特征性微生物检测培养基及方法

（一）材料与试剂 1．原始菌种采集：

用特制不锈钢内衬有机硅薄膜的箱式釆样器采集小清河五柳闸片区的底泥，根据不同的应用采取不同的保存方法。 2．培养基【4】:

（1）牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌、芽孢杆菌用）：

成分：牛肉膏3g，蛋白胨10g ，NaCl 5g ，琼脂15g ， 蒸馏水1000ml，

pH 7.2

制法：称取蛋白胨和NaCl，加入水中，用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一烧杯

中称量，加热融化然后加入上述烧杯中。加入所需琼脂加热融化，定容，最后调节至所需pH。121摄氏度灭菌20分钟。

（2）脑心浸液培养基（1000ml）（北京路桥技术有限责任公司，用于链球菌、

肺炎球菌、脑膜炎球菌及其它对营养苛求菌的培养）

成分：脑心浸液培养基37g （蛋白胨10g， 牛脑浸粉 12.5g， 葡萄糖2g，

牛心浸粉5g，氯化钠 5g， 磷酸氢二钠 2.5g） 琼脂粉20g 最后定容到1000ml, 121℃灭菌20分钟。

（3）硝化细菌培养基（培养硝化细菌）

成分：亚硝酸钠1g 磷酸氢二钾0.75g 磷酸二氢钠0.25g 碳酸钠

1g 硫酸镁0.03g 硫酸锰0.01g 加蒸馏水1000ml,121℃灭菌20分钟。

（4）反硝化细菌培养基（培养反硝化细菌）

成分：柠檬酸钠5g 磷酸氢二钾1g 七水硫酸镁0.2g 磷酸氢二

钾1g 硝酸钾2g

加去离子水1000ml，调pH7.2-7.5, 121℃灭菌20分钟。

（5）亚硝化细菌培养基（培养亚硝化细菌）

成分：硫酸铵2g 磷酸二氢钠0.25g 磷酸氢二钾0.75g 四水硫酸锰

0.01七水硫酸镁0.03g 碳酸钙5g

加蒸馏水1000ml，调pH7.2，121℃灭菌20分钟

（6）乳糖胆盐培养基

成分：蛋白胨20g 猪胆盐5g 乳糖10g

方法：将蛋白胨、猪胆盐溶于1000ml水中，调pH7.4,加入25ml溴甲酚

蓝指示剂我（0.4g/L），分装每管10ml，121℃灭菌20分钟。

(7) EMB培养基

蛋白胨 10g，K2HPO4 2g， 琼脂 17g，PH 7.1，去离子水1000ml，临时用时加入10g乳糖，20ml伊红，10ml美兰 （8）LB培养基（液体）

Tryptone（胰蛋白胨） 10g，Yeast Extract（酵母提取物） 5g，NaCl（氯化钠） 10g (9) LB双量培养基

成分：酵母粉10g 蛋白胨20g 氯化钠20g

用去离子水定容到1000ml，用NaOH调节pH到7.4，然后分装到锥

形瓶中，每250ml,121℃灭菌20分钟。

（10）40%甘油的配置（250ml） 甘油 100ml 蒸馏水 150ml

将以上成分混匀，121℃灭菌20分钟。 （11）20%甘油的配置

将等体积的LB双量培养基与40%的甘油分别灭菌，然后将两者混匀，

吸1ml进入离心管待用。

3．试剂： （1）奈氏试剂

甲液：碘化钾 10g，去离子水100ml， 碘化汞 20g 乙液：KOH 20g，去离子水100ml

分别配制甲、乙二液，待冷却后混合，保存于棕色瓶中。 （1） 格里斯试剂Ⅰ及Ⅱ：

格里斯试剂Ⅰ：称取磺胺酸 0.5g，溶于150ml 30%的醋酸溶液中，保存于

棕色瓶中。

格里斯试剂Ⅱ：称取α-萘胺 0.5g，加入50ml去离子水中，煮沸后缓缓加

入30%的醋酸溶液150ml，保存于棕色是瓶中。

（2） 二苯胺试剂：

称取无色二苯胺0.5g，溶于20ml去离子水中，溶解后与100ml浓硫酸混合，保存于棕色瓶中。

2、样品中特征性微生物菌群的分析 1.1大肠群菌的检测（MPN法） 1.1.1 乳糖发酵试验

大肠菌群MPN参考国家标准(GB4789．3-84)，采用三管系列、将不同倍数的检样稀释液0.1ml接种到乳糖胆盐发酵管内，接种6个滴度、每个滴度三管。置36+1℃温箱内，培养24+2小时，观察实验结果。若均不产气者则可报告为阴性；如果试管中溶液的颜色由红色变为了黄色，并且在杜氏小管中有气体产生，则需进行EMB培养基分离培养和证实试验。 1.1.2分离培养

将产气的发酵管分别转种到伊红美兰琼脂平板上，置36±1℃温箱内培养18—24小 时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 1.1.3证实试验

在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1—2个进行革兰氏染色。同时接种乳糖发酵 管，置36±1℃温箱内培养24+2小时，观察产气情况，凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 1.1.4报告

根据证实为大肠群阳性的管数，查MPN的检索表，报告每g底泥大肠菌群的含量(MPN)。

1.2硝化细菌【5】数量的检测-稀释法

将培养硝化细菌的培养基分装于试管（1.8cm×18cm）中，每管4.5ml，每

个样品需培养基19支试管。淤泥悬液可采取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7六个稀释度。在每管培养基中，用无菌吸管接种淤泥悬液0.5ml。另取一管培养基接种无菌水作为对照，于25~28℃培养。

10~14d后，其方法是在白瓷比色板上先用格里斯试剂（Griess Reagent）测试培养基中亚硝酸消失情况，若不呈红色，则表示硝酸盐已完全消失。此时，另取5滴培养液于白瓷比色板上，加二苯胺试剂2滴，若呈蓝色，则表示亚硝酸已被氧化成硝酸，说明有硝化细菌存在 。根据呈现蓝色溶液的试管稀释度及其数量,查ＭＰＮ表,确定硝化细菌的数量。 1.3亚硝化细菌【5-6】数量的检测-稀释法

基本与上述测定硝化细菌数量的方法相同。采用10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7六个连续稀释度。每个淤泥样品用19支试管，加入4.5ml的亚硝化细菌培养基。于25~28℃培养10~14d后，取出5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂第一、第二液各两滴，如有亚硝酸存在，则呈红色。从《三次重复数量指标》表中求得数量指标后，换算成每克干土中的亚硝化细菌数量。 1.4反硝化细菌【7】数量的检测-稀释法

利用在培养液中滴加格里斯试剂、二苯胺试剂和奈氏试剂，通过显色反应指示亚硝态氨、硝态氨和氨态氨的变化，从而筛选出对硝态氨有较强利用效果的菌株。在培养液中加入1~2滴格里斯试剂，以检测是否有亚硝酸盐的存在,如果溶液立即呈粉红色或棕色等，则硝酸盐被还原成亚硝酸盐，说明溶液中具有反硝化作用的细菌；如果无红色存在，再加入二苯胺试剂，若培养液呈蓝色，则表示该溶液中硝酸盐未被转化，溶液中无反硝化细菌；若无色，则表示硝酸盐和刚生成的亚硝酸盐都已还原成氮氧化合物，说明该溶液中具有较强反硝化功能的细菌。

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