实时荧光聚合酶链反应技术与第2代杂交捕获法检测高危亚型人乳头瘤病毒的比较

2802重庆医学2008年12月第37卷第24期

#论 著#

实时荧光聚合酶链反应技术与第2代杂交捕获法检测

*

高危亚型人乳头瘤病毒的比较

李 泉1,祖洪勇1,杨清平1,旷 英2,孟小容1,张传碧1,张晓芹1

(1.重庆市长寿区人民医院检验科 401220;2.重庆市长寿区妇幼保健院 401220)

摘 要:目的 比较实时荧光聚合酶链反应技术(实时PCR)检测人乳头瘤病毒(HPV)16、18型与第二代杂交捕获法(HC-Ò)检测13种HPV高危亚型。方法 采用实时PCR与HC-Ò分别检测宫颈脱落细胞标本中的HPV16、18型和13种HPV高危亚型,并进行测序分析。结果 HPV16、18型实时PCR总的检出率为24%,13种HPV高危亚型HC-Ò总的检出率为46.6%;高度鳞状上皮细胞内病变(HSIL)组实时PCR和HC-Ò的检出率均较低度鳞状上皮细胞内病变(LSIL)组要高,分别为54%与21%、84.3%与65.6%。HPV16、18型在HPV高危亚型中的总检出率为51%。有2例宫颈炎组标本HC-Ò检测阴性而实时PCR检测阳性,测序结果与实时PCR一致。结论 实时PCR法检测HPV16、18较HC-Ò灵敏度高,但检测的HPV亚型少,相比之下HC-Ò更适合于临床上HPV高危亚型的筛查检测。

关键词:实时荧光聚合酶链反应;第2代杂交捕获法;人乳头瘤病毒

中图分类号:文献标识码:A文章编号:1671-8348(2008)24-2802-03

Applicationofrea-ltimepolymerasechainreactionandhybridcaptureÒinhigh-riskhumanpapillomavirusdetection

LIQuan1,ZHUHong-yong1,YANGQing-ping1,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,ChangshouPeoplecshospital,Chongqing401220,China)

Abstract:Objective Tocomparerea-ltimepolymerasechainreaction(rea-ltimePCR)withhybridcaptureÒ(HC-Ò)forde-tectionofgenotype16,18and13high-riskgenotypesofhumanpapillomavirus(HPV).Methods Rea-ltimePCRandHC-Òwere

usedtodetectgenotype16,18and13genotypesofhigh-riskHPVrespectively.TheresultswereconfirmedwithDNAsequencing.Results Thetotaldetectionrateofrea-ltimePCRofgenotypes16,18andHC-Òof13HPVhigh-riskgenotypeswas24%and46.6%respectively.Thedetectionratesofthetwomethodsforhigh-gradesquamousintraepitheliallesion(HSIL)groupwereboth

higherthanthatoflow-gradesquamousintraepitheliallesion(LSIL),whichwas54%vs21%,84.3%vs65.6%.Theoverallde-tectionrateofHPVgenotype16,18inthe13genotypeswas51%.AndDNAsequencingsuggestedthatthetwocervicitissamplesresultswerethesamewithrea-ltimePCRresults,whichwereHPVpositive,notnegative.Conclusion Rea-ltimePCRismoresen-sitivemethodfordetectionofHPV16,18genotypesthanHC-Ò,butthedetectedquantityofgenotypesisfew.HC-Òismoresuit-abletodetectionofhigh-risktypeHPVinfectionincervix.

Keywords:ra-ltimePCR;HC-Ò;humanpapillomavirus 研究证实,持续高危型人乳头状瘤病毒(humanpapilloma-virus,HPV)感染是导致宫颈癌的主要原因,宫颈癌患者中最常见的HPV高危亚型为16、18型[1~5]。高危型HPV感染的

检测对于预防和早期发现宫颈癌有非常重要的意义。杂交捕获2代方法(HC-Ò)是目前唯一被美国食品药品监督管理局(FDA)批准的HPV检测方法,它能同时检测13种HPV高危亚型[6]。实时荧光聚合酶链反应技术(PCR)是近年来发展起来的一种新的核酸检测技术,该技术检测HPVDNA操作方便,在扩增时结合了特异探针的杂交,提高了实验的敏感性和特异性。本文应用实时PCR和HC-Ò2种方法分别检测223例妇女生殖道宫颈脱落细胞标本中的HPV16、18型和13种HPV高危亚型,对检测结果进行测序验证,分析两者的区别及不同病变程度标本的HPV高危亚型的检出率。1 材料与方法

1.1 标本来源 2007年5月至2008年9月重庆市长寿区人民医院检验科宫颈脱落细胞标本223例,检查者按组织病理分类,分为宫颈炎组102例、湿疣组38例、低度鳞状上皮细胞内病变(low-gradesquamousintraepitheliallesion,LSIL)组32例、高度鳞状上皮细胞内病变(high-gradesquamousintraep-i

theliallesion,HSIL)组51例。用HC-Ò宫颈细胞收集保存系

统采集并保存宫颈细胞标本1份,同时留取实时PCR检测标本。标本及时送检,实验室按常规预处理样本后-20e保存待检。标本采集均经研究对象本人同意。1.2 试剂与仪器 HPV16、18荧光PCR检测试剂盒由复星诊断提供;实时荧光定量PCR仪为Line-GeneFQD-33A型荧光定量PCR检测系统;基因杂交信号扩大系统HC-Ò一套、HPVDNA试剂盒、子宫颈采样器(含保存液)、微孔板封面胶膜、圆底96孔酶标板等均由美国Digene公司提供;测序仪为ABI3100。

1.3 实时PCR检测 实时PCR检测HPV16、18型,操作步骤按试剂盒说明书进行。过程包括,(1)样品DNA提取。(2)反应液配制:1份标本分2个反应管分别检测HPV16型和18型。(3)PCR扩增与荧光检测:扩增程序为50e反应2min,经94e变性2min进入循环,循环温度及时间为93e,20s;50e,90s,共40个循环,50e时检测荧光。(4)结果分析判断。1.4 HC-Ò检测 HC-Ò可检测16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种HPV高危亚型,操作步骤按试剂盒说明书进行。具体步骤为,(1)样本DNA双链被释放并分解

:(7。

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为核苷酸单链;(2)DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交体;(3)特异性抗体将RNA-DNA杂交体固定在微孔壁上;(4)结合有碱性磷酸酶的多个第2抗体与RNA-DNA杂交体结合,放大信号;(5)碱性磷酸酶使酶底物发光,判读光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量,从而确定RNA-DNA杂交体的含量;(6)结果判断:HPV负荷量大于或等于1.0pg/mL,判断HPV阳性。

1.5 测序 DNA提取:同HPV16、18荧光PCR检测试剂盒。PCR扩增:正向引物为5c-TTTGTTACTGTGGTAGATAC-3c,反向引物为5c-GAAAAATAAACTGTAAATCA-3c,扩增

[7]

片断大小150bp。反应条件:94e预变性3min;然后94e1min,40e1min,72e2min,共40个循环,最后在72e延伸5min。PCR结束电泳鉴定后送去测序。

2 结 果

2.1 宫颈标本的HPV检测结果 223例宫颈脱落细胞标本的HPV高危亚型的检测结果见表1,实时PCR法较HC-Ò法总的检出率低,分别为24%(54/223)和46.6%(104/223)。各组标本HPV检测结果中,实时PCR的检出率均较HC-Ò法低。另外,HSIL组两种方法HPV高危亚型的检出率均较LSIL组高,分别为54%与21%、84.3%与65.6%。

表1 实时PCR和HC-Ò检测结果

阳性标本1n(%)2

组别宫颈炎湿疣LSILHSIL总计

n

实时PCR

102383251223

6(5)13(34)7(21)28(54)54(24)

HC-Ò10(9.8)30(78.9)21(65.6)43(84.3)104(46.6)

2803

别为HPV16型和HPV18型,与实时PCR法的检测结果一

致。HC-Ò阳性/实时PCR阴性的15例标本中含HPV6型2例、31型2例、33型5例、35型3例、52型1例、58型2例。图1、2分别显示HPV16、18型的测序结果。

表3 实时PCR和HC-Ò检测结果比较

实时PCR检测结果

组别

n

阴性

HC2阴性

宫颈炎湿疣LSILHSIL合计

102383251223

908118117

HC2阳性

617141552

阳性

HC2阴性

20002

HC2阳性

41372852

图1 HPV16型

2.2 HPV16、18型与HC-Ò检测结果比较 HC-Ò阳性/实

时PCR阴性的标本为52例,HC-Ò阴性/实时PCR阴性的标本为117例。另有2例标本HC-Ò检测为阴性而实时PCR阳性,实时PCR法检测该2例标本分别为HPV16型和18型。以HC-Ò法为准,HPV16、18型在HPV高危亚型中的总检出率为51%(54/104),其中,HPV16型、18型和HPV16/18混合感染的比例分别为25%(26/104)、16%(17/104)、10%(11/104)。

表2 HPV16、18与HC-Ò检测结果比较

实时PCR结果

HC-Ò结果阴性阳性总计

阴性16型阳性18型阳性11752169

12526

11617

16、18型阳性

01111

总计119104223

图2 HPV18型

3 讨 论

HPV感染是宫颈癌的主要致病因素,99.7%宫颈癌患者存在HPV感染。大量研究证实,持续高危型HPV感染是导致宫颈高度病变进展为宫颈癌的主要原因,尤其是HPV16型和18型感染危险性更高。高危型HPV感染的检测对于预防和早期发现宫颈癌有非常重要的意义。HC-Ò是美国FDA认可的用于宫颈癌筛查的HPV检测方法,能够检测到HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型共13种HPV高危基因型,但不能确定HPV亚型。本研究中所用的实时PCR法只能检测到HPV16型和18型2个亚型,并能确定是16型还是18型。理论上,实时PCR检测为阳性的标本HC-Ò也检测为阳性,HC-Ò检测为阴性的标本实时PCR检测为阴性。本研究结果基本与上相符,实时PCR法无论是总的HPV检出率还是不同组别标本的检出率均较HC-Ò检出率低。另外,两种方法HSIL组的检出率均较LSIL组要高,分别为54%与21%、84.3%与65.6%。,表明随着宫颈病变程度的加重,HPV感染的阳性率升高,与其他学者的研究结论一致[8]。

以HC-Ò法为准,HPV16、18型在HPV高危亚型中的总检出率为51%(54/104),其中,HPV16型、18型和HPV16/18混合感染的比例分别为25%(26/104)、16%(17/104)、10%(11/104)。宫颈炎组的2例HC-Ò检测为阴性,而实时PCR检测分别为HPV16型和18型的标本,经测序验证与实时

2.3 不同组实时PCR和HC-Ò检测结果比较 223例标本

中,湿疣组、LSIL组、HSIL组标本HC-Ò法检测为阴性的实时PCR法均检测为阴性,实时PCR法检测为阳性的标本HC-Ò法均检测为阳性。只有在宫颈炎组有2例标本,实时PCR法检测为阳性而HC-Ò法检测为阴性。

2.4 宫颈标本的测序结果 分别对2例实时PCR阳性/HC-Ò阴性和15例HC-Ò阳性/实时PCR阴性的标本进行测序验

H

2804

PCR结果一致,推测与宫颈炎组标本中HPV病毒含量较低、实时PCR法对低浓度DNA的检测效果较好有关。另有2例HC-Ò检测为阳性的标本,测序结果为HPV6型,6型是典型的低危亚型,不在HC-Ò标本的13种高危亚型的检测范围之内,提示HC-Ò存在一定比例的非特异性,与HPV低危亚型存在交叉反应。以上结果与国外的研究基本一致[9~11]。综上所述,本研究中实时PCR法较HC-Ò灵敏度高,能检测HPV高危亚型中最主要的16型和18型2种宫颈癌致病亚型,并且能确定具体的基因型,但较HC-Ò法检测的HPV亚型少,临床上用于宫颈癌筛查有局限性,如果能够同时检测更多的高危亚型,将更适合于临床上HPV高危亚型的筛查检测。参考文献:[1][2]

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(收稿日期:2008-05-02)

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步检测缺氧复氧前后NF-JB活性变化,同时观察抗凋亡基因bc-l2表达变化,以探讨EPO预处理心肌抗凋亡保护作用的NF-JB信号机制。结果发现EPO预处理在培养心肌细胞缺氧复氧损伤中具有显著抗凋亡效应,预处理过程中同时加入PDTC,这一作用消失,表明EPO预处理在心肌细胞中抗凋亡效应可能与预处理过程中NF-JB活化有关。进一步研究发现EPO预处理使心肌细胞NF-JB活化及上调bc-l2mRNA表达,而加入PDTC抑制了NF-JB活化,同时抑制了EPO诱导的bc-l2mRNA表达上调,缺氧复氧后各组心肌细胞NF-JB显著活化,EPO组NF-JB活性低于其余各组,而其bc-l2mRNA表达水平仍显著高于其余各组,这一结果提示EPO预处理使缺氧复氧前后心肌细胞bc-l2基因表达上调,且此作用与预处理过程中NF-JB活化有关。以往研究已发现NF-JB活化与心肌缺血缺氧预适应保护作用有关,预适应过程中抑制NF-JB活化其保护作用显著减弱或消失,NF-JB提前活化后可上调多种抗凋亡基因如bc-l2、bc-lxl、XIAP、CIAP等的表达[7],产生抗凋亡效应。本研究发现EPO预处理使心肌细胞NF-JB活化,

进而上调抗凋亡基因bc-l2表达,这可能是EPO预处理在心肌细胞损伤中抗凋亡保护作用信号通路之一,对EPO心肌保护效应机制的研究及阐明,有助于其在临床上的进一步应用研究。参考文献:[1]

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(收稿日期:2008-05-30 修回日期:2008-07-08)

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/41z1.html