酶

第六章 主要工业酶制剂的生产

第一节 淀粉制糖相关酶制剂的生产

一 α-淀粉酶的生产

α-淀粉酶作用于淀粉时，可以随机的方式从分子内部切开。α-1，4葡萄糖苷键而生成糊精和还原糖。其水解位于中间的。α-l,4键的概率比水解位于分子末端的概率大；不能水解支链淀粉的。α- 1,6键，也不能水解紧靠1，6分支点的α-1，4键；不能水解麦芽糖，但可以水解含有3个或3个以上α- l，4糖苷键的低聚糖。由于水解产物的还原性末端葡萄糖残基C1碳原子为α构型．故称α-淀粉酶。至今已有不少微生物的“α-淀粉酶被高度纯化。

工业上大规模生产和应用的α-淀粉酶主要来自细菌和曲霉。芽孢杆菌所产α-淀粉酶分为液化型与糖化型两种。目前只有液化型酶有用，由于活性高，发酵周期短，酶的耐热性高，尤其是枯草杆菌为大多数工厂所采用。我国淀粉糖工业使用的液化酶BF-7658。地衣芽抱杆菌的酶耐热性比枯草杆菌为高，但产量较低。芽孢杆菌易于退化和遭受噬菌体感染而降低产酶能力。由微生物制备酶制剂，产酶量高，易于分离和精制，适于大量生产。当然亦能从植 物和动物中提取α-淀粉酶，满足特殊的需要，但由于成本高，产量低，目前还不能实现工业化生产。具有实用价值的α-淀粉酶生产菌列于表5—6。

由于不断的选育改良，现在工业生产上用的菌种产生。α-淀粉酶的能力已是原始菌株的数倍乃至数十倍，例如淀粉液化芽抱杆菌ATCC23844的α-淀粉酶活性，每1mL已达456000u；地衣芽饱杆菌ATCC9789，用γ射线、NTG、紫外线单独或交叉处理7次后，其耐热性α—淀粉酶活性增加25倍、结合培养条件的改进而用于工业生产。我国生产菌株枯草杆菌门F7658—209，是由野生型菌株，经物理和化学方法交叉处理得到的变异株，其产酶活性比母株高5.0％。此外，用x射线也曾得到高产突变株。

连续使用同一诱变剂时，出于发生平顶效应，诱变效果会随着处理次数而降低。此时必须更换诱变手段。在使用紫外线、Y射线、快中子等为诱变剂处理米曲雷时，高剂量不一定有不利于高产变株的生成。近年来，利用转化法改良菌株，在枯草杆菌α—淀粉酶的生产菌

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上已取得可喜进展，例如将α—淀粉酶活性高而耐热性差的枯草杆菌纳豆株的DNA转入耐热性强而酶活低的枯草杆菌株Marburg中，结果引起了后者遗传性状的改变，其α—淀粉酶提高了14倍，蛋白酶活性提高了5倍，这个杂交种所产酶也具行亲株性能.但由于酶活性还不及生产菌株而尚未实用。又将生产菌的DNA转入枯草杆菌Marburg株，得到酶活性较高的转化株SP-38，又将SP38DNA转入Marburg使酶活性有了进一步提高.

不同生态环境下分离的微生物，它的α—淀粉酶性质与其生长环境相适应，从温泉分离的一株耐热解淀粉假单胞杆菌，它的α-淀粉酶最适作用温度65~80℃。在55℃培养的嗜热脂肪芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌，所产的α-淀粉酶在90℃下几乎不失活。分别在35℃与55℃下培养凝结芽孢杆菌，所产α-淀粉酶的热稳定性不同。在90℃处理1h，35℃培养的失活92％，而55℃培养失活仅6％。但是在55℃与43℃下培养嗜热脂肪芽孢杆菌，其α-淀粉酶的各种理化性质几乎无明显区别。此外，地衣芽孢杆菌虽在30℃培养，它的α-淀粉酶最适温度80~85℃，耐热性很强.

1 枯草杆菌BF—7658α—淀粉酶的制造

枯草杆菌BF7658是我国产量最大、用途最广的一种液化型α—淀粉酶，其最适pH6．5左右，pH低于6，高于10，酶活显著降低，最适温度65℃左右，60℃以下稳定。在淀粉浆中酶的最适温度80一85℃，90℃保温15min保留酶活87％。

(2)生产菌种选育 原种在1965年投产以后,1975年又与中国科学院遗传研究所、无锡轻工业学院等协作采用物理化学方法反复处理后，得到一株新菌株11—12,其产酶提高50％，该菌株呈短杆状，革兰氏阳性，两端钝圆，单独或成链状，在肉汁表面可生成菌膜，在淀粉培养基上菌落呈乳白色，表面光滑湿润，略有光泽无皱纹，有粘稠状，用碘液试之菌落周围

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呈透明圈。

将上述菌株接种于马铃营琼脂或淀粉琼脂斜面，37℃培养27或28h后，臵于4℃冰箱保存，2个月移植1次。马铃营琼脂斜面形成的芽抱多于淀粉琼脂斜面，保存效果较好，两种斜回可交替使用。蜡封马铃薯斜面可保藏半年，若需长期保藏，宜采用沙土管(3~5年)或冷冻干燥保存。

(3)扩大培养 将试管斜面菌种接种到马铃薯三角瓶斜面(20％马铃薯煎出汁加MgSO4〃7H20 5mg/L，琼脂2%，pH6.7~7.0)，37℃培养3d(使之形成芽孢以提高种子的稳定性)，然后接入到500L种子罐，37℃搅拌300r／min，通风是(1.3—1.4vvm)培养12~14h：此时菌体生长进入对数生长期(镜检细胞密集，粗壮整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液pH6.3~6.8，酶活5~10u／mL)，乃转入l0000L发酵罐，在37℃，通风量0~12h0.67VVm，12h至发酵结束1.33~1.0vvm，搅拌200r／min,培养40~48h。中途用3倍浓度碳源的培养基补料，体积相当于基础料的l/3，从培养12h开始，每小时1次，分30余次添加完毕。停止补料后6~8h罐温不再上升，菌体衰老80％形成空泡，每2~3h取样分析1次，当酶活不再升高，就结束发酵，向发酵液中添加2％CaCl2、0．8％Na2HP04，50—55℃加热处理30 min,以破坏共存的蛋白酶，促使胶体凝聚而易于过滤，冷却到35℃进行提取。

采用中途补料，可避免原料中淀粉降解生成的糖过量堆积而引起分解代谢物阻遏，有利于酶的诱导，有利于pH的控制，延长产酶期，提高产量。在原料最终用量相同情况下，中途补料的酶产量比一次性投料高14％。当pH降到6.5以下，菌形粗壮时，补料量可酌减，当pH高于6.5，细胞出现衰老现象有空泡时，则补料量酌量增加.

(4)提取

①盐析法：发酵液经热处理，冷却到40℃，加入硅藻土为助滤剂过滤；滤饼加2.5倍水洗涤，洗液同发酵滤液合并后，在45℃真空浓缩数倍后，加(NH4)2SO440％盐析，盐析物加硅藻土后压滤，滤饼子40℃烘干后磨粉即为成品。按此工艺由酶液到粉状酶制剂的收率为70％。

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②乙醇淀粉吸附法：发酵液加0.7％Na2HPO4、1％CaCl2，50~55℃下维持30min,冷却到40℃压滤除渣。酶液在低温下经刮板薄膜蒸发器浓缩到含35％~40％固形物，加入与其干物等量的淀粉，然后在搅拌的同时缓缓加入2倍量的10~15℃的乙醇，使终浓度达60％左右，继续搅拌数分钟，静止数小时，待沉淀完全离心分离，沉淀物于50℃热风干燥后磨粉，酶的收率约60％.

③喷雾干燥法：BF7658淀粉酶也可用喷雾干燥法干燥，收率90％左右，但制品中含杂质较多，有臭味，妨碍应用，同时蒸汽消耗量大，也易吸湿。

3)耐高温α—淀粉酶的生产

普通的细菌α—淀粉酶在水解谷物淀粉时，由于液化温度只能在80~90℃，经常残留聚合度为30~40的不溶性淀粉，妨碍了过滤并影响下一步糖化的DE值。

为此，在液化时须添加相当量的钙离子以提高酶的耐热性，并采用三段法进行液化。因此工艺复杂，而且产品中含有大量无机盐。耐热性α—淀粉酶适合于高温(105~110℃)下液化淀粉，不仅反应快，淀粉不易形成难溶性颗粒，且杂质容易过滤去除，液化淀粉一步即可完成，钙离子用量少，有利于糖化液精制。

耐高温α—淀粉酶的生产工艺流程与枯草杆菌α—淀粉酶生产的流程相同。高温α—淀粉酶产品均是液体，国内外生产厂家有美国的Mils公司、荷兰的Gist公司、丹麦的NOVO公司和我国无锡酶制剂厂。

1)菌种 耐高温α—淀粉酶产生菌几乎都是地衣芽孢杆菌及其突变株，主要原因是该菌耐热性好和产酶活力高，因此适合于工业化生产。其他研究的菌株还有嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草杆菌、凝结芽孢杆茵、酸热芽孢杆菌和高温放线菌等。

丹麦NOVO公司Outtrup等将地衣芽孢杆菌ATCC9798为出发菌株，经物理化学处理多次，使产酶活力提高20~30倍.上海工业微生物研究所胡学智等亦以ATCC9798为出发菌株，相继用UV、Co60和DES等反复诱变选育，突变株A4041产酶酶活力提高了100~200倍，该菌株具有无芽抱、利福雷素抗性、甲硫氨酸缺陷型以及秸氨酸缺陷型的标记，并部分解除了葡萄糖分解代谢阻遏，可在含葡萄糖培养基中生产高温α-淀粉酶。日本九尾等人以地衣芽孢杆菌NYK24为出发菌株．采用NTG诱变，挑选环丝氨酸抗性突变菌株，产酶活力为2000u／mL.

(3)提取 因为该产品为液体，提取方法较简便.

A404l的发酵液于pH4.5时加入1％碱式氯化铝为助凝剂，絮凝剂为0.1％壳聚糖，缓慢搅拌，使菌体、培养基杂质絮凝，压滤后得清液，真空薄膜蒸发器或超滤浓缩10倍，加入食盐18％。以0.1％苯甲酸钠为稳定剂。酶收得率为70~75％，在室稳保存1年失活低于10％。作用温度90℃，最适pH为5.0~7.0。

Therm340的发酵液在15℃进行压滤，滤液在10℃以下超滤浓缩到50％，再在32℃真空蒸发浓缩到20％，然后在10℃以下精滤除菌，接着加入Na2S2O3、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯为防腐剂，以醋酸钙为稳定剂，制成液体酶产品。总收得率为72％。该液体酶最

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适pH5.5~7.0，最适温度90~95℃。应用时用量为颠覆量的0.04％~0.06％，作用温度在30~40％淀粉浆时为95~100℃，液化20min，其DE值为14％~20％。

2液体深层培养淀粉酶的影响因素

(1)碳源的诱导及阻遏 微生物生产的α—淀粉酶可以说是半组成酶，因为大多数工业生产的淀粉酶菌种，例如淀粉液化芽孢杆菌、枯草杆菌168、地衣形芽孢杆菌以及米曲霉等，即使培养基中不含淀粉或者不含具有α-1, 4键的多糖或低聚糖，仍然可以生成a-淀粉酶，但是它们的产量可受到淀粉或其他α-1，4麦芽寡糖的诱导而增加。

福本指出，在液体静止培养下各种碳源对淀粉液化芽孢杆菌的效果依次是：可溶性淀粉＞麦芽糖＞甘露醇＞阿拉伯糖＞葡萄糖＞蔗糖＞乳糖＞半乳糖＞木糖。对枯草杆菌BF-7658研究，得到类似结果。豆饼浸出液为氮源时，淀粉液化芽孢杆菌的最佳碳源依次是乳糖、半乳糖、淀粉、麦芽糖。用在葡萄糖与氨构成的合成培养基中，乳糖仍最适合于a—淀粉酶的生成，而葡萄糖只适合于细胞的呼吸，麦芽糖与淀粉则适合于菌体生长，糊精则完全无效，但琥珀酸、延胡索酸几乎与可溶性淀粉一样有效；葡萄糖、果糖、蔗糖等在高浓度时抑制a-淀粉酶的生成。

容易利用的碳源，例如葡萄糖、果糖、蔗糖等只能促进细胞的呼吸与生长，而不利于a—淀粉酶生产，代谢愈快的糖对α—淀粉酶生产的抑制越严重，但是一些作为能源利用性很差的糖类，像糖原、乳糖、半乳糖、棉子糖等却能促进“淀粉酶的合成。

麦芽糖与淀粉、糖原一样对米曲霉生产a-淀粉酶有促进作用。麦芽四糖对嗜热脂肪芽泡杆菌、地衣形芽孢杆菌，异麦芽糖对米曲霉，麦芽糖对嗜碱芽抱杆菌碱性a—淀粉酶生产的诱导作用最强。

碳源种类与α—淀粉酶及胞内核糖核酸的形成有着密切关系。当核糖与淀粉共存时，a—淀粉酶的产量比单独用淀粉时高1倍。

葡萄糖等易利用碳源，在浓度高时，妨碍α—淀粉酶的生成，这是一种分解代谢物阻遏。它在a—淀粉酶的生物合成上起着一种调节作用。Schaefferr(1969)认为枯草杆菌的a-淀粉酶生产受到分解代谢物阻遏的控制。Meb等(1972)报道地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的生产可受到葡萄糖或其他低相对分子质量可代谢糖的抑制.

为了提高α—淀粉酶的产量，避免分解代谢物的阻遏，除选育抗分解代谢的变异菌株外，就是采用代谢缓慢的碳源，例如乳糖、乳清.但大多数工厂使用淀粉为碳源，这不仅可避免分解代谢物阻遏，还具有诱导作用。为了降低培养基的就度，杀菌时往往添加α—淀粉酶液化，在液化过程中生成的葡萄糖，仍有造成阻遏的可能，因此将碳源采取流加法加入，是促进产酶的好办法。

(2)氮源 福本以淀粉为碳源，培养液化淀粉芽胞杆菌时，白蛋白、酪蛋白，大豆饼碱水抽提液、聚蛋白胨为较优氮源。玉米浆与其他蛋白质并用时也是良好氮源。以酪蛋白的酸或碱水解物作氮源时，产酶不及酪蛋白本身。各种氨基酸与酪蛋白的酶水解物有利于。—淀粉酶的生成，谷氨酸促进黑曲霉α—淀粉酶的生成。

(3)碳氮比 黑曲霉NRRL 330生物合成α—淀粉酶与糖化酶时，碳氮比与产酶量之间并

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