Waters应用现代固相提取技术开发样品前处理方法2007

应用现代固相提取技术开发样品前处理方法通向更纯净、快速、简单的样品前处理的捷径

Waters化学品部金琦芸 2007 8广州

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概要 样品前处理回顾—常规样品前处理技术及其局限性—固相萃取技术(SPE)基本概念—从硅胶基材到聚合物基材—从纯反相模式SPE到复合模式SPE—概念提出与实验验证————临床分析环境分析中药分析食品安全分析

现代固相萃取技术的发展趋势及其原由 Oasis® 2x4固相萃取技术—走向更纯净、更简易的样品前处理固相萃取技术在各行各业的应用实例

结论

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今日分析实验室面临的挑战以有限的预算和仪器、人力应付更多的样品，更复杂的样品基质和更低的检测限… 医药工业—新型药物往往药效更高(使用剂量更低):体液中药物浓度趋向更低—药物研发中所涉及的样品分析量极为庞大，如临床前期的ADME-Tox研究、药物剂型研究和临床试验阶段的生物利用度(bioavailability)、生物等效性 (bioequivalence)等测试

食品安全分析—国际组织(如欧盟等)常将已禁用或零忍受度的污染物、非法添加物的最低检测限定为0.1ppb—动植物组织样品基质中的内源性物质(如脂肪、蛋白、色素、盐份等等)常对目标物的分离与检测构成严重干扰

环境分析—优先控制污染物的名单越来越长，检测限要求越来越低(例欧盟对饮用水中农药残留的强制标准规定总农药残留水平不得超过0.5ppb,而单个农药的残留不得超过 0.1ppb)—潜在干扰物:任何在环境中存在的物质!

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为何要进行样品前处理?去除干扰物，以便取得：––––更好的分离效果更可靠的分析结果更长的色谱柱寿命更少的系统故障

富集痕量样品，以便取得：–更高的检测灵敏度

使得样品与采用的分离与检测技术更匹配–溶剂强度的匹配–液质联机分析时消除离子抑制效应

样品前处理归根结底是要提高分析工作的效率–在更短的时间分析更多的样品–减小对系统维修保养、人员的需求

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传统的样品前处理方式液液萃取 (LLE)根据分析物在互不相溶的两相中的溶解度差异来将分析物从一相提取至另一相中。装置简单操作容易常被认定为成本低廉费时费力常因乳化效益使相间分层不彻底，使得重复样的分析结果存在显著偏差(常在10%~20%之间)若需萃取的样品体积大(如环境分析中),则可能消耗大量的有机溶剂。由此可能在购买、储藏、处置溶剂时花费庞大*。有机水

注:大量储存、使用和处置溶剂可对操作者的长期健康产生负面影

响并可带来火灾隐患。

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传统的样品前处理方式蛋白质沉淀法 (PPT)在血清、血浆或尿样中加入有机溶剂，使 1-吸取200µL血浆样品中的蛋白质沉淀，然后经离心去除简单快速可被自动化，适用于高通量分析若检测限要求不高时较适用属快速但粗糙的净化技术，仅可去除约90-95%的蛋白质，而基质中的高盐份和其他内源性干扰物如磷脂等完全未被去除(此为 LC/MS分析时遭遇离子抑制的根源!)分析柱寿命较短，LC/MS系统常需停机进行离子源清洗导致样品稀释,不适合用于超痕量分析场合进样前可能需要进行溶剂蒸发以获得足够的灵敏度(若无内标，分析重现性不佳)©2007 Waters Corporation 6

2-加入400-600µl乙 3-高速混合 4-离心取上清液 5-以水稀释后进样

固相萃取技术 (SPE)先进的样品前处理方法依据目标化合物在固定相和流动相间分配系数的不同将其从液相提取至固定相中(本质上为色谱分离方法)可同时取得对样品的净化与富集效果，彻底去除干扰物并浓缩样品分析结果呈高度可靠性使得检测灵敏度和选择性大大提高明显延长色谱柱寿命，减小系统维修的频度样品制备快速、涉及人工少、溶剂用量少分析结果的精密度提高(偏差常<5%)多样化的产品设计迎合不同样品通量要求

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梨的色谱分析：不同提取过程的结果比较

乙腈提取未净化

乙腈提取用水稀释 Oasis® HLB提取乙腈提取用水稀释 Oasis® HLB提取用Sep-Pak®氨基小柱净化© 1999 Waters Corp.©2007 Waters Corporation 8

固相提取技术(SPE)小柱: Cartridge

Plus

Classic

Light

Vac

固相提取技术 (SPE)

Vac RC

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常见固相提取小柱的构造

柱体色谱柱床 (吸附剂)过滤膜/筛板

插口/出液口©2007 Waters Corporation 10

固相提取技术

Solid Phase Extraction (SPE)

两相 -液相与固相—容易分离—多种吸附剂可供选择 o反相-最常用！ o正相 o离子交换 o具有高选择性的新型吸附剂—溶剂消耗少—与液液提取相比—减少人力与时间—容易自动化

液相色谱基础

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液相色谱如何实现分离

固相提取技术的色谱基础

固定相被测物

流动相

B A

被测物

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如何在反相色谱条件下获得保留？

弱极性—非极性

固定相 (吸附剂)

弱极性—非极性

水溶性 --极性

流动相极性

被测物A

C18 - Silica Oasis HLB

被测物B

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HPLC与SPE之区别

HPLC颗粒直径柱床效率柱外体积柱长塔板数 (N)~5µm high low 5-30 cm~10,000

SPE40-80µm low high~1 cm< 50

Bottom line: HPLC can separate similar compounds. S

PE requires a significant selectivity difference between compounds for separation. Compounds not well resolved by HPLC cannot be separated by SPE with a similar retention mechanism.©2007 Waters Corporation 14

分离效率比较 - HPLC与SPE

1

Normalized concentration

0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10 15 20

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10 15 20

Elution volume (mL)©2007 Waters Corporation 15

固相提取技术的策略 洗脱干扰物质，保留目标组分—需要干扰物质K 0—需要目标组分K值较大

洗脱感兴趣的组分，保留干扰物质—需要目标组分K 0—需要干扰物质K值较大

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SPE操作如何进行?样品溶于弱溶剂中淋洗强度增加方向

上样

清洗

洗脱

丢弃

吸附剂柱床 (30-60um)

无保留物质

弱保留物质

适度保留物质

强保留物质©2007 Waters Corporation 17

SPE技术对流速的一般要求5 -10 mL/min 0.5 - 5 mL/min -液流不能成线 1 - 5 mL/min 0.5 - 5 mL/min-液流不能成线

活化及平衡 上样 清洗 洗脱

与SPE产品的规格及色谱类型有关

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SPE产品常见形式萃取小柱式:

小柱体积 1~35ml,吸附剂重量 10mg~6g 为中等数量样品设计 在食品安全、环境分析和学术研究等领域较流行 96-孔板形式: (uElution plate,即超微淋出板) 在需要应付大量样品时(如药动药代研究、生物等效性测试中最为流行) uElution plate(超微淋出板)专为高灵敏度分析所设计在线SPE净化柱:

吸附剂重量: 5~60mg (标准设计), 2mg

提供柱芯式产品(需Sentry Guard套件)和标准接口净化柱 由切换阀和系统软件控制，无需人工操作 初始成本稍高

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/3yxi.html