ：保持温度和时间调控范围

iCycler PCR热循环的温控范围是4.0—100.0oC，保持时间的调控范围是1秒到99分钟59秒（99:59）。

如果某步骤保持时间设置为0秒，那么iCycler会先将温度调节到该步骤设置的温度，然后立刻执行下一个步骤。

如果用户想长时间保持在某一温度又不能决定确切保持时间，那么您可以使用永久保温选项（Infinite Hold option）进入永久保温模式。一旦某个步骤被设置成该模式，则系统会一直保持该步骤设定的温度直到人为地结束该程序。如果被设置成永久保温模式的步骤并不是PCR热循环文件的最后一步，那么在执行该

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步骤的时候系统会自动切换成暂停模式（Pause Mode）并一直保持该步骤设定的温度。此时用户可以点击“Continue Running Protocol”键，系统就会执行后面的程序。

3.2.2 ： 高级选项

以下是PCR设置文件的高级选项。其具体运用详见5.1.4。

Ramp Rate & Ramp Time：Ramp Rate指的是执行PCR热循环文件时的加热/冷却速度，而Ramp Time指的是相连两个步骤之间的间隔时间，其实也就是两个步骤之间的加热/冷却时间。iCycler的默认设置是Ramp Rate最大，Ramp Time最短，也就是加热/冷却速度最快，间隔时间最短。用户可以根据需要修改Ramp Rate或Ramp Time。但一个表格中只能选择一种方法来调整。Ramp Rate以0.1oC/秒为最小计量单位，加热时可调范围是0.1－3.3oC/秒，冷却时可调范围是0.1－2.0 oC/秒。Ramp Time的最小计量单位是0.1 oC。

自动增加/降低保持时间或温度（Automatic Increment/Decrement of Temperature or Dwelling Time Setpoint）：我们可以举个例子说明这个设置的作用。比如PCR热循环文件有一个步骤是55oC，30秒。而通过这个设置，用户可以使这个步骤每过一个循环温度上升（或下降）0.1oC，保持时间每过一个循环上升（或下降）1秒。这样就为降落式PCR（TD-PCR）等有此类特殊要求的PCR反应提供了方便。温度改变的最小计量单位是0.1oC/循环。保持时间改变的最小计量单位是0.1秒/循环。

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4．Protocol Library 模块

在Protocol Library模块中，用户可以浏览已保存的PCR热循环文件、反应板设置文件、数据记录等。在该模块中也有修改、运行PCR热循环文件和反应板设置文件的选项。一旦用户选择了这些选项，系统会自动切换到Protocol Workshop模块，详见第5章。

在Protocol Library窗口顶端，有四个窗口切换选择键，点击它们可进入不同的窗口。这些窗口分别是：

View Protocols：管理已保存的PCR热循环文件（tmo文件），详见4.1。 View Plate Setup：管理已保存的反应板设置文件（pts文件），详见4.2。 View Quantities and Identifiers：显示选定反应板设置文件的详细信息，详见4.3。

View Post-Run Data：管理实验数据记录，详见4.4。

4.1 View Protocls

当用户切换到Protocol Library模块时，系统默认自动进入“View Protocol”窗口（见图4.1）。当然，用户也可以点击界面上端的“View Protocol”窗口选择切换键进入。

如图4.1，您可以看到有关于PCR热循环文件的文件框、表格、图表占了这个窗口面积的2/3强。靠近窗口下端的曲线图中，横坐标（X轴）代表反应温度，纵坐标（Y轴）代表反应时间。该曲线图主要显示以下信息：

曲线图顶端的抬头框中显示各循环的循环次数（如图4.1中，40x代表循环40次）；

抬头框下面显示各步骤的保持温度（对应曲线X轴）和保持时间（对应曲线Y轴）；

某个步骤下面有个照相机形状图标代表系统在该步骤收集荧光信号（如图4.1中，55oC，0:30 下方）。灰色的照相机图标表示收集的数据用于已有数据记录的分析；黄色的照相机图标表示对这次本实验进行实时分析；绿色的照相机图标表示收集熔点曲线数据。

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如果想在PCR反应中使用自动增加/降低保持时间或温度功能（Automatic Increment/Decrement of Temperature or Dwelling Time Setpoint），见5.1.4。

该窗口上部5个文件框分别显示以下信息：

左上的文件框可选择目标PCR热循环文件所在的驱动器，如图4.1所示，该目标PCR热循环文件存储在C盘；

左下的文件框用来选定目标PCR热循环文件的存储路径（必须在上面文件框选定的驱动器中），如图4.1所示，该目标PCR热循环文件存储路径为C:\\Program Files\\Bio-Rad\\iCycle\\User1\\；

上述两个文件框右边的一个文件框（Protocol Files）显示所有选定路径下所有的PCR热循环文件（tmo文件），并对其进行选择；

右上的文件框（Viewing Protocol ）显示当前的PCR热循环文件名； 右下的文件框（Owner’s ID）显示创立当前PCR热循环文件用户的登录名。 窗口最右侧有4个键，他们从上到下分别是：

Edit：点击该键，系统自动切换到Protocol Workshop模块的“Edit Protocol”窗口对当前PCR 热循环文件进行修改，详见5.1；

Custom：点击该键，系统自动切换到Protocol Workshop模块的“Edit Protocol”窗口，用户可以新建一个PCR热循环文件，详见5.1；

Run：点击该键，系统自动切换到Protocol Workshop模块的“Run Prep”窗口，用户可以以当前的PCR文件（配合“View Plate Setup”中选定的反应板设

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置文件）进行实验，详见5.4；

Print：打印窗口下端记录当前PCR热循环文件内容的表格。

4.2 View Plate Setup

在Protocol Library模块窗口上端点击“View Plate Setup”窗口切换选择项便可进入该窗口。其界面分布与“View Protocol”窗口相似，最大的不同的在于该窗口下端是96孔反应板模拟布局图，而不是曲线图（见图4.2）。

该窗口上部6个文件框分别显示以下信息：

左上的文件框可选择目标反应板设置文件所在的驱动器，如图4.2所示，该目标反应设置文件存储在C盘；

左下的文件框用来选定目标反应板设置文件的存储路径（必须在上面文件框选定的驱动器中），如图4.2所示，该目标反应板设置文件存储路径为C:\\Program Files\\Bio-Rad\\iCycle\\User1\\；

上述两个文件框右边的一个文件框（Plate Setup Files）显示所有选定路径下所有的反应板设置文件文件（pts文件），并对其进行选择；

右上的文件框（Viewing Optical Plate）显示当前的反应板设置文件名； 右中的文件框（Owner’s ID）显示创立当前反应板设置文件用户的登录名； 右下的文件框（Filter Wheel Setup）显示当前反应板设置文件对应的滤光镜

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组设置文件名。

窗口最右侧有4个键，他们从上向下分别是：

Edit：点击该键，系统自动切换到Protocol Workshop模块的“Edit Plate Setup”窗口对选定反应板设置文件进行修改，详见5.2；

Custom：点击该键，系统自动切换到Protocol Workshop模块的“Edit Plate Setup”窗口，用户可以新建一个反应板设置文件，详见5.2；

Run：点击该键，系统自动切换到Protocol Workshop模块的“Run Prep”窗口，用户可以以当前的反应板设置文件（配合“View Protocol”中选定的PCR热循环文件）进行实验，详见5.4；

Print：打印窗口中当前反应板设置文件的96孔模拟布局图。 窗口右下的两个文件框从上到下分别是：

Quantity Units：显示选定反应板设置文件中标准品的计量单位。其单位可以是拷贝数（copynumber）、微摩尔（micromole）、纳摩尔（nanomole）、皮摩尔（picomole）、法摩尔（fetomole）、诶摩尔（attomole）、毫克（milligram）、微克（microgram）、纳克（nanogram）、皮克(picogram)、法克（fetogram）、诶克（attogram）；

Fluorophores Defined：显示各种荧光染料对应的不同颜色的蜡笔图标。 在96孔模拟布局图上方有三个选项，用来选择在布局图上显示选定反应板设置文件的不同设置信息，从左到右分别是：

Samples：这是系统默认的选项，显示用于反应的反应管的位置以及样品类型（标准品、未知样品、空白、对照、纯染料等）；

Fluos：显示各反应管中使用的荧光染料种类，每种荧光染料由右侧“Fluorophores Defined”文件框中规定的颜色来表示。所有不用检测的反应管用灰色表示（见图4.3）；

Notes：显示选定反应板设置文件的创建者对该文件的说明（见图4.4）。

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4.3 View Quantities and Identifiers

显示当前反应板设置文件各孔的详细设置信息（见图4.5）

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4.4 View Post-Run Data

在View Post-Run Data窗口中，用户可以浏览所有已保存的数据记录（opd文件）。

该窗口上部5个文件框分别显示以下信息：

左上的文件框可选择目标数据记录所在的驱动器，如图4.6所示，该数据记录存储在D盘；

左下的文件框用来选定目标数据记录的存储路径（必须在上面文件框选定的

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驱动器中），如图4.6所示，该数据记录存储路径为D:\\customer data\\；

中间的一个文件框显示所有选定路径下所有的数据记录（opd文件），并对其进行选择；

右上的文件框（Protocol Used in Run）显示选定的数据记录在实验中使用的PCR热循环文件；

右下的文件框（Plate Setup Used in Run）显示选定的数据记录在实验中使用的反应板设置文件。

该窗口左下部4个文件框分别显示以下信息：

Data Analysis File Name：显示选定的数据记录的名称；

Filter Wheel Setup Used in Run：显示选定数据记录在实验中使用的滤光镜组设置文件；

Use External Calibration file：在该框中打钩表示选定数据记录在实验中使用孔间差异矫正板来矫正孔间差异因子；不打钩则表示使用的是反应板内部矫正；

Data Run Notes：显示用户对该实验记录的说明。 该窗口右下部2个选项的用途如下：

Analysis Data：如果选定数据记录用于荧光定量或熔点曲线分析，则点击该选项，系统会自动切换到Data Analysis模块进行分析；

Calibration：如果选定数据用于纯染料校准，则点击该选项，系统会自动切换到Data Analysis模块进行分析。

注意：如果用户选择“Calibration”选项，系统会根据选定纯染料校准数据记录对现存的RME文件进行更新。如果用户想保有原有的RME文件，请在打开纯染料校准文件之前将RME文件备份。

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5．Protocol Workshop 模块

在Protocol Workshop模块中，用户可以新建、修改PCR热循环文件、反应板设置文件。在Protocol Workshop有4个窗口，他们分别是：

Edit Protocol：新建和修改PCR热循环文件，详见5.1； Edit Plate Setup：新建和修改反应板设置文件，详见5.2；

Quantities/Identifiers：显示反应板设置文件的详细信息，详见5.3； Run Prep：实验进行前对选定的PCR热循环文件、反应板设置文件等进行确认，详见5.4。

5.1 Edit Protocol

这个窗口是进入Protocol Workshop模块时系统默认的显示窗口。在该窗口中，用户可以新建PCR热循环文件，也可以对已有的PCR文件进行修改。

如图5.1，在该界面上部大约占整个窗口面积1/3的是PCR热循环文件的温度—时间曲线图。横坐标代表保持时间（X轴），纵坐标代表保持温度（Y轴）。而窗口的最下方是显示PCR热循环文件内容的表格。窗口中部的各文件框和功能键从左到右分别是：

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Change Protocol Filename：显示PCR热循环文件的名称，并可以对其进行修改；

Owner：显示创建该PCR热循环文件的用户的登录名； Protocol Option： PCR热循环文件的高级选项框； Save：保存对当前PCR热循环文件的修改；

Run：以当前PCR热循环文件进行一次实验（配合Edit Plate Setup窗口中选定反应板设置文件）；

Optical Data Colletion：确定在哪些步骤中进行荧光信号收集。

在本节中，5.1.1和5.1.2介绍如何新建和修改PCR热循环文件；5.1.3介绍PCR热循环文件的曲线图；5.1.4介绍PCR热循环文件的高级选项；5.1.5介绍在PCR热循环文件中如何插入、删除循环或步骤，5.1.6介绍荧光信号收集步骤的确定；5.1.7介绍PCR热循环文件的保存。

5.1.1 新建PCR热循环文件操作速成

1．在Protocol Library模块中，选择View Protocol窗口；

2．点击Custom键，系统会自动切换到Protocol Workshop模块的Edit Protocol

窗口；

3．在该窗口下端的表格中设置PCR热循环文件。这个表格和窗口上部的曲

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线图是相互对应的，一旦表格中的内容发生了变动，在曲线图中也会发生相应变化。对于新建一个PCR热循环文件，系统会先提供一个系统默认的PCR热循环文件，让用户根据需要对其进行修改 双击表格中需要修改的单元格，然后根据需要输入对应参数。

如果要在某个循环前插入一个循环，先点击表格上方 “Cycle”字样下的“Insert”键，然后点击表格中该循环的任何区域；如果要在最后一个循环后插一个循环，同样点击“Cycle”字样下的“Insert”键，然后点击表格最后一个循环下面第一排空行的任意区域。一个PCR热循环文件最多能有9个循环。如果您把光标移到 “Insert”键上并右击鼠标，会跳出选项让您选择是插入循环中的步骤是一步、两步还是三步，用户可以根据实际情况选择。

如果要删除某个循环，先点击表格上方 “Cycle”字样下的“Delete”键，然后点击表格中需删除循环的任何区域。

如果要在一个循环中的某个步骤前插入一个步骤，先点击表格上方 “Step”字样下的“Insert”键，然后点击表格中该步骤的任何区域。一个循环最多可以有9个步骤。如果您把光标移到 “Insert”键上并右击鼠标，会跳出选项让您选择是在选定步骤的前面还是后面插入，用户可以根据实际情况选择。

如果要删除某个步骤，先点击表格上方靠左“Step”字样下的“Delete”键，然后点击表格中需删除步骤的任何区域。

4．如果用户想在PCR热循环文件中加入高级选项，只需在Protocol Option

选项框中在对应选项前打钩即可。

如果您选择了永久保温选项（Infinite Hold），系统会在窗口下方的表格中自动加出一列，表头为“Hold”。如果某个步骤要永久保温，在表格中该步骤的“Hold”选项中打钩即可。

如果您选择了熔点曲线选项（Melt Curve），系统会在窗口下方的表格中自动加出三列。表头为“Melt Curve”的一列是用来选择哪个步骤来收集熔点曲线数据，同时，在“Optical Data Collection”选项框中该步骤会显示绿色照相机图标。表头为“+Temp”和“-Temp”的两列，则是启动了

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自动增加保持温度选项（Increment Temperature）和自动降低保持温度选项（Decrement Temperaure）。举例来说，如果您在某个循环中某个步骤的“+Temp”中输入0.5，那么在执行该循环过程中，每循环一次，该步骤的保持温度会增加0.5oC；同样，如果您在某个循环中某个步骤的“-Temp”中输入0.5，那么在执行该循环过程中，每循环一次，该步骤的保持温度会降低0.5oC。

如果您选择了自动增加保持温度选项（Increment Temperature）或自动降低保持温度选项（Decrement Temperaure）时，系统会在窗口下方的表格中自动加出三列。“+Temp”和“-Temp”的功能如上文所述，表头为“Begin Repeat”的那列表示开始执行自动增加\\降低保持温度开始的循环次数，表头为“How often”那列表示循环几次执行一次自动加温/降温。比如在某个循环的某个步骤的“+Temp”格中输入0.5，在“Begin Repeat”格中输入3，在“How often”格中输入2，那就表示在该循环执行到第三次后，每过2次循环，该步骤的保持温度会增加0.5oC。

如果您选择了自动增加保持时间选项（Increment Time）或自动降低保持时间选项（Decrement Time），类似于自动增加/降低保持温度选项，系统也会在窗口下方的表格中自动加出三列。表头为“Begin Repeat”和“How often”两列的功能如上文所述，表头为“+Time”和“-Time”的两列也类似于“+Temp”和“-Temp”，如果您在表格中某个循环的某个步骤的“+Time”格中输入00:05，则在执行该循环过程中，每循环一次，该步骤的保持时间会增加5秒；如果您在表格中某个循环的某个步骤的“-Time”格中输入00:05，则在执行该循环过程中，每循环一次，该步骤的保持时间会减少5秒。

如果您选择加热/冷却速度选项（Ramping），系统会在窗口下方的表格中自动加出一列，表头为“Ramp Rate”。用户可以对每两个相邻步骤间的加热/冷却速度进行调整。

如果您选择循环名称选项（Cycler Name），系统会在窗口下方的表格中自动加出一列，表头为“Cycler Desript.”，用户可以对每个循环进行简要的说明；如果您选择步骤说明选项（Step Process），系统会在窗口下方的

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表格中自动加出一列，表头为“Process”，用户可以对每个步骤进行简要的说明。

5．在Optical Data Collection文件框中选择在哪些步骤进行荧光信号收集。

在某步骤前的小方块中点击一下，会出现一个灰色的照相机图标，代表该步骤收集的数据用于原有数据记录的分析；

在某步骤前的小方块中点击两下，会出现一个黄色的照相机图标，代表该步骤收集的数据用于本次实验的实时分析；

如果在某步骤前的小方块中点击两下后再点击一下，照相机图标会消失，同时也取消了在该步骤的信号收集任务。

6．双击Change Protocol Filename文件框，输入PCR热循环文件的文件名。 7．点击“Save”键，会出现一个对话框，再次点击“Save”键，保存该PCR

热循环文件。

您可以将PCR热循环文件和反应板设置文件保存在iCycler文件夹或其任何子目录中。

5.1.2 修改PCR热循环文件操作速成

1．在Protocol Library模块中，选择View Protocol窗口；

2．在该窗口左上的文件框中选择目标PCR热循环文件所在的驱动器； 3．在下面的文件框中选择目标PCR热循环文件的保存路径； 4．在Protocol Files文件框中选择目标PCR热循环文件的文件名； 5．点击“Edit”键，系统会自动切换到Protocol Workshop模块的Edit Protocol

窗口；

6．在该窗口下部的表格中设置PCR热循环文件。这个表格和窗口上部的曲

线图是相互对应的，一旦表格中的内容发生了变动，在曲线图中也会发生相应变化。双击表格中需要修改的单元格，然后根据需要输入对应参数。

如果要在某个循环前插入一个循环，先点击表格上方 “Cycle”字样下的“Insert”键，然后点击表格中该循环的任何区域；如果要在最后一个循环后插一个循环，同样点击“Cycle”字样下的“Insert”键，然后点击

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表格最后一个循环下面第一排空行的任意区域。一个PCR热循环文件最多能有9个不同循环。如果您把光标移到 “Insert”键上并右击鼠标，会跳出选项让您选择是插入循环中的步骤是一步、两步还是三步，用户可以根据实际情况选择。

如果要删除某个循环，先点击表格上方 “Cycle”字样下的“Delete”键，然后点击表格中需删除循环的任何区域。

如果要在一个循环中的某个步骤前插入一个步骤，先点击表格上方 “Step”字样下的“Insert”键，然后点击表格中该步骤的任何区域。一个循环最多可以有9个步骤。如果您把光标移到 “Insert”键上并右击鼠标，会跳出选项让您选择是在选定步骤的前面还是后面插入，用户可以根据实际情况选择。

如果要删除某个步骤，先点击表格上方靠左“Step”字样下的“Delete”键，然后点击表格中需删除步骤的任何区域。

7．果用户想在PCR热循环文件中加入高级选项，只需在Protocol Option选

项框中在对应选项前打钩即可。

如果您选择了永久保温选项（Infinite Hold），系统会在窗口下方的表格中自动加出一列，表头为“Hold”。如果某个步骤要永久保温，在表格中该步骤的“Hold”选项中打钩即可。

如果您选择了熔点曲线选项（Melt Curve），系统会在窗口下方的表格中自动加出三列。表头为“Melt Curve”的一列是用来选择哪个步骤来收集熔点曲线数据，同时，在“Optical Data Collection”文件框中该步骤会出现绿色照相机图标。表头为“+Temp”和“-Temp”的两列，则是启动了自动增加保持温度选项（Increment Temperature）和自动降低保持温度选项（Decrement Temperaure）。举例来说，如果您在某个循环中某个步骤的“+Temp”中输入0.5，那么在执行该循环过程中，每过循环一次，该步骤的保持温度会增加0.5oC；同样，如果您在某个循环中某个步骤的“-Temp”中输入0.5，那么在执行该循环过程中，每过循环一次，该步骤的保持温度会降低0.5oC。

如果您选择了自动增加保持温度选项（Increment Temperature）或自动降

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低保持温度选项（Decrement Temperaure）时，系统会在窗口下方的表格中自动加出三列。“+Temp”和“-Temp”的功能如上文所述，表头为“Begin Repeat”的那列表示开始执行自动增加\\降低保持温度开始的循环次数，表头为“How often”那列表示循环几次执行一次自动加温/降温。比如在某个循环的某个步骤的“+Temp”格中输入0.5，在“Begin Repeat”格中输入3，在“How often”格中输入2，那就表示在该循环执行到第三次后，每过2次循环，该步骤的保持温度会增加0.5oC。

如果您选择了自动增加保持时间选项（Increment Time）或自动降低保持时间选项（Decrement Time），类似于自动增加/降低保持温度选项，系统也会在窗口下方的表格中自动加出三列。表头为“Begin Repeat”和“How often”两列的功能如上文所述，表头为“+Time”和“-Time”的两列也类似于“+Temp”和“-Temp”，如果您在表格中某个循环的某个步骤的“+Time”格中输入00:05，则在执行该循环过程中，每循环一次，该步骤的保持时间会增加5秒；如果您在表格中某个循环的某个步骤的“-Time”格中输入00:05，则在执行该循环过程中，每循环一次，该步骤的保持时间会减少5秒。

如果您选择加热/冷却速度选项（Ramping），系统会在窗口下方的表格中自动加出一列，表头为“Ramp Rate”。用户可以对每两个相邻步骤间的加热/冷却速度进行调整。

如果您选择循环名称选项（Cycler Name），系统会在窗口下方的表格中自动加出一列，表头为“Cycler Desript.”，用户可以对每个循环进行简要的说明；如果您选择步骤说明选项（Step Process），系统会在窗口下方的表格中自动加出一列，表头为“Process”，用户可以对每个步骤进行简要的说明。

8．Optical Data Collection文件框中选择在哪些步骤进行荧光信号收集。

在某步骤前的小方块中点击一下，会出现一个灰色的照相机图标，代表该步骤收集的数据用于以前数据记录的分析；

在某步骤前的小方块中点击两下，会出现一个黄色的照相机图标，代表该步骤收集的数据用于本次实验的实时分析；

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如果在某步骤前的小方块中点击两下后再点击一下，照相机图标会消失，同时也取消了在该步骤的信号收集任务。

9．点击“Save”键，可以保存对该PCR热循环文件的修改； 10．

如果用户想对该文件重新命名，双击Changer Protocol Filename文件

框，然后输入新的文件名称。

您可以将PCR热循环文件和反应板设置文件保存在iCycler文件夹或其任何子目录中。

5.1.3 ：PCR热循环曲线图

Edit Protocol窗口上方的曲线图使PCR热循环文件的设置变得十分形象化（见图5.2）。曲线图上部的抬头框里的数字代表正下方曲线代表的循环在文件中的序号。抬头框下面标明了各步骤的保持温度和保持时间，当然有时因为空间有限，部分步骤的保持温度和时间无法在此处标注。

如果用户想放大或是缩小代表时间的X轴，按住键盘上的“Ctrl”键，同时把光标放在X轴上，按住鼠标左键进行左右拖曳。往左拖曳缩小，往右拖曳放大。松开鼠标左键，操作完成。

如果某个步骤为指定为进行荧光收集的步骤，则在曲线图中代表该步骤的曲线上方会出现一个照相机图标。灰色的代表数据用于以前实验记录分析，黄色的代表数据用于本次实验的实时分析。

把光标放在曲线图的任意处右击鼠标，会出现两个新的选项：

Copy Graph：用户可以复制曲线并把它粘贴到其他PCR热循环文件中； Print Graphy：用户可以将曲线图打印出来。

5.1.4 ：PCR热循环文件表格和高级选项

Edit Protocol窗口下部的表格显示了PCR热循环文件的具体内容和各项设置（见图5.1）。其表头分别代表以下意义：

Cycle：代表循环在PCR热循环文件中执行先后次序的序号。一个PCR热循环文件最多有9个循环；

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Repeats：代表一个循环的循环次数。一个循环最多循环600次。如果一个循环里的步骤不只一个，那其循环次数只显示在表格中该循环的第一行；

Step：代表一个循环中步骤的序号。一个循环最多有9个步骤；

Dwell time：代表一个步骤的保持时间。其调节范围是1秒（00:01）到99分钟59秒（99:59）；

Setpoint：代表一个步骤的保持温度。其调节范围是4.0oC到100.0oC。 以上的内容是每个PCR热循环文件都会出现的。还有些内容必须在Protocol Option文件框中选择对应选项才会出现。其具体内容见以下表格。

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Protocol Option 选项 PCR热循环文件表格抬头

选项功能及说明

Infinite Hold

Melt Curve

Increment Temperature

Hold

Check Box

+Temp

-Temp

+Temp

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选择该选项，用户可以启动永 久保温功能。

一旦在Protocol Option中选择了 “Infinite Hold”，表格会多出抬 头为“Hold”的一列。 在表格中某个步骤的该选项中 打钩，就代表该步骤为永久保 温模式。

选择该选项，用户可以得到样 品的熔点曲线。

一旦在Protocol Option中选择 “Melt Curve”选项，表格会多 出三列。抬头为“Check Box” 的那一列来选择哪个步骤进行 熔点曲线数据收集。

抬头为“+Temp”的一列为开启自 动增加保持温度功能（一般熔 点曲线要使用这个功能）。 抬头为“-Temp”的一列为开启自 动降低保持温度功能（一般熔 点曲线要使用这个功能）。 选择该选项，用户可以启动自 动增加保持温度功能。该功能 能使某个步骤的保持温度随着 循环次数的增加而增加。 一旦在Protocol Option中选择了 “Increment Temperature”选项， 表格会多出三列。其中表头为 “+Temp”的一列代表每次增 加多少温度；“Begin Repeat” 的那一列说明自动升温开始的 循环次数；“How Often”代表 每循环几次升一次温。比如从 某个循环的第2次循环开始，其 第2个步骤每循环3次增加1o

C，那么在该步骤的“+Temp”中输 入1，在“Begin Repeat”中输入 2，在“How Often”中输入3。

Protocol Option 选项 PCR热循环文件表格抬头

选项功能及说明

Decrement Temperature

Increment Time

-Temp

+Time

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选择该选项，用户可以启动自 动降低保持温度功能。该功能 能使某个步骤的保持温度随着 循环次数的增加而降低。 一旦在Protocol Option中选择了 “Decrement Temperature”选项， 表格会多出三列。其中表头为 “-Temp”的一列代表每次降低 多少的温度；“Begin Repeat” 的那一列说明自动降温开始的 循环次数；“How often”代表 每循环几次降一次温。比如从 某个循环的第2次循环开始，其 第2个步骤每循环3次降低1oC，那么在该步骤的“-Temp”中输 入1，在“Begin Repeat”中输入 2，在“How Often”中输入3。 选择该选项，用户可以启动自 动增加保持时间功能。该功能 能使某个步骤的保持时间随着 循环次数的增加而增加。 一旦在Protocol Option中选择了 “Increment Time”选项，那么该 表格会多出三列。其中表头为 “+Time”的一列代表每次增加多 少时间；“Begin Repeat” 的那 一列说明自动加时开始的循环 次数；“How often”代表每循环 几次加一次时。比如从某个循 环的第2次循环开始，其第2 个步骤每循环3次增加5秒， 那么在该步骤的“+Time”中输 入00:05，在“Begin Repeat”中输 入2，在“How Often”中输入3。

Protocol Option 选项 PCR热循环文件表格抬头

选项功能及说明

Decrement Time

Ramping

-Time

Ramp Rate

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选择该选项，用户可以启动自 动减少保持时间功能。该功能 能使某个步骤的保持时间随着 循环次数的增加而减少。 一旦在Protocol Option中选择了 “Decrement Time”选项，那么该 表格会多出三列。其中表头为 “-Time”的一列代表每次减少多 少时间；“Begin Repeat” 的那 一列说明自动减时开始的循环 次数；“How often”代表每循环 几次减一次时。比如从某个循 环的第2次循环开始，其第2 个步骤每循环3次减少5秒， 那么在该步骤的“-Time”中输 入00:05，在“Begin Repeat”中输 入2，在“How Often”中输入3。

该选项可以让用户设置相邻两 个步骤之间的加热/冷却速度。 用户可以选择是指定加热/冷却 速度还加热/冷却时间。一旦用 户选择该选项，表格中会多出 表头为“Ramp Rate”的一列。 表格上方也多出一个选项框，其 中“Ramp Rate in deg/sec”的选 项代表指定加热/冷却速度，系 统默认为最大（MAX）。其中 加热最大速度是3.3oC/秒，冷却 最大速度2.0oC/秒。两者的最小 速度都是0.1oC/秒。用户可以在 这之间调整。“Ramp Time in sec”的选项代表指定加热/冷却时间， 用户可以在1秒（00:01）到99 分钟59秒（99:59）之间调整。

Protocol Option 选项 Cycle Name

PCR热循环文件表格抬头 Cycle Description

选项功能及说明

选择该选项，表格中会多出表 头为“Cycle Description”的一 列，用户可以在该列中对各循 环做出文字说明。

选择该选项，表格中会多出表 头为“Process”的一列，用户 可以在该列中对各步骤做出文 字说明。

Step Process

Process

注意：如果PCR热循环文件的设置中有逻辑错误，表格中至少会有一个地方显示黄色。比如某个循环共循环30次，其中某个步骤的保持时间为30秒，同时选择了“Decrement Time”选项，每过一个循环减去10秒，这样循环3次以后其保持时间就减少到0了。此时“-Time”就会显示黄色。系统允许带有逻辑错误的PCR热循环文件保存，但不允许运行这个文件。

5.1.5 ：PCR热循环文件执行过程中对文件的调整

用户可以通过PCR热循环表格上方的“Insert”键和“Delete”键插入、删除循环或步骤。插入的循环只能有1—3个步骤。

插入一个循环：

a 右击表格上方“Cycle”字样下的“Insert”键，会出现一个对话框让您选择插入的是一步、两步、三步循环（1-step，2-step，3-step，其中一步循环是默认设置）。

b 选择好需要插入循环的步骤数，完成后对话框消失。

c 在表格中点击插入循环的后一个循环的任何单元格，插入完成。 删除一个循环：

a 点击表格上方“Cycle”字样下的“Delete”键。

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b在表格中点击需被删除循环的任何单元格，删除完成。 插入一个步骤：

a 点击表格上方“Step”字样下的“Insert”键。

b在表格中点击插入步骤的后一个步骤的任何单元格，插入完成。 c 注意，如果您在点击“Insert”键前先右击该键，会出现一个对话框让用户选择该插入步骤是插入到表格中某个步骤前（Before）还是后（After）。系统默认的设置是前。

删除一个步骤：

a 点击表格上方“Step”字样下的“Delete”键。

b在表格中点击需被删除步骤的的任何单元格，删除完成。

如果您不小心误删或误插了某个循环或某个步骤，那么您可以用同样的办法再插入或删除来弥补。

5.1.6 ：Optical Data Collection

用户可以在Edit Protocol窗口右方的Optical Data Collection文件框中确定PCR热循环文件中哪个（些）步骤收集荧光信号。

在某步骤前的小方块中点击一下，会出现一个灰色的照相机图标，代表该步骤收集的数据用于以前数据记录的分析；

在某步骤前的小方块中点击两下，会出现一个黄色的照相机图标，代表该步骤收集的数据用于本次实验的实时分析；

如果在某步骤前的小方块中点击两下后再点击一下，照相机图标会消失，同时也取消了在该步骤的信号收集任务。

如果用户在Protocol Option文件框中选择了“Melt Curve”选项，照相机图标会变成绿色；

在Optical Data Collection文件框内确定了收集荧光信号的步骤后，在曲线图的相应位置也会出现同样的照相机图标。

用户可以设定在一个PCR热循环文件中的某个循环的任何一个或几个步骤收集荧光信号，但只能在一个循环中进行。

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5.1.7 ：保存PCR热循环文件

当用户结束对PCR热循环文件的修改后，要对其进行保存。

在原有文件上进行修改后，点击“Save”键，原有文件将被修改后的文件覆盖。

如果是新建文件或是要把原有文件改名后保存，先双击“Protocol Filename”文件框，输入新文件名，然后点击“Save”键。此时会出现一个对话框，如果确认要保存，点击该对话框中的“Save”键，如果要取消，点击 “Cancel”键即可。

5.2 Edit Plate Setup

反应板设置文件向系统提供了PCR反应板上的样品及荧光染料的各种信息。

在Protocol Workshop模块的Edit Plate Setup窗口中既可以新建一个反应板设置文件，又可以对原有的反应板设置文件进行修改。在本节中，5.2.1介绍如何新建一个反应板设置文件，5.2.2介绍如何修改一个反应板设置文件。其设置包括样品的排列、使用荧光染料的种类、样品类型等等，分为样品设置（Sample）和荧光设置（Fluorophores）两个界面。5.2.3和5.2.4具体介绍这两个界面的情况。5.2.5具体介绍滤光镜设置，5.2.6介绍如何保存反应板设置文件。

在Edit Plate Setup窗口中，反应板96孔模拟布局图占了绝大部分的面积。其上方的各主要文件框和功能键分别是：

Plate Setup：显示反应板设置文件的文件名； Owner’s Id：显示反应板设置文件创建者的登录名； Save：保存当前反应板设置文件；

Run：以当前反应板设置文件进行一次实验（PCR热循环文件已在Edit Protocol窗口中选定）；

Sample：将96孔模拟布局图切换到样品设置，详见5.2.3； Fluorophores：将96孔模拟布局图切换到荧光设置，详见5.2.4。

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5.2.1 ：新建反应板设置文件操作速成

1．在Protocol Library模块中，选择View Plate Setup窗口；

2．点击Custom键，系统会自动切换到Protocol Workshop模块的Edit Plate

Setup窗口；

3．在96孔模拟布局图中设置各孔的样品类型。先在界面上部的“Select a

sample and then click wells for loading”文件框选择相应图标，然后再点击布局图上的目标孔即可（见图5.4）。

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如果某个孔中的样品类型为标准品，必须在Define Standards文件框中设置其对应的模板量。如果您使用梯度稀释（Dilution Series）的标准品，您只要输入第一个标准品的模板量，系统会自动计算出随后所有标准品的模板量；

点击96孔模拟布局图的左上角，可一次选中全部96孔；

点击96孔模拟布局图某一列上面的数字，可选中这一列所有的孔； 点击96孔模拟布局图某一行左面的字母，可选中这一行所有的孔； 按住鼠标左键拖曳，可以将某一个孔的样品类型复制到其他孔； 如果您对某个孔的样品类型设置发生了错误，您可以先点击布局图的上方的样品类型图标选择框中最右面的Erase图标，然后点击错误设置的孔即可；

如果您要对某未知样品或标准品重新编号，那就在“NEXT REPLICATE NUMBER is”文件框中输入对应编号即可。

4．点击Fluorophores界面切换键，您会看到反应板中的荧光染料的设置（见

图5.5）；

5．选择一个滤光镜设置文件；

6．在“Select or Deselect a Fluorophores”文件框中选择一种荧光染料； 7．在“Click a color for”文件框中为选定的荧光染料指定一种颜色的蜡笔图

标；

8．重复步骤6和步骤7，为其他荧光染料指定其对应不同颜色的蜡笔图标； 9．点击代表一种荧光染料的蜡笔图标，然后点击96孔模拟布局图中的各孔，

选中的孔代表实验中将要实时检测这种荧光信号； 点击96孔模拟布局图的左上角，可一次选中全部96孔；

点击96孔模拟布局图某一列上面的数字，可选中这一列所有的孔； 点击96孔模拟布局图某一行左面的字母，可选中这一行所有的孔； 如果您对某个孔的样品类型设置发生了错误，您可以先点击布局图的上方的样品类型图标选择框中最右面的Erase图标，然后点击错误设置的孔即可； 10．

重复步骤9，设置其他荧光信号检测的信息；

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11． 12．

双击“Plate Setup”文件框，输入该反应板设置文件的文件名； 点击“Save”保存。

5.2.2 修改反应板设置文件操作速成

1．在Protocol Library模块中，选择View Plate Setup窗口；

2．该窗口左上的文件框中选择目标反应板设置文件文件所在的驱动器； 3．下面的文件框中选择目标反应板设置文件的保存路径； 4．在Protocol Files文件框中选择目标反应板设置文件的文件名；

5．点击“Edit”键，系统会自动切换到Protocol Workshop模块的Edit Plate

Setup窗口；

6．在当前的 “Samples”界面中可以对各孔的样品类型和排列进行修改。

点击界面上部的“Select a sample and then click wells for loading”文件框中选择样品类型图标，再点击96孔模拟布局图中相应的孔；

如果某个孔中的样品类型为标准品，必须在Define Standards文件框中设置其对应的模板量。如果您使用梯度稀释（Dilution Series）的标准品，您只要输入第一个标准品的模板量，系统会自动计算出随后所有标准品的模板量；

点击96孔模拟布局图的左上角，可一次选中全部96孔；

点击96孔模拟布局图某一列上面的数字，可选中这一列所有的孔； 点击96孔模拟布局图某一行左面的字母，可选中这一行所有的孔； 按住鼠标左键拖曳，可以将某一个孔的样品类型复制到其他孔； 如果您对某个孔的样品类型设置发生了错误，您可以先点击布局图的上方的样品类型图标选择框中最右面的Erase图标，然后点击设置错误的孔即可；

如果您要对某未知样品或标准品重新编号，那先选择对应样品类型图标，再在“NEXT REPLICATE NUMBER is”文件框中输入对应编号，然后点击该孔即可。

7．击Fluorophores界面切换键，您可以进行反应板中的荧光染料的设置（见

图5.5）；

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8．选择一个滤光镜设置文件；

9．“Select or Deselect a Fluorophores”文件框中选择一种荧光染料； 10．

在“Click a color for”文件框中为选定的荧光染料指定一种颜色的蜡

笔图标； 11．

重复步骤9和步骤10，为其他荧光染料指定其对应不同颜色的蜡笔

图标； 12．

点击代表一种荧光染料的蜡笔图标，然后点击96孔模拟布局图中的

各孔，选中的孔代表实验中将要实时检测这种荧光信号； 点击96孔模拟布局图的左上角，可一次选中全部96孔；

点击96孔模拟布局图某一列上面的数字，可选中这一列所有的孔； 点击96孔模拟布局图某一行左面的字母，可选中这一行所有的孔； 如果您对某个孔的样品类型设置发生了错误，您可以先点击布局图的上方的样品类型图标选择框中最右面的Erase图标，然后点击错误设置的孔即可； 13． 14．

重复步骤12，设置其他荧光信号检测的信息；

如果您想对当前反应板设置文件重新命名，双击“Plate Setup”文件

框，输入该反应板设置文件的新文件名； 15．

5.2.3 ：Edit Plate Setup/Samples

在Edit Plate Setup窗口的Samples界面中，用户可以设置PCR反应板上各反应管中的样品类型以及相关信息。

5.2.3.1 图标说明

在窗口上部的“Select a sample and then click wells for loading”文件框中可以选择各种样品类型对应的图标（见图5.4）。

点击“Save”保存。

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图标名称

Cursor Standard

功能说明

该图标用来指定96孔模拟布局图上的目标反应管的位置；

该图标代表标准品。标准品指的是已知靶DNA量的样品。在窗口右侧的“Define Standard”窗口可以对标准品进行设置，详见5.2.3.3；

该图标代表未知样品。一旦96孔模拟布局图上某孔被选择为未知样品后，系统会 给出一个序号。如果几个孔都是同一个未知样品的话，可以用一个序号表示，详 见5.2.3.4；

该图标代表空白，就是反应管中不加任何试剂； 该图标代表阳性对照，就是肯定含有靶DNA的样品； 该图标代表阴性对照，就是肯定没有靶DNA的样品； 该图标代表纯染料校准样品； 该图标为某特定样品的指示符；

该图标用来消除96孔模拟布局图上某孔的样品类型设置。

Unknown

Blank +Control -Control Pure Dye Custom Erase

5.2.3.2 图标的使用

先点击窗口上部的“Select a sample and then click wells for loading”文件框中样品类型的图标使其被激活，然后点击96孔模拟布局图中相应位置的孔，该孔在布局图中的显示就会变成与上面选定图标相同的形状。如果您想一次选中多孔的话，可以采用以下办法：

点击96孔模拟布局图某一列上面的数字，可选中这一列所有的孔； 点击96孔模拟布局图某一行左面的字母，可选中这一行所有的孔； 将光标放在96孔模拟布局图某一孔上，按住鼠标左键进行拖曳，然后松开。拖曳范围中的孔将被全部选中。

上述三种方法很适宜于一块板上重复标本的选择。

5.2.3.3 定义标准品（Defining Standards）

1．在窗口上部的“Select a sample and then click wells for loading”文件框中选择 “Cursor”图标，然后在窗口右侧的“Define Standards”文件框中选择“Dilution Series”（梯度稀释系列）。

在“UNITS”中选择标准品中靶DNA计量单位，系统默认为拷贝数（copy number）；

在“Dilution Factor”文件框中输入一个数值，该数值代表两个相邻稀释度的标准品之间靶DNA量相差的倍数。系统默认值为10（即该系列标准品是10

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倍10倍地稀释）；

在“Starting Concentration”文件框中输入系列中第一个标准品的靶DNA量。系统默认的是采用科学记数的表示方法。比如起始模板数是1.00×107的拷贝，就输入1.000e+07；

选择该系列标准品是升序排列（INCREASING）还是降序排列（DECRESING）；

在“Replicate Range”中确定该系列标准品的个数，比如有3个标准品，就输入1 TO 3；

点击“Calculate”键。

2．在窗口上部的“Select a sample and then click wells for loading”文件框中选择“Standard”图标，再点击96孔模拟布局图上的相应的孔设置1号标准品的位置，然后依次指定其他序号的标准品的位置；

3．如果您在指定某标准品在96孔模拟布局图上的序号中发生了错误，您可以使用“Renumber Standard”选项和“NEXT REPLICATE NUMBER is”文件框对其进行修改；

4．在窗口上部的“Select a sample and then click wells for loading”文件框中选择 “Cursor”图标，然后点击96孔模拟布局图上指定为标准品的各孔。每点击一个孔，窗口右侧的“Quantity”文件框就会显示其对应的靶DNA量，用户此时可以确认标准品的设置是否正确；

5．如果用户要修改标准品的靶DNA量，按照步骤1操作； 6．确认无误后，点击“Save”键保存；

7．点击窗口最上方的“Quantities/Identifiers”窗口切换键切换到“Quantities/Identifiers”窗口，这里可以浏览反应板设置文件的主要设置信息。 说明：系统会根据用户在“Define Standards”文件框中的设置自动计算各标准品的模板量。比如Dilution Factor值为10，Replicate Range为1 TO 3，标准品降序排列，1号标准品的模板量为1.00e+10，即1010拷贝，那在点击“Caculate”键后，2号标准品的模板量就是109拷贝，3号标准品的模板量就是108拷贝。如果用户在96孔模拟布局图上仅定义了1号和3号标准品而没有2号标准品，3号标准品的模板量仍然是108拷贝。

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5.2.3.4 更改标准品或未知样品序号

在96孔模拟布局图中设置的标准品孔或是未知样品孔都会有一个系统自动赋予的序号，而且这些序号间是连续的。用户可以对这些序号进行更改，操作步骤如下：

1．窗口上部的“Select a sample and then click wells for loading”文件框中选择“Standard”或“Unknown”图标；

2．选择“Renumber Standard”选项，在“NEXT REPLACATE NUMBER is”文件框中输入更新的序号数值；

3．点击96孔模拟布局图上的目标孔。如果是使用拖曳等方法选中复数的孔，这些孔将被认为是一个单位而更新为同一序号。

5.2.4 ：Edit Plate Setup/Fluorophores

在Edit Plate Setup窗口的Fluorophores界面中，用户可以进行PCR反应板上各孔使用的荧光染料相关的设置。您可以在Protocol Library模块的View Plate Setup中点击“Custom”或“Edit”切换到Protocol Workshop模块的Edit Plate Setup窗口，然后点击“Fluorophores”界面切换键切换到Fluorophores界面。如果初期点击“Custom” 键的话，该界面的操作必须从选择滤光镜设置开始（下述步骤1）；如果初期点击“Edit”键话，因为界面上已经存在一个完整的设置，所以既可以从选择滤光镜设置开始操作（下述步骤1），也可以直接修改布局图中的各孔设置开始操作（下述步骤5）。

操作程序：

1．在“Pick a Filter Wheel Setup”下拉框中选择一个滤光镜设置程序； 2．在“Select or Deselect a Fluorophores”中选择一种荧光染料。单击某荧光

染料名称即可选中该染料（前面的小方框内打钩），再次点击该荧光染料名称即可取消；

3．在“Click a color for”文件框中为该荧光染料选择一种颜色的蜡笔图标，

以后在96孔模拟布局图中该荧光染料就以这种颜色表示；

4．重复步骤2和步骤3，选择其他将要使用的荧光染料，并为它们指定相

应颜色的蜡笔图标；

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5．点击代表某种荧光染料的蜡笔图标，再点击96孔模拟布局图中的孔，即

代表该孔使用这种荧光染料。如果您选择完荧光染料的蜡笔图标后点击96孔模拟布局图的左上角，代表全部96孔全部用这种荧光染料。同样点击一列上面的数字就代表选中这列全部8个孔，点击一排左面的字母就代表选中这排全部12个孔；

6．重复步骤5，设置好其他荧光染料在模拟图上的位置；

7．如果您对某孔的荧光设置错误，点击“Click a color for”文件框中的

“Erase”蜡笔图标，然后点击设置错误的孔就即可取消其荧光设置。然后重复步骤5重新设置；

8．如果您想对该反应板设置文件重新命名，双击“Plate Setup”文件框，输

入新文件名；

9．如果要保存设置，点击“Save”键，会出现一个对话框，再次点击“Save”

键即可。

5.2.4 ：滤光镜设置文件

系统通过滤光镜设置文件得到滤光镜选择转轮上各波长的激发光透镜（excitation filter）和发射光透镜的具体位置，使系统能正确使用各滤光镜组。该版本软件中自带的滤光镜设置文件是FilterSet4和FilterSet5，具体内容见下表（其他版本软件的滤光镜设置文件在本版本中必须先升级才能使用，详见2.5.3）。 FilterSet4

位置 激发光透镜 发射光透镜 对应荧光染料

Position Excitation Emission Recommended Fluorophores 2 490/20X 530/30M 荧光素 (FAM),SYBR Green 3 530/30X 575/20M HEX, TET, VIC, JOE, Cy3 4 545/30X 585/20M TAMRA/Cy3 5 575/30X 620/30M Texas Red, ROX 6 635/30X 680/30M Cy5, LC640

FilterSet5

位置 激发光透镜 发射光透镜 对应荧光染料

Position Excitation Emission Recommended Fluorophores 2 490/20X 530/30M 荧光素 (FAM),SYBR Green 3 530/30X 575/20M HEX, TET, VIC, JOE, Cy3

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4 530/30X 620/30M 溴乙非啶（Ethidium Bromide） 5 610/30X 660/20M LC640

6 660/30X 710/20M Cy5.5, LC705

说明：490/20X代表该滤光镜允许波长为480-500nm的光可以透过。490代表可透过光波长范围的中点（可透光最大波长与可透光最小波长和的1/2），20代表可透过光的波长跨度范围（最大波长减最小波长），X代表激发光透镜（M代表发射光透镜）。

多重PCR（Multiplex PCR）的荧光染料选择：

用iCycler进行多重PCR反应的荧光检测成功与否的一个关键因素就是荧光染料的选择。同一个反应管中的不同荧光之间光谱越不连续，实验结果就越好。 多重PCR荧光染料选择操作指南：

1．每一种的荧光信号都对应一对滤光镜组。如果一个反应管中有4种荧光

信号，那检测时就会同时使用4对不同的滤光镜组；

2．在Edit Plate Setup窗口的Fluorophores界面选择实验中要使用到的荧光

染料。在该界面中，每种类荧光染料名称的后面都带着一个数字，这代表着检测该荧光信号使用的激发光透镜的波长。比如，FAM-490就代表检测荧光素（FAM）用的滤光镜组是490/530；Texas Red-575就代表检测该荧光信号用的滤光镜组是575/620。系统通过这些数字得知检测这些信号用哪对滤光镜组；

3．注意：不能在一个反应管里选择两种或两种以上染料名称后所带数字一

样的荧光染料。因为这代表检测这几种荧光信号使用的是同一滤光镜组，而检测时必须做到一种荧光信号对应特定的一对滤光镜组；

4．在该界面中您会发现有一些荧光染料，前面的名称相同，后面的数字不

同。比如TET-490和TET-530。这代表这些滤光镜组都可以用来检测该荧光信号。但在RME文件里其校准值都是一一对应的，比如TET-490的校准值就不能通用于TET-530；

5．如果两种荧光光谱重叠，造成iCycler很难将其分辨出来的话，那么这个

多重PCR的检测肯定失败。比如一个反应管里同时有两种荧光信号A和B，其中A既可以用A对应的滤光镜组检测，也可以用B对应滤光镜

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