纳豆杆菌液体发酵 条件优化的研究

纳豆杆菌液体发酵 条件优化的研究

纳豆杆菌液体发酵 条件优化的研究Study on the optimization of submerged fermentation of bacillus natto 答辩人：李曙怀 指导老师：李文亮

纳豆杆菌液体发酵 条件优化的研究

纳豆菌液体发酵条件研究的意义纳豆中含有丰富的纳豆激酶, 纳豆中含有丰富的纳豆激酶,其具有高效的 溶栓作用,很好的稳定性, 溶栓作用,很好的稳定性,疗效不会受人体的 胃肠等特殊环境影响, 胃肠等特殊环境影响,纳豆激酶在人体内的 半衰期较长,无需大量服药, 半衰期较长,无需大量服药,由于其特殊的溶 栓机理, 栓机理,病人服用后不会引发体内出血现象。 纳豆激酶生产成本较低,安全性好, 纳豆激酶生产成本较低,安全性好,具有开发 为新一代溶栓药物的潜力。目前生产纳豆 激酶大部分是通过液体发酵而来，因此本 次实验具有重要意义。

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主要内容本实验是从一株实验室分离保存的 具有溶血栓活性的纳豆菌出发，在 同组同学实验得出的最佳产酶条件 的基础上，对发酵温度、ph、装液 的基础上，对发酵温度、ph、装液 量、接种量进行优化研究，为工艺 化生产建立科学的依据。

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细胞干重的分析方法发酵过程中细胞干重的测定: 发酵过程中细胞干重的测定:主要使用比浊法。 取0.5m1发酵液，用蒸馏水稀释20倍，γ=660nm 0.5m1发酵液，用蒸馏水稀释20倍，γ=660nm 处，测定细胞悬浮液的吸光度OD660。细菌离 处，测定细胞悬浮液的吸光度OD660。细菌离 心后，称其干重，作出干重与OD660的关系曲 心后，称其干重，作出干重与OD660的关系曲 线，结果如下图

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细胞干重与菌悬液OD660的关系 细胞干重与菌悬液OD660的关系细胞干重与菌悬液OD660的关系 7 6 细胞干重(g/L) g/L) 5 4 3 2 1 0 -1 0 0.05 0.1 0.15 0.2 菌悬液OD660 0.25 0.3 0.35 0.4 y = 15.739x - 0.2448 2 R = 0.9837

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温度的优化本试验共设置了30℃ 35℃ 40℃ 本试验共设置了30℃、35℃、40℃、 45℃ 45℃四个温度，观察温度对细菌生 长及产酶的影响。

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不同温度的生长曲线0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 10 20 30 40 时间(h) 50 60 70 30度 35度 40度 45度 OD660

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不同温度下NK酶的产量 不同温度下NK酶的产量800 NK 酶活性 (U/m L ) 700 600 500 400 35℃ 300 40℃ 200 45℃ 100 0 1 2 3 时间( 时间 ( da y ) 4 5 30℃

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综上所述，细菌在40℃ 综上所述，细菌在40℃时生长最为 迅速，且可获得最大细胞量，但是 产酶则以35℃为最佳，而35℃ 产酶则以35℃为最佳，而35℃时的 生长略低于40℃,因此选择35℃ 生长略低于40℃,因此选择35℃作 为发酵温度比较合适。

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pH的优化 pH的优化试验检测了Ph6、pH7、pH8、pH9、 试验检测了Ph6、pH7、pH8、pH9、 Ph10五个梯度下细胞的生长和产酶 Ph10五个梯度下细胞的生长和产酶 情况。生长是测定48h时OD660,

情况。生长是测定48h时OD660, 48h 产酶则以第四天的产酶进行比较。

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pH对生长的影响 pH对生长的影响

0.75

OD660

0.65

0.55

0.45 6 7 8 PH 9 10

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pH对产酶的影响 pH对产酶的影响

酶活性( NK 酶活性 ( U/m L )

600 500 400 300 200 100 0 6 7 8 PH 9 10

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综合以上试验结果得出，当pH偏 综合以上试验结果得出，当pH偏 碱性时利于细胞生长，但不利于产 物的合成，而pH值偏酸性，既不 物的合成，而pH值偏酸性，既不 利于菌体生长，也不利于产物合成; 利于菌体生长，也不利于产物合成; 因此选择pH为 因此选择pH为7时较为合适。

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装液量的优化本试验在转速一定的情况下，在 100ml三角瓶中分别加入10ml、 100ml三角瓶中分别加入10ml、 20ml、30ml、40ml培养基，在培养 20ml、30ml、40ml培养基，在培养 48h后测定其OD660,在培养96h其 48h后测定其OD660,在培养96h其 发酵产酶情况。

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随着装液量的上升，无论是细胞量还 是产酶量都呈下降趋势。从菌种鉴定 情况知道，该试验用菌是好氧菌，溶 氧的升高有利于细菌的生长和产物合 成。10mL虽然利于细菌生长和产酶， 成。10mL虽然利于细菌生长和产酶， 但装液量少，培养基中水分挥发快， 对总的产酶量不利。因而进一步比较 了10ml与20ml装液量时的生长发酵曲 10ml与20ml装液量时的生长发酵曲 线。

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不同装液量的生长曲线

0.7 0.6 OD660 0.5 0.4 10mL/100mL 0.3 0.2 0.1 0 12 24 36 48 时间( 时间 ( h ) 20mL/100mL

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不同装液量的产酶量

酶活性( NK 酶活性 ( U/m L )

800 600 400 200 0 1 3 时间( 时间 ( da y ) 2 4 10mL/100mL 20mL/100mL

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由此得出，10ml装液量有利于细菌生长 由此得出，10ml装液量有利于细菌生长 和产酶，但由于培养基量少，水分更 易挥发，因此可能会使细菌更早进入 衰亡期，所以从比酶活来看，其比酶 活反而略低于20ml装液量。同时到发酵 活反而略低于20ml装液量。同时到发酵 结束时，10ml装液量往往剩余不足5ml。 结束时，10ml装液量往往剩余不足5ml。 故而不利于产酶总量的增加。综合以 上种种利弊，仍选择20ml装液量。 上种种利弊，仍选择20ml装液量。

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接种量的优化本试验在一定量的培养基中 (20ml/100ml)分别接入1%、2%、 20ml/100ml)分别接入1%、2%、 3%、4%的种子培养基，在18h时测 3%、4%的种子培养基，在18h时测 18h 定培养基的OD660,而在96h测其 定培养基的OD660,而在96h测其 NK酶活性。 NK酶活性。

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不同接种量对生长的影响

0.7 OD660

0.65

0.6 1 2 接种量( 接种量 ( % ) 3 4

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不同接种量对产酶的影响

酶活性( NK 酶活性 ( U/m L )

600 500 400 300 200 1 2 3 接种量( 接种量 ( % ) 4

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/4251.html